הדמיה דגימות ביולוגיות עם מיקרוסקופיה אופטית וקונפוקל

מיקרוסקופיה היא שיטה שנמצאת בשימוש נרחב להדמיית המבנה המפורט של דגימות. מיקרוסקופים אופטיים, הממקדים את האור דרך סדרה של עדשות כדי להגדיל דגימות, נמצאים בשימוש כבר מאות שנים, כאשר המיקרוסקופ המורכב הראשון הופיע במאה ה-17. במהלך אותה תקופה, אנטוני ואן לוונהוק היה הראשון שצפה בחיידקים, שמרים, כדוריות דם אדומות ומחזור בכלי דם נימיים, תרם תרומות מדעיות משמעותיות וסלל את הדרך להתקדמות מיקרוסקופית.

מיקרוסקופים אופטיים נמצאים בשימוש נרחב כיום במחקר ובמסגרות קליניות לאבחון רפואי. עם זאת, ב-60 השנים האחרונות הופיעה מיקרוסקופיה קונפוקלית המאירה את הדגימה דרך חור סיכה כדי להגביר את הרזולוציה האופטית והניגודיות.

סרטון זה ימחיש את עקרונות הפעולה של מיקרוסקופיה אופטית וקונפוקלית, ידגים כיצד מנתחים תמונות ברזולוציה גבוהה וידון במספר יישומים של מיקרוסקופיה בתחום ההנדסה הביו-רפואית.

נתחיל בדיון ביסודות המיקרוסקופיה הקונפוקלית. מיקרוסקופיה אופטית מבוססת על העיקרון של מיקוד האור על דגימה כדי לדמות את המבנה המפורט שלה. מיקרוסקופ מורכב משני רכיבי הגדלה; העדשה האובייקטיבית, הממקדת תמונה אמיתית של אובייקט, והעינית, הממקדת תמונה וירטואלית מוגדלת לפני שהיא נקלטת על ידי העין. ההגדלה הכוללת מושגת על ידי הכפלת ההגדלות של שתי העדשות הללו.

מיקוד האור נותן מישור מיקוד מוגדר שבו ההגדלה ואור המנורה נפגשים כולם באותה נקודה, מה שנותן את הרזולוציה הטובה ביותר בתמונה. כאשר מחוץ למישור המוקד, שטח התאורה גדול יותר וקרני אור מפריעות מחלקים אחרים של הדגימה, מה שגורם לתמונה להיות מטושטשת. כאשר מיקרוסקופי אור מאירים ומצלמים את כל הדגימה הנראית לעין, מיקרוסקופ קונפוקלי משתמש בחור סיכה בין שלב הדגימה לגלאי כך שרק קרן אור קטנה ממוקדת בעומק צר אחד בכל פעם.

כתוצאה מכך, האזור הגלוי היחיד של הדגימה הוא נקודת המיקוד, המספקת תמונה ברזולוציה טובה. עם זאת, ברזולוציה גבוהה יותר, רק חלק קטן מהדגימה הזו מצולם בכל פעם. על ידי הזזת הדגימה במישור XY, ניתן לבצע סריקת רסטר של פני השטח שלה. עבור כל נקודה בסריקה, המיקוד ממוטב על ידי התאמת גובה Z כדי לגשת למישורי מוקד שונים. הדבר מבטיח רזולוציה מקסימלית נקודה אחר נקודה של דגימת התמונה.

עכשיו בואו נשתמש בעקרונות אלה של מיקרוסקופיה ורזולוציית תמונה כדי לדמות מוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ואופטי.

לאחר שסקרנו את העקרונות העיקריים של המיקרוסקופיה, בואו נבצע כעת מדידה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. ראשית, הפעל את המיקרוסקופ בעמדת העבודה של המחשב. לאחר מכן טען את הדגימה על הבמה ומרכז אותה מתחת לעדשה. כעת פתח את תוכנת ההדמיה ובחר צור עבודה חדשה. עבור לעמודה טופוגרפיה ובחר בלחצן המסייע. בחר את ההגדלה הנמוכה ביותר, אשר עבור מיקרוסקופ זה, היא פי 2.5. לאחר מכן השתמש במניפולטור המיקרוסקופ התלת מימדי כדי להתאים את מיקום Z של הדגימה ולהביא את הדגימה למיקוד. לחץ על הכפתור בצד כך שיופיע אור כחול סביב הקצוות. זה מאפשר תנועת Z ומיקוד עדינים יותר. כעת צלמו תמונת סקירה כללית.

הגדל לאט את הגדלת העדשה והתאם את עוצמת האור והמיקוד כדי להשיג את ההגדלה הרצויה. השתמש במניפולטור התלת-ממדי בכיווני X ו-Y כדי לבחור תחומי עניין שונים בדגימה. לאחר צילום תמונה בהגדלה נמוכה, לחץ על הבא כדי לצלם נקודת התייחסות. השתמש/י בנקודת ההתייחסות של ברירת-המחדל, או ציין/י נקודת התייחסות חדשה בפינת הדגימה, ואז לחץ/י על ״הבא״. כעת שנה בהדרגה את המטרה לרזולוציה הרצויה עבור המדגם. עבור דגימה זו, נעשה שימוש במטרה של פי 20 כדי להמחיש את התאים ברקמת המוח של העכבר. וודאו שיש מקום להקטין את מרחק העבודה.

כדי להגדיר את המרחק לאיסוף פרוסות, עבור תחילה לדף הגדרת טווח המדידה והשתמש במניפולטור התלת מימד כדי להתאים סוף סוף את הדגימה בכיוון Z. לחץ על הגדר אחרון כאשר החלק העליון של הדגימה נמצא במוקד ולחץ על הגדר תחילה כאשר החלק התחתון של הדגימה נמצא במוקד. ודא שמספר הפרוסות המחושבות אינו עולה על 1,000, אחרת התוכנית תיכשל. ודא שאין פיקסלים אדומים, מה שמצביע על כך שעוצמת האור רוויה יתר על המידה.

לבסוף, לחץ על סיום כדי לצלם את תמונת הטומוגרפיה. כאשר תוכנת הטומוגרפיה נפתחת, בחר בכרטיסיית המחקרים כדי להציג את הנתונים בתלת מימד ולבצע מדידות דו-ממדיות ותלת-ממדיות.

עכשיו בואו נצלם תמונה באמצעות מיקרוסקופ אופטי דיגיטלי. ראשית, הפעל את המיקרוסקופ ופתח את תוכנת ההדמיה. לאחר מכן טען את הדגימה על הבמה ומרכז אותה מתחת לעדשה. כאשר תוכנת ההדמיה פתוחה, בחר עבודה מרשימת התבניות או בחר בדיקה בחינם. לאחר מכן, רכוש תמונת סקירה המציגה את כל הבמה. השתמש בבקר כדי לשנות את המיקוד ואת מיקום התמונה.

לאחר השלמת הרכישה, הנח מערכת קואורדינטות על התמונה. מערכת הקואורדינטות המוגדרת כברירת מחדל נמצאת באמצע השלב. לגמישות רבה יותר, ניתן לשנות את הקואורדינטות באופן ידני.

לאחר מכן תן שם לדוגמא ובחר בלחצן המצלמה. לחץ על הלחצן החי תוך כדי ניווט בדגימה והזז את המיקוד כלפי מטה עד שהדגימה תהיה בבירור במיקוד. במידת הצורך, השתמשו בלשונית התאורה והצמצם כדי לכוונן את התאורה. לאחר מכן רכוש תמונה של הדגימה.

השתמשו בכלים שמתחת לחלונית מיטוב התמונה, כגון הטיית העדשה, רמות התאורה בדגימה והבהירות והניגודיות בתמונה כדי למטב את התמונה לחדות הרצויה. כעת הקש על כלי העיפרון כדי לבצע מדידות. השתמש בכלי המרחק והשטח כדי למדוד את גודל התאים בדגימה.

לבסוף, עבור לכרטיסייה זרימת עבודה של תוצאות והגדר את פריסת הדוח. הקש על כפתור השמירה כדי לשמור את העבודה לניתוח נוסף.

כעת בואו ננתח את התמונות של מוח עכבר שצולמו במיקרוסקופים אופטיים קונפוקליים ודיגיטליים. התמונה הקונפוקלית בהגדלה של פי 50 היא ברזולוציה גבוהה ומספקת מיקוד עמוק עם רמות עומק משתנות של מידע.

במפה הטומוגרפית, גובהו של דגימה זו נע בין מיקרון אחד לתשעה מיקרון. ניתן לנתח עוד מאפיינים כגון המשרעת, פרופיל החספוס ופרמטרי העקומה. עם זאת, ניתן לדמות את כל השקופית של רקמת המוח החתוכה באמצעות מיקרוסקופ אופטי דיגיטלי.

התקרבות לקטע מציגה יותר פרטים על הדגימה אך ברזולוציה נמוכה בהרבה ממה שהתקבל במיקרוסקופ קונפוקלי. דגימה זו התקבלה בהגדלה של פי 300. תוכנה ייעודית מציעה כלים למדידת מידות חתך, כגון הקוטר, כמו גם לחישוב השטח הפנימי של החתך.

מיקרוסקופיה דיגיטלית, אופטית וקונפוקלית הם כלים סטנדרטיים המשמשים ביישומים ביו-רפואיים שונים. סריקת אופטלמוסקופיה בלייזר או SLO היא טכניקת הדמיה לא פולשנית הנמצאת בשימוש נרחב ברפואת עיניים קלינית לאבחון ומעקב אחר התפתחות מחלות רשתית.

SLO מייצר תמונות סטריאוסקופיות בניגודיות גבוהה המדמות את המיקרוגליה. המקרופאגים התושבים של הרשתית, המעורבים במספר מחלות רשתית. מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת גם בהדמיית תאים חיים, המאפשרת לחוקרים לדמיין את תפקוד התאים הביולוגיים המיקרוסקופיים בזמן אמת.

טכניקה זו משמשת לחקר נדידת תאים והתפשטות ודינמיקה של חלבונים, בין היתר. כאן, קולטנים טרנסממברניים וליזוזומים סומנו בצבעים פלואורסצנטיים והקו-לוקליזציה שלהם נותחה באמצעות הדמיית זמן-lapse כדי לחקור הפנמת קולטנים.

זה עתה צפיתם במבוא של JoVE למיקרוסקופיה דיגיטלית, אופטית וקונפוקלית. כעת עליך להבין את עקרונות המיקרוסקופיה ורזולוציית התמונה, כיצד להפעיל מיקרוסקופים אופטיים וקונפוקליים להדמיית דגימות ביולוגיות, ומספר יישומים של השימוש בהם בתחום ההנדסה הביו-רפואית.

תודה שצפית.