Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo: Tetrode האסיפה

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הייצור וההשתלה של צרורות Tetros המורכבות מארבעה אלקטרודות להקלטה כרונית in vivo במכרסמים ערים. כדי להתחיל בייצור ה-tetro, מקפלים גדיל של חוטי מיקרו-אלקטרודות פעמיים על עצמו כדי ליצור צרור של ארבעה חוטים מקבילים. לאחר מכן, פותלים את החוטים הללו יחד ומקבעים אותם באמצעות אקדח אוויר חם.

כל tero שהושלם מונח בארגז אחסון. בעוד ש-teros נוספים מיוצרים, כל tero מוכנס במורד נתיב ייעודי הנכנס דרך פתח באקטואטור ליניארי ויוצא דרך הבסיס של מערך המיקרו-דרייב. כל אחד מארבעת החוטים של ה-tero מחובר לפינים נפרדים בלוח מחבר פלט המחובר לחלקו העליון של מערך המיקרו-דרייב.

העכבה של כל ערוץ ב-tero מופחתת באמצעות תהליך ציפוי חשמלי בזהב. לאחר שכל ה-teros הותקנו ועברו ציפוי חשמלי, שני חוטי הארקה מחוברים לפינים המתאימים בלוח המחברים, וקונו מגן מוצמד למסגרת של מערך המיקרו-דרייב להגנה לאחר שהקונו הוארק, מערכי מיקרו-דרייב Tero תקיים ופונקציונליים המוכנים להשתלה. שלום, אני דייב ניאן מהמעבדה של נט וילסון במכון פיקאוט ללמידה וזיכרון.

ב-MIT, היום נראה לכם הליך לייצור teros, טעינת teros, והשלמת השלבים הסופיים של שחזור המיקרו-דרייב (micro drive). אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור פעילות עצבית מתואמת בין אוכלוסיות גדולות של נוירונים בתוך הכנה של בעל חיים ער ומתנהג. אז בואו נתחיל.

כדי לבנות את ה-tero עבור מערך המיקרו-דרייב הסטנדרטי שלנו, נתחיל עם חוט microme מבודד ברוחב 12 micron ובאורך 50 centimeter. קפלו את החוט לחצי, והעבירו את האצבעות לאורך הזוג כדי לגרום להם להידבק זה לזה. ודאו שזוג החוטים נמצא במגע טוב לאורך כל אורכו.

קפלו את הצמד שוב על ידי החזקת שני הקצוות יחד. ודאו שהלולאה שנוצרה בקצה אחד אינה מקושיפה. גזרו את ארבעת החוטים בקצה שאינו לולאה כך שארבעת הקצוות יהיו מיושרים.

עבור השלב הבא, תזדקקו לתפס תנין משונה, למכשיר סיבוב ממונע ולמוט אופקי מעל מכשיר הסיבוב. תפס התנין משונה על ידי הדבקת מוט פלסטיק לבסיס התפס. כאשר הקצוות חשופים, הדקו את ארבעת החוטים יחד באמצעות תפס התנין המשונה.

תלו את לולאת התיל מעל המוט האופקי. מקמו את תפס התנין בבמה הממונעת. בצעו 80 סיבובים עם כיוון השעון ואחריהם 40 סיבובים נגד כיוון השעון לצורת צרור התיל במשך כသုံး דקות.

ניתן לשנות פרמטרים אלו בהתאם לצרכיכם. לאחר השלמת הפיתול, האחו את החוטים יחד על ידי חימום משלוש זוויות שונות באמצעות אקדח חום, תוך שימוש בזרימה בינונית עד נמוכה עבור כל זווית, והתחילו מיקום של 1-2 סנטימטרים מתחת לנקודה שבה צרור החוטים מתפצל. לאחר מכן, העבירו את אקדח החום למטה ולמעלה במרחק של 2 סנטימטרים מהחוטים למשך כ-5 שניות.

יש לנהוג בזהירות שכן טמפרטורות גבוהות ימיסו לחלוטין את הבידוד ויובילו לקצרים חשמליים. כעת, לאחר שהחוטים התמזגו, הוצא את ה-tero ממכשיר הפיתול על ידי הרמה עדינה של תפס התנין כדי לשחרר את המתח מה-tero, וגזור את ה-tero בסמוך לתפס התנין. בקצה השני, גזור את הלולאה כך שיישארו ארבעה גדילי חוטים ללא סימון באורך שווה. לאחר מכן, הפרד בין הגדילים הבודדים בחלק העליון על ידי כיפוף עדין של החוטים באמצעות פינצטה עם קצה רך.

ה-tero מוכן כעת להטענה אל תוך מערך המיקרו-דרייב. הכינו עוד 21 עד 25 דרכי Tet ואחסנו אותן בקופסה נקייה מאבק עד להגעת הזמן לתהליך הטענת ה-tero. תזדקקו למערך מיקרו-דרייב מלא אם עדיין לא בניתם אחד.

עיינו בסרטון המדגים את מערך ההנעה של המיקרו-אלקטרודות להקלטה כרונית in vivo לצורך ייצור מערך מיקרו-הנעה בתוכנית התכנון שלנו. ה-tero יחובר בקצה אחד לחומרת מחבר ויעבור דרך צינור נשא מפולימיד בתוך המיקרו-הנעה, כך שקצות האלקטרודות יבלטו מתחת לבסיס של מערך המיקרו-הנעה. כעת נדגים את תהליך הטעינה עבור tero אחד.

לפני התחלת העבודה, בנו את מחזיק הכונן שניתן לחבר מקצה אחד ללוח המחברים ובקצה השני ניתן להצמידו למגש קרח. בדוגמה זו, מחזיק הכונן הוא מחבר milax המודבק לקצה אחד של ידית סכין X exacto. תוך החזקת ה-tero באמצעות פינצטה בעלת קצה רך ושימוש בסטריאוסקופ, דחפו את קצה ה-tero לתוך צינור נשא ה-poly mid של אחד מהמיקרו-כוננים. דחפו את ה-Tet road לתוך הצינור עד שחוטי האלקטרודות הבודדים יהיו קרובים ללוח המחברים בחלקו העליון של מערך הכוננים. היזהרו לא לכופף את החוטים, שכן הדבר יגרום ל-tetro לחדור למוח בזווית במקום בצורה מאונכת, ויפגע בשלמות ה-tero.

כעת, הכניסו בעדינות את הקצה השני של ארבעת החוטים לחורים המתאימים להם בלוח הממשק של האלקטרודה, באמצעות פינצטה בעלת קצה רך. שוב, הימנעו מכיפוף או עיקום של החוטים. כאשר כל ארבעת החוטים נמצאים במקומם, דחפו את פיני הזהב לתוך החורים שלהם באמצעות פלייר בעל לסת תחתונה מקוצרת.

כאשר הדחיפים נדחפים אל תוך החור, הם יקלפו את בידוד החוט וייצרו חיבור חשמלי לצורך התייחסות מאוחרת יותר. עקבו אחר המיפוי בין המיקרו-דרייבים למיקום הדחיפים על לוח הממשק של האלקטרודה. המשיכו להטעין סה"כ 18 tetros.

שלושת המיקרו-דרייבים הנותרים במערך ישמשו לאחסון האלקטרודות של הייחוס. כל אלקטרודת ייחוס עשויה מ-tero המשתמש רק באחד מארבעת ה-yns שאינם מקושרים. כדי לחבר את אלקטרודות הייחוס, פעל לפי הליך הטעינה, אך חבר רק אחת מארבע האלקטרודות לפין של אלקטרודת הייחוס המתאימה בלוח המחברים.

אם אתם מתכננים הקלטות ממספר אתרים, עשוי להיות כדאי לתכנן מראש את החיבורים מה-tetros ללוח המחברים. לדוגמה, קבצו יחד על לוח ממשק האלקטרודות tetros המיועדים לאזור אנטומי אחד. פעולה זו אמורה לצמצם את הסבירות לכיוונון של tetro שגוי במהלך הניסויים.

לאחר השלמת טעינת ה-tero, הכינו שני חוטי הארקה, אחד עבור החיה ואחד עבור קונו ההגנה. חתכו חוט פלדה מבודד באורך שש אינץ' והסירו שלושה מילימטרים של בידוד מקצוות החוט באמצעות פינצטה ממתכת. לאחר מכן, חתכו חוט פלדה מבודד באורך ארבעה אינץ'.

הסר שלושה מילימטרים של בידוד מקצה אחד וסנטימטר אחד מהקצה השני. העבר את חוט ההארקה באורך שישה אינץ' דרך החור שבצד מערך המיקרו-דרייב כלפי מעלה לכיוון לוח הממשק. חבר את החוט החשוף ללוח ממשק האלקטרודות באמצעות פין זהב בחור ההארקה הייעודי.

חוט זה יחובר לגולגולת החיה. יש להוביל את חוט ההארקה באורך ארבעה אינץ' במקביל לחוט ההארקה שהותקן קודם לכן. חברו את הקצה שקולף באורך שלושה מילימטרים ללוח ממשק האלקטרודות באמצעות פין זהב בחור הארקה ייעודי אחר.

חוט זה יחובק מאוחר יותר למסך הגנה בצורת קונוס, שישמש ככלוב פאראדיי קטן להפחתת רעשי רקע. כעת סיימנו את חיבור החוטים וניתן להמשיך בליטוש ה-teros. מטרתנו בתהליך זה היא לחתוך את כל ה-teros כך שיהיו ארוכים מעט מעומקה של מבנה המוח המיועד ובדוגמה שלנו.

מנועי המיקרו תוכננו למהלך מקסימלי של חמישה עד שישה מילימטרים, מספיק כדי להגיע לאזורים ניאוקורטיקליים רבים ולהיפוקמפוס הדורסלי של חולדה בוגרת. ראשית, הורד את כל מנועי המיקרו כך שהטטרודים יהיו חשופים באופן מקסימלי בו-זמנית. גזור את כל הטטרודים לאורכים שהם כחמישה מילימטרים יותר מהאורך הסופי הרצוי, תוך שימוש במספריים עדינים וחדים עבור הגזירה הסופית.

הכינו זוג מספריים משוננים באמבט קרח; קבעו ידית אחת בזווית קלה כלפי מטה כאשר השיניים פונות כלפי מעלה, והשאירו את הידית השנייה תלויה. כעת, שלפו לחלוטין את כל מוטות ה-Tet אל תוך קנולת המוליכים שלהם על ידי סיבוב המיקרו-מניעים כלפי מעלה. באמצעות סטריאוסקופ, הוציאו לחלוטין מוט tero אחד מהקנולה שלו.

בעזרת סרגל, מקמו את המספריים המשוננים במרחק הרצוי מהמוליך לקנולה. גזרו את ה-tero לאט ובזהירות בתנועה חלקה אחת. לאחר גזירת ה-tero, הסיטו את המיקרו-דרייב כלפי מעלה ב-3 עד 4 מילימטרים.

חזור על תהליך זה עבור כל tero עד שכולם ייחתכו. בנקודה זו, ניתן להתחיל בציפוי זהב. ציפוי זהב.

הציפוי הוא קריטי להקלטות יציבות לטווח ארוך. הוא מונע קורוזיה ומשפר את התאימות הביולוגית. הגדירו את מד העכבה (impedance meter) במצב חיצוני (external mode) במחולל הזרם, ובמצב בדיקת DC עם פלט שמע.

נגעו עם שני המוליכים של מחולל הזרם בששת הזוגות האפשריים של הערוצים בתוך כל tero, והשתמשו במשוב השמע כדי לקבוע אם קיימים קצרים בין הזוגות. קצר בין זוגות ערוצים נשמע כך. אם קיים קצר, גזרו שוב את ה-tero באמצעות מספריים משוננים ובדקו שנית.

אם הבעיה נמשכת, יש להשליך את ה-Tet road ולהחליפו. העבירו את כל המיקרו-דרייבים (micro drives) למטה, והאריכו את כל ה-Tet roads רחוק ככל האפשר. שנו את תצורת הציוד לבדיקת עכבת האלקטרודה.

כעת טבלו את הקצוות של כל ה-teros לתוך אמבט של תמיסת ציפוי זהב סטנדרטית. אמבט הזהב מחובר חשמלית להדק השלילי של מד העכבה (impedance meter). בדקו את העכבה של האלקטרודה על ידי נגיעה עם ההדק החיובי של מד העכבה בפין המתאים בלוח המחברים.

מדדו ורשמו את העכבה של כל מוליך במערך המיקרו-דרייב. ערכים תקינים נעים בין מגה-אוהם אחד לשלושה בגנרטור הזרם. הגדירו את הזרם לערך שבין 1 µA ל-3 µA.

בשלב הבא, חברו בבטחה את המוליך החיובי של מד העכבה (impedance meter) לפין שעל לוח המחברים. במד העכבה.

עברו במהירות ממצב רגיל למצב מעקף וחזרה בזמן השהייה במצב מעקף. הזרם יעבור דרך נתיב ה-Tet ותמיסת הזהב, וזהב יצפה את קצה האלקטרודה. העכבה לאחר כל סבב ציפוי צריכה להיות נמוכה מזו שקדמה לו.

חזור על הפולס הנוכחי. אם העכבה לא ירדה מתחת ל-1 MΩ. טווח שמרני של עכבות קבילות הוא 250 kΩ עד 350 kΩ.

אם העכבה יורדת מתחת ל-200 kilo ohms, הדבר עשוי להעיד על קצר חשמלי. אם לאחר פולסים חוזרים העכבה אינה יורדת מספיק, ייתכן שקצה האלקטרודה חסום. חתכו מחדש את ה-tero, בדקו אם ישנם קצרים וחזרו על תהליך הציפוי בזהב.

אם חיתוך חוזר אינו עוזר, החליפו את ה-tero והתחילו מחדש. לאחר פריסת כל ה-teros, טבלו אותם באתנול והניחו להם להתייבש במשך שלוש עד חמש דקות. בדקו אם קיימים קצרים בתוך ה-teros באמצעות מחולל זרם כאשר קצות ה-tero חשופים לאוויר.

אם קיים חיבור DC בין שתי אלקטרודות או יותר של tero, חתוך מחדש את ה-tero וצפה אותו בזהב שוב. לאחר השלמת ציפוי הזהב של כל ה-teros, העבר את כל ה-teros לתוך הדחף (drive). כשלב סופי בחלקו העליון של כל מיקרו-דחף, הוסף טיפה של דבק ציאנואקרילט בעובי בינוני לממשק שבין כל tero לצינור הפולימר שלו.

פעולה זו תבטיח את קיבוע ה-tero למיקרו-דרייב שלו. מטרת מחבר ההגנה היא להגן על המיקרו-דרייבים ועל חוט ה-tero החשוף מפני הסביבה. הוא מספק גם תמיכה בזמן הטיפול במהלך הניסוי ומפחית רעש חשמלי.

אנו משתמשים בחרוט פלסטיק הודפס בתלת-ממד. עם זאת, ניתן להכין את החרוט מחומרים אחרים, כגון פיסת פחית משקה כפופה. ניתן לקחת את חרוט הפלסטיק ולהדביק סרט נייר אלומיניום למשטח הפנימי או החיצוני.

ראשית, הכנסו וסובבו חלקית 3 ברגים בגודל 1/72 ובאורך 3/16 אינץ' לצדדי החרוט כאשר מערך ההנעה תלוי. הכניסו את החרוט מעל ההנעה. ודאו ששני חוטי ההארקה בולטים מחלקו התחתון של מערך ההנעה.

לפפו את החלק החשוף של חוט ההארקה באורך ארבעה אינץ' מספר פעמים סביב אחד מהברגים בגודל 1 72 והדקו את הבורג. הדקו היטב את החרוט לבסיס ההנעה על ידי הידוק שני ברגי החרוט הנותרים. ייצור מערך המיקרו-דרייב הושלם כעת. מערך המיקרו-דרייב שלכם טעון ב-18 teros בשלושה רפרנסים.

הוא עטוף בחרוט ומכסה מגינים לצורך עמידות. הכונן המוגמר שוקל בדרך כלל בין 20 ל-25 גרמים, בממוצע.

את מערך המיקרו-דרייב המוגמר משתילים באמצעות פרוצדורה כירורגית סטנדרטית. כפי שניתן לראות, הדרייב מחובר לשבב קדם-מגבר ולצרור חוטים המעבירים את האות לחומרה ותוכנה של רכישת נתונים. כעת הצגנו בפניכם כיצד להכין תרס (teros) ולהשלים את פרוצדורת בניית מערך המיקרו-דרייב.

בסרטון זה, הצגנו כיצד לייצר teros, וכיצד להטעין ולהכין אותם להקלטה in vivo. בנוסף, הצגנו כיצד להוסיף חרוט למערך המיקרו-דרייבר (micro driver array) כדי להפוך אותו לעמיד לאורך זמן. בניית מערך המיקרו-דרייבר כוללת שלבים רבים, לכן היו סבלניים, התייחסו בעדינות לאלקטרודות וודאו שכל השלבי הביניים הושלמו כראוי.

תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסוייכם.