Name: Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo: Tetrode האסיפה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 19 s
Description: למד כיצד לייצר ולהתקין טטרודות למערך מיקרו-דרייב להקלטות אלקטרופיזיולוגיות כרוניות בעכברושים ערים. שיטה זו מאפשרת ניטור פעילות עצבית ארוך טווח במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות יוני ימאמוטו לעיצוב שלו ובנייה של מכשיר אוטומטי, ממונע מסלף tetrode המתואר בסרט. בנוסף, ברצוננו להודות לכל חברי בעבר ובהווה וילסון מעבדה על תרומתם כונן מיקרו והטכנולוגיה tetrode הפיתוח במעבדה.

1. המצאה של tetrodes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין בניית tetrode אחד על ידי קבלת 50 ס&quot;מ, polyimide מבודדים, Ni-chrome תיל עם ליבה בקוטר 12.5 מיקרון. מקפלים את החוט לשניים. הפעל את האצבעות לאורך צמד כדי לגרום להם להישאר ביחד. ודא זוג חוטים יש מגע טוב לאורך כל אורכו שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקפלים את הצמד שוב על ידי מחזיק את שני הקצוות יחד. ודא כי לולאה נוצר בצד אחד אינו מפותל. חותכים את ארבעת החוטים בצד הלא כרך כך ארבעה טיפים מיושרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשלב הבא, תצטרך קליפ תנין שונה, מכשיר מפנה ממונע, וכן פס אופקי מעל המכשיר מפנה. קליפ תנין הוא שונה על ידי הדבקת פס פלסטיק לבסיס של קליפ. איפה את הטיפים תיל חשופים, מהדק את ארבעת החוטים יחד עם קליפ תנין שונה. לתלות את הלולאה של חוטים על הבר אופקי. מניחים את קליפ תנין לשלב ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80 החל השעון מבחינת פיתולים פיתולים ואחריו 40 השעון מבחינת בניגוד צרור את החוט במהלך כשלוש דקות. פרמטרים אלה יכולים להיות מגוונים בהתאם לצרכים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי סיבוב tetrode הושלמה, הפתיל את החוטים יחד על ידי חימום משלוש זוויות שונות עם אקדח חום (420 ° C או 790 ° F), תוך שימוש בינוני נמוך לזרום. עבור כל זווית, להתחיל 1-2 ס&quot;מ מתחת שבו צרור חוט מתפצל, להפעיל את האקדח חום למעלה ולמטה במרחק של 2 ס&quot;מ מן החוטים כ -5 שניות. היזהר כמו טמפרטורות גבוהות לחלוטין להמיס את הבידוד להוביל קצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו החוטים יש התמזגו יחד, להסיר את tetrode מן המנגנון מתפתל בעדינות על ידי הרמת קליפ תנין כדי להקל על המתח tetrode, וחתך את tetrode ליד קליפ תנין. בקצה השני, לחתוך את הלולאה כך יש ארבעה גדילים לא מלוכדות של תיל באורך שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להפריד בין גדילים בודדים בחלק העליון על ידי כיפוף בעדינות את החוטים עם פינצטה היטה רך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tetrode מוכן כעת טוען לתוך מערך מיקרו הכונן. בצע 21-25 יותר tetrodes ולאחסן אותם בתוך קופסה אבק חינם עד שהגיע הזמן בתהליך הטעינה tetrode. </li></ol> 2. טעינת tetrodes וחוטי הקרקע לתוך מערך מיקרו הכונן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמשיך, תצטרך מערך שלם מיקרו הכונן. אם לא נבנה עוד אחד, להפנות את הווידאו &quot;מערך כונן מיקרו עבור כרוני ב-vivo הקלטה:. ייצור כונן&quot; בתוכנית העיצוב שלנו, tetrode תצורף בקצה אחד לחומרה מחבר, ולא יפעלו דרך polyimide צינור המוביל כונן המיקרו כזה טיפים אלקטרודה להאריך מתחת לבסיס של מערך כונן המיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, לבנות בעל הכונן יכול להיות מחובר ללוח מחבר בצד אחד, בצד השני, יכול להיות מהודק ידי panavise. בדוגמה זו, בעל הכונן מחבר הטחנה-max מודבק בקצה אחד של הידית X-ACTO סכין (איור 1 ג&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת tetrode עם פינצטה היטה רך באמצעות stereoscope, לדחוף את קצה tetrode לתוך polyimide צינור המוביל של אחד מיקרו כוננים. לחצו על tetrode לתוך הצינור עד חוטים בודדים קרובים אלקטרודה ללוח מחבר בראש מערך הכונן. היזהר לא שריטה או לכופף את החוטים, כמו זה יגרום tetrode להזין את המוח בזווית, ולא בניצב, ואת תחליש את שלמות tetrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להאכיל את הקצה השני של ארבעת החוטים לחורים שלהם בלוח אלקטרודה ממשק באמצעות פינצטה היטה רך. שוב, יש להימנע מסתלסל או לכופף את החוטים. עם כל ארבעת החוטים במקום, לדחוף את סיכות זהב לתוך החורים שלהם עם צבת כי יש הלסת התחתונה מקוצר. כאשר הפינים נדחפים לתוך החור, הם רצועת בידוד חוט וליצור חיבור חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעיון מאוחר יותר, לעקוב אחר מיפוי בין מיקרו כוננים עמדה פינים על הלוח ממשק אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך טעינה כולל של 18 tetrodes. שלושת הנותרים מיקרו כוננים במערך ישמש לבית אלקטרודות התייחסות. אלקטרודה כל התייחסות עשוי tetrode המשתמשת רק אחת מארבע קצות חוט מחוברים. כדי להצמיד את האלקטרודות הפניה, בצע את ההליך טוען לצרף אבל רק אחת מארבע אלקטרודות את הסיכה אלקטרודה בהתאמה התייחסות על הלוח מחבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם מתכננים רב אתר הקלטות, זה עשוי להיות כדאי לתכנן את החיבורים בין tetrodes ללוח מחבר מראש. זה אמור לצמצם את האפשרות של התאמת tetrode טועה במהלך הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טעינת tetrode הושלמה, לעשות שני חוטים הקרקע, אחד עבור החיה ואחד חרוט מגן. גזור אחד &quot;חוט ארוך פלדה מבודדים (טקסט: 0.005&quot; 6 קוטר) ולהסיר 3 מ&quot;מ של בידוד, באמצעות פינצטה מתכת, מקצה אחד של התיל. ואז לחתוך 4&quot;תיל פלדה מבודד ארוך (טקסט: 0.005 &#39;קוטר). הסרה של 3 מ&quot;מ של בידוד בקצה אחד 1 ס&quot;מ בקצה השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסלול חוט הקרקע &quot;6 דרך החור בצד של מערך מיקרו הכונן לכיוון הלוח ממשק. חבר את חוט חשוף הלוח ממשק אלקטרודה עם סיכת זהב ב חור באדמה המיועד. חוט זה יתחבר הגולגולת של החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרקע כביש 4 &quot;חוט תיל במקביל את הקרקע שהותקנו בעבר. חבר את הקצה הפשיטו 3 מ&quot;מ ללוח אלקטרודה ממשק משתמש סיכת זהב חור נוסף בשטח המיועד. חוט זה יהיה מאוחר להיות מחובר חרוט מגן, אשר ישמש כלוב פאראדיי קטן כדי להפחית את רעש טנדר. אנחנו סיים עכשיו חוטי חיבור יכולה להמשיך עם זיקוק tetrodes שלנו. </li></ol> 3. קביעת אורך tetrodes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המטרה שלנו בתהליך הזה היא לחתוך את כל tetrodes כך שהם מעט יותר לעומק את מבנה המוח היעד. בדוגמה שלנו, מיקרו הכוננים מיועדים נסיעה מקסימלית של 5-6 מ&quot;מ, מספיק כדי להגיע לאזורים רבים neocortical ההיפוקמפוס הגבי של חולדה בוגרת. ראשית, נמוך כל מיקרו כוננים כך tetrodes נחשפים מרבית. במקביל לחתוך את כל tetrodes מאמצים כי כ 5 מ&quot;מ יותר באורך הסופי הרצוי באמצעות מספריים חדים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשביל לחתוך הסופי, להכין זוג משונן מספריים panavise. קלאמפ ידית אחת עם זווית כלפי מטה קלה עם serrations כלפי מעלה, תוך השארת ידית אחרים תלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לסגת לחלוטין את כל tetrodes לתוך צינורית המדריך שלהם על ידי סיבוב מיקרו כוננים למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש stereoscope, מלא להאריך one tetrode מתוך הצינורית שלו. שימוש, שליט עמדת מספריים משונן במרחק הרצוי מן הצינורית מדריך. לאט ובעדינות לחתוך את tetrode בתנועה אחת חלקה. אחרי זה tetrode נחתך, למשוך את מיקרו כונן על ידי 3-4 מ&quot;מ. חזור על תהליך זה עבור כל tetrode עד שכל קוצצו. בנקודה זו אתה מוכן ציפוי זהב. </li></ol> 4. ציפוי זהב של tetrodes לבדוק איכות זהב ציפוי את החוטים tetrode nichrome הוא קריטי עבור הקלטות ארוך טווח ויציב. הוא מונע קורוזיה biocompatibility ומשפר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מטר עכבה במצב חיצוני מחולל הנוכחי במצב לבדוק DC עם פלט השמע (איור 1d). מגע שני מוביל של הגנרטור הנוכחי של שישה זוגות אפשרי של ערוצי tetrode בתוך כל אחד, ולהשתמש משוב השמע כדי לקבוע אם קיימת בין זוגות מכנסיים קצרים. אם קיים קצר, מחדש לחתוך את tetrode במספריים משוננת ולבדוק שוב. אם הבעיה נמשכת, לבטל את tetrode ולהחליף אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מכנסיים קצרים בלי שום להתקיים בתוך כל tetrodes, להעביר את כל מיקרו כוננים למטה, הארכת כל tetrodes רחוק ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את תצורת ציוד לבדיקת עכבה אלקטרודה (איור 1e). עכשיו לטבול את קצות כל tetrodes לתוך אמבט של תמיסת ציפוי זהב סטנדרטי. אמבטיה הזהב מחובר חשמלית להוביל החיובי של מד עכבה. בדוק את העכבה של האלקטרודה ידי נגיעה להוביל שלילית של מד עכבה להצמיד המתאים על הלוח מחבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ורשום את עכבה של חוט על כל מערך מיקרו הכונן. ערכים רגילה נע בין 1-3 MOhm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על גנרטור הנוכחי, הגדר הנוכחית בין 1-3 μA. בשלב הבא, מאובטח לצרף את ההובלה שלילית של מד עכבה להצמיד בלוח מחבר. הנח את הציוד לתוך תצורת electroplating (איור 1f). על מד עכבה, לעבור במהירות ממצב רגיל, כדי לעקוף מצב, ובחזרה. במצב לעקוף, הנוכחי יעבור tetrode פתרון זהב, זהב יהיה מצופה על קצה האלקטרודה. עכבה אחרי כל סיבוב של ציפוי צריך להיות פחות מבעבר. חזור על הדופק הנוכחי אם עכבה לא לרדת מתחת MOhm 1. מגוון השמרני של עכבות מקובל הן על 250kOhm kOhm 350. אם העכבה יורדת מתחת kOhm 200, זה עשוי להצביע על קצר חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לאחר פולסים חזר עכבה לא טיפה מספיק, קצה האלקטרודה עשוי להיות חסום. Re-לחתוך את tetrode, לחפש מכנסיים קצרים, חוזרים על תהליך ציפוי זהב. אם מחדש חיתוך לא עוזר, להחליף את tetrode ולהתחיל מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי כל tetrodes, לטבול את קצות tetrode בקצרה אתנול, ולתת להם להתייבש במשך 3 עד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן קצר מעגלים בתוך tetrodes באמצעות מחולל זרם בקצות tetrode חשוף לאוויר. אם חיבור DC הקיים בין שניים או יותר של אלקטרודות tetrode, מחדש לחתוך את tetrode, צלחת עם זהב שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי הזהב של כל tetrodes תושלם, להוסיף טיפה של דבק בעובי בינוני cyano-Acrylate לממשק בין כל tetrodאלקטרוני שלה polyimide צינורות. זה יהיה להבטיח את tetrode לנהוג מיקרו שלה ולשמור על אורך tetrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כצעד סופי, להעביר את כל tetrodes לכונן ידי הפיכת כל מפשל. </li></ol> 5. הצמדת חרוט מגן המטרה של חרוט מגן הוא מגן מיקרו כוננים חוט tetrode נחשפים מהסביבה. הוא גם מספק תמיכה לטיפול במהלך ניסוי ומפחית רעש חשמלי. אנו משתמשים 3-D קונוס פלסטי מודפס (חלק הפניה אני: ייצור הכונן). עם זאת, ניתן להפוך את הקונוס מחומרים אחרים, כמו חתיכת כפוף סודה יכול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את חרוט הפלסטיק לתקן כמה קלטות רדיד אלומיניום על משטח פנימי או חיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לקדוח חור קטן (1.5 מ&quot;מ קוטר) דרך חרוט ו רופף לצרף הבורג עם מכונת כביסה אגוז בתוך חרוט. זה ישמש למעבר חוט חשמל עבור הקרקע. אנו ממליצים להשתמש בורג 0-80 גודל שילוב מכונת כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להוסיף חלקית סיבוב של שלוש ברגים בגודל 1-72 (16/03 ס&quot;מ אורך) אל צידי חרוט. עם מערך הכונן מושעה, הכנס את חרוט על הכונן. ודא שני חוטים הקרקע להאריך מהחלק התחתון של מערך הכונן. לעטוף את החלק החשוף של חוט האדמה &#39;4 סביב אחד הברגים 1-72 כמה פעמים להדק את הבורג בחוזקה. אבטח את חרוט לבסס את הכונן על ידי הידוק שני הברגים הנותרים חרוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לוקחים את 1 ס&quot;מ של חוט סוף הפשיטו את הקרקע קצר רוח אותו סביב הבורג, בין הקלטת לסכל מכונת כביסה. אבטח את הקרקע על ידי הידוק בורג. עכשיו יש לנו מערך מיקרו הכונן כי הוא סוף סוף מוכן להשתלה כירורגית. </li></ol> 6. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micro-כונן מערך הייצור הושלמה. מערך מיקרו הכונן שלכם היא עמוסה 18 tetrodes ו 3 ערוצי התייחסות. הוא עטוף חרוט כובע המגן על עמידות. מערך סיים מיקרו הכונן עם חרוט מגן שוקל 20 גרם עד 25 גרם בממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך הכונן סיים הוא מושתל באמצעות הליך כירורגי רגיל. כפי שניתן לראות, הכונן מחובר שבב מגבר קדם ואת צרור של חוטים שמעבירים את האות חומרה רכישת נתונים ותוכנה. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="דמות 1" /> איור 1: סכמטי) של תצורת פיתול tetrode. פס אופקי משהה את החוטים לא מחוברים אלקטרודה של tetrode מעל התקן tetrode אוטומטיות פיתול. B) הגדרת למדידת עכבה tetrode ו ציפוי האלקטרודה. כאשר בדיקת קצרים, מעגל שונה:. החוט השחור מחובר לערוץ אחר אלקטרודה על הלוח מחבר C) תקריב של מנהג עשה כונן מיקרו בעל כלי המערך. סרגל גלילי הוא לטפל X-Acto סכין. המחבר הוא 26 פינים, שורה כפולה, מיל-max מחבר. שני החלקים מחוברים יחד באמצעות אקריליק שיניים. D) תצורת לבדיקת קצר. ערוץ X ו-Y הם כל ערוץ שני ערוצים שונים של ארבעה ערוצי tetrode. E) תצורת למדידת עכבה האלקטרודה. המקור הנוכחי הוא &#39;כבוי&#39;. מטר עכבה מוגדר &#39;על&#39; ו &#39;מבחן&#39;. F) עבור תצורת ציפוי זהב של טיפים אלקטרודה. המקור הנוכחי מוגדר &#39;על&#39;, הוא שמע &quot;על&quot;, מצב זה &#39;חד קוטבי &quot;, מבחן DC היא&#39; על &#39;, הנוכחי מוגדר 2 microamps.

<ol><li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li>
</ol>

פרוטוקול זה הוא הפרק השני של פרוטוקול חלק שני: &quot;Micro-כונן מערך עבור כרוני ב-vivo ההקלטה.&quot; השילוב של מערך הכונן מיקרו tetrode הוא כלי רב עוצמה להשגת הקלטות סימולטני של נוירונים רבים ער, מתנהג הכנה של בעלי חיים. יש לקוות, סיפקנו לכם את כל המידע הדרוש תצטרך להתחיל או לשפר את הקלטות אלקטרו במעבדה שלך. המכשיר tetrode ממונע מסלף היה מנהג תוכנן מפוברק. סיפקנו מספר ספק וחלק שיאפשר לך להזמין מכשיר עם פונקציונלי...

<table><tbody><tr><td>Panavise</td><td>כלי</td><td>Panavise</td><td>Model 301</td><td>מחזיק את מערך המיקרו-דרייב או מספריים משוננים</td></tr><tr><td>פליירים Modified Xcelite 378M</td><td>כלי</td><td>Newark Inc</td><td>96F8903</td><td>להכנסת פיני לוח מחברים. כדי להכין, יש להסיר 2mm מקצה אחד של הפליירים.</td></tr><tr><td>דבק Slow Cure</td><td>חומר</td><td>Great Planes (Champaign, IL)</td><td>GPMR6015</td><td>להדבקת הטטרודה למיקרו-דרייב</td></tr><tr><td>תמיסת ציפוי זהב</td><td>חומר</td><td>Neuralynx Inc.</td><td>Sifco Selectron Gold NC</td><td>מכילה חלקיקי זהב לציפוי אלקטרוליטי</td></tr><tr><td>מחולל זרם</td><td>כלי</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>A365D-B</td><td>מוכר גם כ-Stimulus Isolator. משמש לציפוי אלקטרוליטי של תמיסת זהב על קצות האלקטרודות.</td></tr><tr><td>מד עכבה (Impedance Meter)</td><td>כלי</td><td>BAK Electronics</td><td>IMP-1 / 6662 / 2788</td><td>לבדיקת העכבה של האלקטרודות</td></tr><tr><td>פן לאוויר חם</td><td>כלי</td><td>Steinel (Germany)</td><td>HG 3002 LCD</td><td>להיתוך אלקטרודות יחד ליצירת טטרודה</td></tr><tr><td>פינצטות Accu-Tek Carbofib Tip</td><td>כלי</td><td>Aven</td><td>18768 (Pattern 304)</td><td>לטיפול בטטרודות</td></tr><tr><td>תפס תנימים (Alligator Clip)</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-35</td><td>מוכר גם כ-Bulldog serrefine. להצמדת הטטרודות יחד במהלך הפיתול</td></tr><tr><td>מספרי מיקרו-דיסקציה</td><td>כלי</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>25-1000</td><td>לחיתוך כללי של חוטי טטרודה/אלקטרודה</td></tr><tr><td>מספריים משוננים Iris Toughcut</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>לחיתוך סופי של טטרודות</td></tr><tr><td>חוט פלדה דחוס מצופה טפלון</td><td>חומר</td><td>A-M Systems</td><td>790500</td><td>חוט הארקה</td></tr><tr><td>חוט ניכרום 12.5 micron</td><td>חומר</td><td>Kanthal Palm Coast</td><td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td><td>מיקרו-חוט מצופה פוליאמיד להכנת טטרודות.</td></tr><tr><td>מכשיר לפיתול טטרודות (Tetrode Twister)</td><td>כלי</td><td>Neuralynx Inc.</td><td>Tetrode Assembly Station</td><td>מגביר את המהירות והעקביות של ייצור טטרודות.</td></tr><tr><td>צבע כסף</td><td>חומר</td><td>GC International</td><td>22-023</td><td>לחיבור חוטי המיקרו-אלקטרודה של הטטרודה לפיני המחבר (ראו דיון)</td></tr><tr><td>ידית סכין X-Acto</td><td>חומר</td><td>MSC Direct</td><td>X3001</td><td>לבניית התקן החזקה למיקרו-דרייב.</td></tr><tr><td>מחבר 26 פינים, 2 שורות</td><td>חומר</td><td>Mill-Max</td><td>852-10-026-30-001000</td><td>לבניית התקן החזקה למיקרו-דרייב.</td></tr></tbody></table>

micro-drive array עבור כרונית in vivo</emהקלטה>: tetrode האסיפה

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Tetrode, חבילה של ארבע אלקטרודות, הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור הקלטה בו זמנית של מספר רב של נוירונים ב-vivo. ההפרש משרעת פוטנציאל הפעולה של חתימות על ערוצי tetrode מאפשר בידוד של פעילות יחידה אחת מיחידת רב אותות. היכולת לשלוט במדויק את המיקום ואת עומק stereotaxic של tetrode הוא קריטי לחקר פעילות עצבית מתואמת על פני אזורים במוח. בשילוב עם מערך מיקרו הכונן, ניתן להשיג את המיקום המדויק ושליטה יציבה של tetrodes רבים במשך ימים עד שבועות. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד לפברק tetrodes תנאי שימוש בכלים בסיסיים וחומרים, להתקין את tetrodes לתוך מערך רב כונן tetrode עבור כרוני ב-vivo הקלטה בחולדה, להפוך חוט קשרים הקרקע למערך כונן מיקרו, ואת לצרף חרוט מגן על מערך הכונן מיקרו על מנת להגן על tetrodes מכל מגע פיזי עם הסביבה.

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לפברק tetrodes תנאי לשימוש עם מערך מיקרו הכונן, אשר תוכנן עבור הקלטות אלקטרו כרונית בחולדות. בנוסף, אנו ממחישים בשלבים הסופיים של הבנייה מיקרו הכונן מערך, הכולל חוטים הקרקע התקנה חרוט מגן.

Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo</emהקלטה>: Tetrode האסיפה

הטטרוד (tetrode), צרור של ארבעה אלקטרודות, הוכח ככלי בעל ערך להקלטה סימולטנית של נוירונים מרובים in-vivo. הדיפרנציאלי...

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הייצור וההשתלה של צרורות Tetros המורכבות מארבעה אלקטרודות להקלטה כרונית in vivo במכרסמים ערים. כדי להתחיל בייצור ה-tetro, מקפלים גדיל של חוטי מיקרו-אלקטרודות פעמיים על עצמו כדי ליצור צרור של ארבעה חוטים מקבילים. לאחר מכן, פותלים את החוטים הללו יחד ומקבעים אותם באמצעות אקדח אוויר חם.כל tero שהושלם מונח בארגז אחסון. בעוד ש-teros נוספים מיוצרים, כל tero מוכנס במורד נתיב ייעודי הנכנס דרך פתח באקטואטור ליניארי ויוצא דרך הבסיס של מערך המיקרו-דרייב. כל אחד מארבעת החוטים של ה-tero מחובר לפינים נפרדים בלוח מחבר פלט המחובר לחלקו העליון של מערך המיקרו-דרייב.העכבה של כל ערוץ ב-tero מופחתת באמצעות תהליך ציפוי חשמלי בזהב. לאחר שכל ה-teros הותקנו ועברו ציפוי חשמלי, שני חוטי הארקה מחוברים לפינים המתאימים בלוח המחברים, וקונו מגן מוצמד למסגרת של מערך המיקרו-דרייב להגנה לאחר שהקונו הוארק, מערכי מיקרו-דרייב Tero תקיים ופונקציונליים המוכנים להשתלה. שלום, אני דייב ניאן מהמעבדה של נט וילסון במכון פיקאוט ללמידה וזיכרון.ב-MIT, היום נראה לכם הליך לייצור teros, טעינת teros, והשלמת השלבים הסופיים של שחזור המיקרו-דרייב (micro drive). אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור פעילות עצבית מתואמת בין אוכלוסיות גדולות של נוירונים בתוך הכנה של בעל חיים ער ומתנהג. אז בואו נתחיל.כדי לבנות את ה-tero עבור מערך המיקרו-דרייב הסטנדרטי שלנו, נתחיל עם חוט microme מבודד ברוחב 12 micron ובאורך 50 centimeter. קפלו את החוט לחצי, והעבירו את האצבעות לאורך הזוג כדי לגרום להם להידבק זה לזה. ודאו שזוג החוטים נמצא במגע טוב לאורך כל אורכו.קפלו את הצמד שוב על ידי החזקת שני הקצוות יחד. ודאו שהלולאה שנוצרה בקצה אחד אינה מקושיפה. גזרו את ארבעת החוטים בקצה שאינו לולאה כך שארבעת הקצוות יהיו מיושרים.עבור השלב הבא, תזדקקו לתפס תנין משונה, למכשיר סיבוב ממונע ולמוט אופקי מעל מכשיר הסיבוב. תפס התנין משונה על ידי הדבקת מוט פלסטיק לבסיס התפס. כאשר הקצוות חשופים, הדקו את ארבעת החוטים יחד באמצעות תפס התנין המשונה.תלו את לולאת התיל מעל המוט האופקי. מקמו את תפס התנין בבמה הממונעת. בצעו 80 סיבובים עם כיוון השעון ואחריהם 40 סיבובים נגד כיוון השעון לצורת צרור התיל במשך כသုံး דקות.ניתן לשנות פרמטרים אלו בהתאם לצרכיכם. לאחר השלמת הפיתול, האחו את החוטים יחד על ידי חימום משלוש זוויות שונות באמצעות אקדח חום, תוך שימוש בזרימה בינונית עד נמוכה עבור כל זווית, והתחילו מיקום של 1-2 סנטימטרים מתחת לנקודה שבה צרור החוטים מתפצל. לאחר מכן, העבירו את אקדח החום למטה ולמעלה במרחק של 2 סנטימטרים מהחוטים למשך כ-5 שניות.יש לנהוג בזהירות שכן טמפרטורות גבוהות ימיסו לחלוטין את הבידוד ויובילו לקצרים חשמליים. כעת, לאחר שהחוטים התמזגו, הוצא את ה-tero ממכשיר הפיתול על ידי הרמה עדינה של תפס התנין כדי לשחרר את המתח מה-tero, וגזור את ה-tero בסמוך לתפס התנין. בקצה השני, גזור את הלולאה כך שיישארו ארבעה גדילי חוטים ללא סימון באורך שווה. לאחר מכן, הפרד בין הגדילים הבודדים בחלק העליון על ידי כיפוף עדין של החוטים באמצעות פינצטה עם קצה רך.ה-tero מוכן כעת להטענה אל תוך מערך המיקרו-דרייב. הכינו עוד 21 עד 25 דרכי Tet ואחסנו אותן בקופסה נקייה מאבק עד להגעת הזמן לתהליך הטענת ה-tero. תזדקקו למערך מיקרו-דרייב מלא אם עדיין לא בניתם אחד.עיינו בסרטון המדגים את מערך ההנעה של המיקרו-אלקטרודות להקלטה כרונית in vivo לצורך ייצור מערך מיקרו-הנעה בתוכנית התכנון שלנו. ה-tero יחובר בקצה אחד לחומרת מחבר ויעבור דרך צינור נשא מפולימיד בתוך המיקרו-הנעה, כך שקצות האלקטרודות יבלטו מתחת לבסיס של מערך המיקרו-הנעה. כעת נדגים את תהליך הטעינה עבור tero אחד.לפני התחלת העבודה, בנו את מחזיק הכונן שניתן לחבר מקצה אחד ללוח המחברים ובקצה השני ניתן להצמידו למגש קרח. בדוגמה זו, מחזיק הכונן הוא מחבר milax המודבק לקצה אחד של ידית סכין X exacto. תוך החזקת ה-tero באמצעות פינצטה בעלת קצה רך ושימוש בסטריאוסקופ, דחפו את קצה ה-tero לתוך צינור נשא ה-poly mid של אחד מהמיקרו-כוננים. דחפו את ה-Tet road לתוך הצינור עד שחוטי האלקטרודות הבודדים יהיו קרובים ללוח המחברים בחלקו העליון של מערך הכוננים. היזהרו לא לכופף את החוטים, שכן הדבר יגרום ל-tetro לחדור למוח בזווית במקום בצורה מאונכת, ויפגע בשלמות ה-tero.כעת, הכניסו בעדינות את הקצה השני של ארבעת החוטים לחורים המתאימים להם בלוח הממשק של האלקטרודה, באמצעות פינצטה בעלת קצה רך. שוב, הימנעו מכיפוף או עיקום של החוטים. כאשר כל ארבעת החוטים נמצאים במקומם, דחפו את פיני הזהב לתוך החורים שלהם באמצעות פלייר בעל לסת תחתונה מקוצרת.כאשר הדחיפים נדחפים אל תוך החור, הם יקלפו את בידוד החוט וייצרו חיבור חשמלי לצורך התייחסות מאוחרת יותר. עקבו אחר המיפוי בין המיקרו-דרייבים למיקום הדחיפים על לוח הממשק של האלקטרודה. המשיכו להטעין סה"כ 18 tetros.שלושת המיקרו-דרייבים הנותרים במערך ישמשו לאחסון האלקטרודות של הייחוס. כל אלקטרודת ייחוס עשויה מ-tero המשתמש רק באחד מארבעת ה-yns שאינם מקושרים. כדי לחבר את אלקטרודות הייחוס, פעל לפי הליך הטעינה, אך חבר רק אחת מארבע האלקטרודות לפין של אלקטרודת הייחוס המתאימה בלוח המחברים.אם אתם מתכננים הקלטות ממספר אתרים, עשוי להיות כדאי לתכנן מראש את החיבורים מה-tetros ללוח המחברים. לדוגמה, קבצו יחד על לוח ממשק האלקטרודות tetros המיועדים לאזור אנטומי אחד. פעולה זו אמורה לצמצם את הסבירות לכיוונון של tetro שגוי במהלך הניסויים.לאחר השלמת טעינת ה-tero, הכינו שני חוטי הארקה, אחד עבור החיה ואחד עבור קונו ההגנה. חתכו חוט פלדה מבודד באורך שש אינץ' והסירו שלושה מילימטרים של בידוד מקצוות החוט באמצעות פינצטה ממתכת. לאחר מכן, חתכו חוט פלדה מבודד באורך ארבעה אינץ'.הסר שלושה מילימטרים של בידוד מקצה אחד וסנטימטר אחד מהקצה השני. העבר את חוט ההארקה באורך שישה אינץ' דרך החור שבצד מערך המיקרו-דרייב כלפי מעלה לכיוון לוח הממשק. חבר את החוט החשוף ללוח ממשק האלקטרודות באמצעות פין זהב בחור ההארקה הייעודי.חוט זה יחובר לגולגולת החיה. יש להוביל את חוט ההארקה באורך ארבעה אינץ' במקביל לחוט ההארקה שהותקן קודם לכן. חברו את הקצה שקולף באורך שלושה מילימטרים ללוח ממשק האלקטרודות באמצעות פין זהב בחור הארקה ייעודי אחר.חוט זה יחובק מאוחר יותר למסך הגנה בצורת קונוס, שישמש ככלוב פאראדיי קטן להפחתת רעשי רקע. כעת סיימנו את חיבור החוטים וניתן להמשיך בליטוש ה-teros. מטרתנו בתהליך זה היא לחתוך את כל ה-teros כך שיהיו ארוכים מעט מעומקה של מבנה המוח המיועד ובדוגמה שלנו.מנועי המיקרו תוכננו למהלך מקסימלי של חמישה עד שישה מילימטרים, מספיק כדי להגיע לאזורים ניאוקורטיקליים רבים ולהיפוקמפוס הדורסלי של חולדה בוגרת. ראשית, הורד את כל מנועי המיקרו כך שהטטרודים יהיו חשופים באופן מקסימלי בו-זמנית. גזור את כל הטטרודים לאורכים שהם כחמישה מילימטרים יותר מהאורך הסופי הרצוי, תוך שימוש במספריים עדינים וחדים עבור הגזירה הסופית.הכינו זוג מספריים משוננים באמבט קרח; קבעו ידית אחת בזווית קלה כלפי מטה כאשר השיניים פונות כלפי מעלה, והשאירו את הידית השנייה תלויה. כעת, שלפו לחלוטין את כל מוטות ה-Tet אל תוך קנולת המוליכים שלהם על ידי סיבוב המיקרו-מניעים כלפי מעלה. באמצעות סטריאוסקופ, הוציאו לחלוטין מוט tero אחד מהקנולה שלו.בעזרת סרגל, מקמו את המספריים המשוננים במרחק הרצוי מהמוליך לקנולה. גזרו את ה-tero לאט ובזהירות בתנועה חלקה אחת. לאחר גזירת ה-tero, הסיטו את המיקרו-דרייב כלפי מעלה ב-3 עד 4 מילימטרים.חזור על תהליך זה עבור כל tero עד שכולם ייחתכו. בנקודה זו, ניתן להתחיל בציפוי זהב. ציפוי זהב.הציפוי הוא קריטי להקלטות יציבות לטווח ארוך. הוא מונע קורוזיה ומשפר את התאימות הביולוגית. הגדירו את מד העכבה (impedance meter) במצב חיצוני (external mode) במחולל הזרם, ובמצב בדיקת DC עם פלט שמע.נגעו עם שני המוליכים של מחולל הזרם בששת הזוגות האפשריים של הערוצים בתוך כל tero, והשתמשו במשוב השמע כדי לקבוע אם קיימים קצרים בין הזוגות. קצר בין זוגות ערוצים נשמע כך. אם קיים קצר, גזרו שוב את ה-tero באמצעות מספריים משוננים ובדקו שנית.אם הבעיה נמשכת, יש להשליך את ה-Tet road ולהחליפו. העבירו את כל המיקרו-דרייבים (micro drives) למטה, והאריכו את כל ה-Tet roads רחוק ככל האפשר. שנו את תצורת הציוד לבדיקת עכבת האלקטרודה.כעת טבלו את הקצוות של כל ה-teros לתוך אמבט של תמיסת ציפוי זהב סטנדרטית. אמבט הזהב מחובר חשמלית להדק השלילי של מד העכבה (impedance meter). בדקו את העכבה של האלקטרודה על ידי נגיעה עם ההדק החיובי של מד העכבה בפין המתאים בלוח המחברים.מדדו ורשמו את העכבה של כל מוליך במערך המיקרו-דרייב. ערכים תקינים נעים בין מגה-אוהם אחד לשלושה בגנרטור הזרם. הגדירו את הזרם לערך שבין 1 µA ל-3 µA.בשלב הבא, חברו בבטחה את המוליך החיובי של מד העכבה (impedance meter) לפין שעל לוח המחברים. במד העכבה.עברו במהירות ממצב רגיל למצב מעקף וחזרה בזמן השהייה במצב מעקף. הזרם יעבור דרך נתיב ה-Tet ותמיסת הזהב, וזהב יצפה את קצה האלקטרודה. העכבה לאחר כל סבב ציפוי צריכה להיות נמוכה מזו שקדמה לו.חזור על הפולס הנוכחי. אם העכבה לא ירדה מתחת ל-1 MΩ. טווח שמרני של עכבות קבילות הוא 250 kΩ עד 350 kΩ.אם העכבה יורדת מתחת ל-200 kilo ohms, הדבר עשוי להעיד על קצר חשמלי. אם לאחר פולסים חוזרים העכבה אינה יורדת מספיק, ייתכן שקצה האלקטרודה חסום. חתכו מחדש את ה-tero, בדקו אם ישנם קצרים וחזרו על תהליך הציפוי בזהב.אם חיתוך חוזר אינו עוזר, החליפו את ה-tero והתחילו מחדש. לאחר פריסת כל ה-teros, טבלו אותם באתנול והניחו להם להתייבש במשך שלוש עד חמש דקות. בדקו אם קיימים קצרים בתוך ה-teros באמצעות מחולל זרם כאשר קצות ה-tero חשופים לאוויר.אם קיים חיבור DC בין שתי אלקטרודות או יותר של tero, חתוך מחדש את ה-tero וצפה אותו בזהב שוב. לאחר השלמת ציפוי הזהב של כל ה-teros, העבר את כל ה-teros לתוך הדחף (drive). כשלב סופי בחלקו העליון של כל מיקרו-דחף, הוסף טיפה של דבק ציאנואקרילט בעובי בינוני לממשק שבין כל tero לצינור הפולימר שלו.פעולה זו תבטיח את קיבוע ה-tero למיקרו-דרייב שלו. מטרת מחבר ההגנה היא להגן על המיקרו-דרייבים ועל חוט ה-tero החשוף מפני הסביבה. הוא מספק גם תמיכה בזמן הטיפול במהלך הניסוי ומפחית רעש חשמלי.אנו משתמשים בחרוט פלסטיק הודפס בתלת-ממד. עם זאת, ניתן להכין את החרוט מחומרים אחרים, כגון פיסת פחית משקה כפופה. ניתן לקחת את חרוט הפלסטיק ולהדביק סרט נייר אלומיניום למשטח הפנימי או החיצוני.ראשית, הכנסו וסובבו חלקית 3 ברגים בגודל 1/72 ובאורך 3/16 אינץ' לצדדי החרוט כאשר מערך ההנעה תלוי. הכניסו את החרוט מעל ההנעה. ודאו ששני חוטי ההארקה בולטים מחלקו התחתון של מערך ההנעה.לפפו את החלק החשוף של חוט ההארקה באורך ארבעה אינץ' מספר פעמים סביב אחד מהברגים בגודל 1 72 והדקו את הבורג. הדקו היטב את החרוט לבסיס ההנעה על ידי הידוק שני ברגי החרוט הנותרים. ייצור מערך המיקרו-דרייב הושלם כעת. מערך המיקרו-דרייב שלכם טעון ב-18 teros בשלושה רפרנסים.הוא עטוף בחרוט ומכסה מגינים לצורך עמידות. הכונן המוגמר שוקל בדרך כלל בין 20 ל-25 גרמים, בממוצע.את מערך המיקרו-דרייב המוגמר משתילים באמצעות פרוצדורה כירורגית סטנדרטית. כפי שניתן לראות, הדרייב מחובר לשבב קדם-מגבר ולצרור חוטים המעבירים את האות לחומרה ותוכנה של רכישת נתונים. כעת הצגנו בפניכם כיצד להכין תרס (teros) ולהשלים את פרוצדורת בניית מערך המיקרו-דרייב.בסרטון זה, הצגנו כיצד לייצר teros, וכיצד להטעין ולהכין אותם להקלטה in vivo. בנוסף, הצגנו כיצד להוסיף חרוט למערך המיקרו-דרייבר (micro driver array) כדי להפוך אותו לעמיד לאורך זמן. בניית מערך המיקרו-דרייבר כוללת שלבים רבים, לכן היו סבלניים, התייחסו בעדינות לאלקטרודות וודאו שכל השלבי הביניים הושלמו כראוי.תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסוייכם.

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-tetrode-assembly

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לפברק מערך כונן מיקרו להקלטות אלקטרו כרונית בחולדות.

Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo</emהקלטה>: כונן ייצור

העיצוב, הייצור וההרכבה של ממונע microdrive קל במיוחד הוא תאר. המכשיר מספק פתרון חסכוני וקל לשימוש, עבור הקלטות כרוניות של יחידות בודדות בחיות מתנהגות קטנות.

תכנון והרכבה של Microdrive קל במיוחד ממונע להקלטות עצביות כרוניות בבעלי חיים קטנים

הסרטון מדגים הקלטה אלקטרופיזיולוגית סימולטנית מאזורי מוח מרובים בחולדה באמצעות מערך מיקרו-כונן אינטגרטיבי. אלקטרודות הקלטה ממוקמות בנורת הריח, אלקטרודות ייחוס בקליפת המוח המצחית, ואלקטרודות מערך מיקרו-כונן בהיפוקמפוס. החולדה מורשית לחפש מזון באופן חופשי, והקלטה סימולטנית מכל האלקטרודות המושתלות נרשמת באמצעות המערך.

שיטת מערך מיקרו-כוננים להקלטה אלקטרופיזיולוגית מאזורי מוח מרובים

התכנון וההרכבה של microdrives בקלטות אלקטרו vivo של אותות מוח של העכבר מתואר. על ידי הצמדת צרורות microelectrode לספקי driveable חסונים, טכניקות אלה יאפשרו להקלטות עצביות ארוכת טווח ויציבים. העיצוב קל משקל מאפשר ביצועי התנהגות בלתי מוגבל על ידי השתלת הדיסק הבאה של בעלי החיים.

בנייה של מערכי Microdrive להקלטות עצביות כרוניות בעכברים מתנהגים ערים

הבנת המצעים העצביים של ההתנהגות דורשת רישום של אנסמבל מעגלי המוח. בגלל יכולת המעקב הגנטית שלו, העכבר מציע מודל לדיסקציה של מעגלים וחיקוי מחלות. כאן מתוארת שיטה לתכנון וייצור בדיקות ממוזערות המתאימה למיקוד מבנה המוח העמוק בעכבר.

עיצוב וייצור של Ultralight משקל, בדיקות Multi-אלקטרודה מתכוונן לקלטות אלקטרו בעכברים

אנו מציגים הבנייה של דחף ניתנים להדפסה תלת-ממד עם שמונה עשר tetrodes מתכווננות באופן עצמאי. הנעת מיועד להקליט את פעילות המוח באופן חופשי להתנהג חולדות על פני תקופה של מספר שבועות.

בניית הנעת Tetrode רב משופרת עבור הקלטת עצבית בקנה מידה גדול ב מתנהג חולדות

פרוטוקול זה מתאר את הבנייה של מערך microdrive היברידית המאפשר השרשה של תשעה באופן עצמאי tetrodes מתכווננת ובדיקה אחת opto-סיליקון מתכווננת בשני אזורי המוח בעכברים נעים בחופשיות. כמו כן הפגינו היא שיטה לשחזור בבטחה ושימוש חוזר במחקר opto-סיליקון למטרות מרובות.

מערכת Microdrive היברידית עם בדיקה ההשבה Opto-סיליקון ו Tetrode עבור הקלטה כפול בצפיפות גבוהה בחופשיות העברת עכברים

טכניקה אלחוטית הרומן עבור הקלטת אותות עצביים מן המוח של שחייה בחופשיות הזהב מוצג. המכשיר מורכב משני tetrodes, מיקרודרייב, לוגר מידע עצבי, ומקרה עמיד למים. כל החלקים מותאמים אישית למעט לוגר הנתונים והמחבר שלו.

הקלטה אלקטרופיסיולוגית של הנוירונים על ידי להזזה Tetrodes בחינם שחייה דגים

אנו מתארים כאן שיטה עבור בדיית Ti3C2 mxene מערכים מיקרואלקטרודה וניצול אותם עבור בהקלטה vivo עצבית.

הייצור של Ti3C2 Mxene מערכים מיקרואלקטרודה בVivo הקלטה עצבית

במאמר זה אנו מתארים תכנון מיקרו-דרייב, הליך השתלה כירורגי ואסטרטגיית התאוששות לאחר ניתוח, המאפשרים הקלטות שדה כרוניות ויחידות בודדות מאזורי מוח מרובים בו זמנית בעכברים צעירים ומתבגרים בחלון התפתחותי קריטי מהיום ה-20 שלאחר הלידה (עמ' 20) ועד היום ה-60 שלאחר הלידה (עמ' 60) ומעבר לכך.

שתל כונן קל משקל לרישומי טטרוד כרוניים בעכברים צעירים

כאן, אנו מציגים מערכת שתלי בדיקה קלת משקל וחסכונית לאלקטרופיזיולוגיה כרונית במכרסמים המותאמת לקלות שימוש, שחזור בדיקה, רב-תכליתיות ניסיונית ותאימות להתנהגות.

שתל DREAM: מערכת שתלים קלה, מודולרית וחסכונית לאלקטרופיזיולוגיה כרונית בעכברים מקובעים ראש ומתנהגים בחופשיות

למד כיצד לייצר ולהתקין טטרודות למערך מיקרו-דרייב להקלטות אלקטרופיזיולוגיות כרוניות בעכברושים ערים. שיטה זו מאפשרת ניטור פעילות עצבית ארוך טווח במעבדה.

Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo: Tetrode האסיפה

גלה סרטונים נוספים