Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo: כונן ייצור

סרטון זה יעסוק בהרכבה של מערך מיקרו-דרייברים קל משקל עם 21 מיקרו-דרייברים מונחי-בורג הניתנים לכוונון עצמאי. כל מיקרו-דרייבר שולט במיקום ההקלטה של אלקטרודה אחת. המיקרו-דרייברים מורכבים על בסיס פלסטיק שתוכנן במחשב, המייצב אותם ביחס לגולגולת של בעל חיים נע ומרכז את האלקטרודות לתבנית צפופה שיכולה לעבור דרך קרניאוטומי קטן אל תוך המוח.

הבסיס תומך גם בלוח ממשק אלקטרודות לחיבור למכשירי ההקלטה, המאפשר חיבור וניתוק נוחים של בעל החיים בתחילתו ובסיומה של התנסות. קונוס פלסטיק המחובר לבסיס מגן על מניעי המיקרו ועל האלקטרודות מהסביבה בכלוב החולדה. שלום, אני פאיה פוסטמן מהמעבדה של מאט וילסון במכון PIKA ללמידה וזיכרון במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס.

היום נדגים בפניכם פרוטוקול לייצור של אחד ממערכי מיקרו-אלקטרודות אלו. במעבדה שלנו, אנו משתמשים במערכי מיקרו-אלקטרודות אלו כדי להקליט אוכלוסייה גדולה של נוירונים במוח של חולדות, למשל, מהקורטקס או מההיפוקמפוס. ראשית, נראה לכם כיצד תכננו את מערך המיקרו-אלקטרודות שלנו.

כעת נגש לסדנה, שבה סטיב וסטיוארט יראו לנו כיצד לעבד את חומרי הגלם וכיצד להרכיב אותם למכשיר פונקציונלי מלא. אז בואו נתחיל. בסיס הפלסטיק תוכנן באמצעות תוכנת תכנון ממוחשבת (CAD) ומיוצר בתהליך הדפסה תלת-ממדית זול.

אנו ממדלים גם את כל שאר הרכיבים של מערך המיקרו-מניעים. הדבר מאפשר לנו לשלוט בקפידה בגודל ובמשקל של המניע המוגמר. בחלקו העליון של הבסיס הפלסטי ישנן שתי טבעות של חורים המיועדות לקליטת המיקרו-מניעים הבודדים.

המודל התלת-ממדי נשלח למשרד שירותים שבונה את התכנון משרף הניתן לפתיחה בלייזר באמצעות סטריאו-ליתוגרפיה. תהליך זה אמור לארוך מספר ימים בלבד, והחלק המתקבל הוא קל משקל וניתן לשימוש חוזר. ברגע שהחלק מגיע ממשרד השירותים, עלינו להכינו לשימוש.

כעת נעבור לסדנה. תהליך ההדפסה בתלת-ממד אינו יכול להדפיס חורים קטנים באופן מהימן, לכן אנו מגדירים במודלים שלנו חורים בעוביי קטן יותר. לאחר מכן, נקדח ונפתח את החורים לגודל הנדרש בסדנה.

שלושה מקדחים בגדלים שונים משמשים להכנת הבסיס הפלסטי: מקדח מספר 61, מקדח מספר 65 ומקדח של 1.55 millimeter בטבעת החיצונית של הבסיס. השתמש במקדחה ידנית עם מקדח מספר 61 במהירות נמוכה מאוד כדי להכין את חורי ההובלה שבהם יוחדרו מאוחר יותר ברגי המיקרו-דרייב. לאחר מכן, הכן את החורים עבור צינורות התמיכה של המיקרו-דרייב בכניסה לבסיס על ידי קידוח חורים אלו באמצעות מקדח מספר 65.

בעזרת המקדח הגדול יותר בקוטר 1.55 millimeter, קדחו את החורים שישמשו לחיבור הבסיס ללוח ממשק האלקטרודות ולחרוט המגן. כדי להבטיח תנועה חלקה במניע המיקרוסקופי, הכניסו שרוול פלדת אל-חלד לתוך טבעת החורים הפנימית. יש להדק כל שרוול באמצעות פלייר עד שיהיה גובהו בקו אחד עם החלק העליון של הבסיס.

כעת יש להשריש הברגות בחורי המדריך של הברגים. השתמשו במוט הברגה ידני (pin vice) כדי להחזיק את המקדח להברגה והחילו חומר סיכוך יבש לפני ההברגה. יישרו את המקדח ואת הכל על ידי וידוא שהוא מקביל לצינור 23 gauge שאתם מכניסים באופן זמני לשרוול השכן.

יש להשריש הברגות בחורים המחזיקים את לוח הממשק ואת החרוט המגן. בצעו השחרגה ידנית לחורים אלו באותה הדרך. התכנון מבוסס הפלסטיק כולל פתיח להשחרגה עבור כל חור מוליך של בורג, כדי להבטיח שההברגות הראשוניות לא ייפגעו במהלך תהליך ההשחרגה.

לאחר שכל חורי הפיילוט השרשרו, ניתן להסיר בקלות את פותחי ההברגה באמצעות להב תער. האלקטרודות מודרכות לעבר אתר בודד בתחתית המערך באמצעות מספר צינורות הנחיה חשמליים.

ראשית, עלינו להכין את קנולת האיסוף שתחזיק את כל צינורות המוליכים החשמליים. קנולת האיסוף עשויה מחלק של צינור פלדת אל חלודה באורך 1.5 סנטימטר. קנולת האיסוף תקובע באמצעות דבק שיניים.

כדי לשפר את ההיצמדות, חספסו בזהירות את הצינור באמצעות גלגלת השחזה של Dremel, והחדירו קנולה זו לתחתית הבסיס הפלסטי. מקמו אותה כך ש-5 עד 7 מילימטרים מהקנולה יישארו מחוץ למערך ההנעה המיקרוסקופי. כדי להקל על ההשתלה הכירורגית, הצמידו את קנולת האיסוף לתחתית הבסיס הפלסטי.

בעת שימוש באקריליל דנטלי, יש להמתין להשלמת הפולימריזציה למשך 15 דקות לפחות. כעת, הכינו את צינורות ההנחיה על ידי חיתוך של 21 חתיכות פוליאמיד באמצעות סכין גילוח. התחילו שלב זה על ידי הזנת כל 21 צינורות ההנחיה אל תוך קנולת האיסוף בתחתית בסיס ההנעה.

פעולה זו תבטיח שכל המבחנות יהיינו מקבילות זו לזו. אם המבחנות בצרור רפויות מדי או הדוקות מדי, ניתן להתחיל עם מספר קטן יותר של מבחנות או להוסיף מבחנות נוספות לפי הצורך. כעת, הוציאו כל מבחנת מנחה אחת לאחר השנייה והשחילו אותה לאחד השרוולים בחלקו העליון של המכשיר.

העבירו את המבחנה דרך המרווח שבצד שמאל מאחורי צרור המבחנות. בדקו את מבחנות המוליך לאיתור קיפולים או כיפופים חדים והחליפו אותן במידת הצורך. כווננו את מיקומה של כל מבחנת מוליך כך שתבלוט ב-1 עד 2 מילימטרים מקצה השרוול העליון.

כעת הוסיפו טיפה קטנה של דבק sano acro lake דליל לתחתית קנולת האיסוף. היזהרו מאוד לא להניח לדבק לזרום אל תוך צינורות המוליכים. לאחר מכן, השתמשו בלהב תער חד כדי לחתוך את צרור הצינוריות העודפות בתחתית קנולת האיסוף.

יש לוודא תחת סטראוסקופ שהצינורות נגזרו בצורה נקייה והם בקו אחד עם הקנולה. כל אלקטרודה מונעת על ידי מיקרו-דרייב (micro drive) משלה, לכן עלינו להכין 21 מיקרו-דרייבים ולאחר מכן להכניסם לבסיס הפלסטיק. כל מיקרו-דרייב מורכב מבורג מותאם אישית ומצינור תמיכה חלול, המחוברים זה לזה.

באמצעות אקריליק דנטלי, האלקטרודה תעבור דרך צינור התמיכה. הבורג כולל חלק ללא הברגה עם שפה קטנה המוטמעת באקריליק הדנטלי ומאפשרת לבורג להסתובב בחופשיות באופן זה. כאשר הבורג מסובב לתוך הבסיס הפלסטי, הוא מקדם או מסוג אותו את האלקטרודה.

ראש הבורג מעוצב כחצי גליל. לפני שנוכל להכין את המיקרו-מניעים, עלינו להכין מברג לסבוב הבורגים המותאמים אישית שלנו. המברג המאומה שלנו מיוצר על ידי לקיחת בורג מותאם אישית ושחיקה מלאה של השפה המקיפה את ראש חצי הגליל.

הכנס את ראש הבורג לתוך צינור בכישור 15 באורך חמישה סנטימטרים עד שיהיה עטוף לחלוטין. כעת, מעך את הצינור סביב הברגות הבורג, כדי לקבע אותו בתוך הצינור ולמנוע ממנו להסתובב. חבר מלחציים קטנים (mini pin vice) שישמשו כידית, וקיבלת מברג.

המיקרו-דרייב (micro drive) מיוצר על ידי עיצוב אקריליק דנטלי מסביב לבורג ולצינור התמיכה. התבניות שבהן אנו משתמשים עשויות פלסטיק בהדפסת תלת-ממד, בדומה לבסיס הפלסטיק, וכוללות חורים בתחתית השומרים על יישור הבורג ומוט התמיכה בעת מזיגת האקריליק לתוך התבנית. ראשית, עלינו להכין את התבנית: יש לנקות את חור צינור התמיכה באמצעות מחט בכיול 23 gauge, לנקות את חור הבורג וליצור הברגות באמצעות פלס (tap).

זהו אותו הליך שבו השתמשנו זה עתה על הבסיס הפלסטי. כעת התבנית מוכנה לשימוש ליצירת מיקרו-דרייבים. גרו את התבנית עם חומר סיכה מבוסס טפלון כדי למנוע מהאקרילי הדנטלי להידבק לתבנית.

שחקו את שני עד שלושת המילימטרים העליונים של מוט תמיכה מפלדת אל-חלד בכיול 23 ובאורך 14 מילימטר באמצעות גלגל שחיפה, כדי שיעגן בחוזקה בעומק האקריליק. הכניסו את מוט התמיכה לחור הקטן יותר של התבנית, כך שחלקו העליון של המוט יהיה מעל חלקו העליון של הבאר. מרחו שכבה דקה של חומר סיכוך מבוסס Teflon על בורג והכניסו אותו לחור המהולל עד שההברגות יהיו ממש מתחת לתחתית הבאר.

כעת ערבבו מעט אקריליק דנטלי ושפכו אותו לתוך התבנית. ודאו שהחומר חודר לכל הפינות והסדקים. ניתן להשתמש במחט כדי להוציא בועות אוויר לאחר שהאקריליק התקשח.

ניתן להסיר את המיקרו-דרייב על ידי פתיחה של הבורג. בצעו בקרת איכות קפדנית. לא צריכים להיות סדקים או בועות באקריליק.

המוט והברגים צריכים להיות מקבילים ללא יכולת תנועה הצידה. הברגים צריכים להסתובב בצורה חלקה, אך ללא חופש; יש להשליך כל מיקרו-דרייב (micro drive) פגום מתוך החלקים שנעשה בהם שימוש חוזר. חזור על תהליך זה עד לקבלת 21 מיקרו-דרייבים תקינים.

אם לתבנית שלכם יש מספר בארות, תוכלו להכין את המיקרו-דרייברים והסדרות כדי לחסוך בזמן. יישרו בזהירות כל מיקרו-דרייבר עם זוג חורים בבסיס הפלסטיק. החליקו את צינור התמיכה של המיקרו-דרייבר מעל צינור המדריך מפולימר ותוך כדי הנחתו לתוך השרוול המתכתי, השתמשו במברג כדי להניע את בורג המיקרו-דרייבר קדימה.

שלב זה עלול להיות מורכב. יש להשגיח על מרכז הבסיס כדי לוודא שצינור המנחה אינו נתפס באבזם בעת הורדת המיקרו-דרייב. לאחר שכל המיקרו-דרייבים נמצאים במקומם והורדו במלואם, מטפטפים כמות קטנה של אקריליק למרכז הדרייב כדי לקבע את צרור צינורות המנחה במקומם.

המתינו 15 דקות לייבוש האקרילי. לאחר שהאקרילי התייבש, כדי להסיג כל מיקרו-מניע (micro drive) בכ-3 מילימטרים, ציירו סכמה של המיקרו-מניעים במבט מלמעלה והקציאו לכל מיקרו-מניע שם או מספר ייחודי. כעת, תוך התבוננות בסטריאוסקופ, הפכו את המניע למצב הפוך וצלמו את התחתית של קנולת האיסוף ושל צינורות ההנחיה.

הדפיסו את התמונה כדי שתוכל לשמש כנקודת ייחוס בשלבים הבאים. לאחר מכן, כאשר הכונן הפוך, הכניסו צינור נשא פוליאמיד צר לתוך כל צינור מוליך עד שיצא מהחלק העליון של מיקרו-כונן. רשמו על התמונה איזה צינור מוליך תואם לכל מיקרו-כונן.

צינור הנשיאה ישמש מאוחר יותר להגנה ולתמיכה בחוטי האלקטרודה העדינים. הוא עובר דרך המיקרו-דרייב. האריכו כל צינור נשיאה עד שיהיה במרחק של סנטימטר אחד מעל החלק העליון של צינור התמיכה של המיקרו-דרייב, ולאחר מכן הדביקו את צינור הנשיאה לצינור התמיכה באמצעות אפוקסי בעל זמן ייבוש של חמש דקות או דבק sano acro lake סמיך.

יש לנהוג בזהירות רבה בשלב זה. אם דבק יטפטף לדפנות הפנימיות של צינור התמיכה, הוא עלול להדביק את צינור התמיכה לצינור המוליך הנייח ולהרוס את המיקרו-דרייב (micro drive). זו הסיבה שאנו מרימים את המיקרו-דרייבים לפני הכנסת צינורות הנשיאה.

לאחר שכל צינורות הנשאיים הודבקו במקומם, הורד שוב את המיקרו-מניעים עד למקסימום וגזור את כל צינורות הנשאיים בקו אחת עם החלק התחתון של המניע באמצעות להב תער חדש. לאחר מכן, גזור את צינורות הנשאיים במרחק של מילימטר אחד עד שניים מעל החלק העליון של המיקרו-מניע באמצעות מספריים חדים. לבסוף, הנח את לוח ממשק האלקטרודה על בסיס המניע והרכבה באמצעות שני ברגים.

בשלב זה, מערך ההנעות מוכן להטענה באלקטרודות ובניסויים שלנו. אנו משתמשים בדרך כלל באלקטרודות מיקרו-חוטיות בעלות ארבעה ערוצים הנקראות tetros, אך ניתן להשתמש בכל סוג של אלקטרודה. ייצור של teros, אופן הטענתן לתוך מיקרו-הנעות והכנת מערך ההנעות להשתלה כירורגית מכוסים בסרטוני JoVE אחרים.

ניתן לעקוב אחר פרוטוקול זה באופן ישיר או להתאימו לצרכים שלכם. לדוגמה, חוקרים מסוימים יזדקקו לברגים ארוכים יותר כדי להקליט ממבנים מוחיים עמוקים יותר. אחרים עשויים לרצות לתכנן התקן הנעה המכוון ליותר ממיקום מוחי אחד.

ניתן להקטין את התכנון גם לשימוש בבעלי חיים קטנים יותר כמו עכברים עם התאמה קלה נוספת; ניתן להשתמש במניעי מיקרו ממונעים, המאפשרים כיוון מרחוק של מיקומי האלקטרודות. הראינו כעת כיצד לתכנן ולייצר מערך מניעי מיקרו שניתן להשתבץ בראשו של חולדה ומאפשר לנו להקליט אוכלוסיות גדולות של נוירונים בזמן שהחיה נעה באופן ממשי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשחיל בזהירות את החורים בבסיס הפלסטיק כדי שברגי מניעי המיקרו לא יחליקו.

בצעו בדיקת איכות קפדנית של המיקרו-דרייבים שהוכנו. ודאו שהבורג ופח הפריקה מקבילים ושהבורג מסתובב בצורה חלקה וללא חופש. היזהרו בעת שימוש בדבק או באקריליק דנטלי כדי לא לסתום בטעות את אחת מהצינוריות.

לבסוף, זכרו שכדי להשלים את מערך ה-MyDrive ולפני ביצוע הניתוח, יהיה עליכם לייצר tetros ומינון נמוך בתוך ה-drive. נושא זה מכוסה במאמר וידאו אחר של JoVE. וזהו הכל.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.