טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

פרוצדורה זו מתחילה בהסרת שאריות מתוך תמיסת נגיף השפעת באמצעות סנטריפוגה. לאחר מכן, קרום הנגיף מפורק באמצעות דטרגנט, ו-VR nps המשוחררים מופרדים על גבי מדרג גליצרול.

השברים של הצנטריפוגציה מהגרדיאנט נאספים ומריצים אליקווט מכל שבר. ב-SDS page, הג'לים נצבעים ב-kumasi blue כדי לקבוע את שברי השיא המכילים V nps. השברים המכילים V NPS מרוכזים לאחר מכן על ידי צנטריפוגיה, וה-VRPs המזוקקים מועברים לרשת דגימה של נחושת עבור TEM, אשר נצבעת לאחר מכן בצביעה שלילית להדמיה של ה-VRPs באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני חודר (transmission electron microscopy). שלום, אני WinCo Wu מהמעבדה של ד"ר Nellie Pane במחלקה לזואולוגיה באוניברסיטת קולומביה הבריטית.

אני לינדסיי וויבר, בעבר ממעבדת Pane. היום נדגים לכם פרוצדורה לניקוי של influenza, קומפלקסים של ריבנוקלאו-פרוטאין ויראליים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הייבוא הגרעיני של נגיף influenza A בתרביות תאים.

אם כן, נתחיל. כדי להתחיל בניסוי, העבירו 750 µL של מתוחית MNT לשפופרת צנטריפוגה מפוליקרבונט של Beckman במידה של 11 מילימטר על 34 מילימטר. לאחר מכן, הוסיפו לשפופרת 500 µL של תמיסה בריכוז 2 mg/mL של נגיף Influenza A, ובצעו שאיבה ושחרור חוזרת (pipetting) מספר פעמים כדי לערבב את הנגיף עם מתוחית ה-MNT.

לאחר הערבוב, מקמו את המבחנה ברוטור TLA one 20.2 וסובבו בצנטריפוגה מסוג Beckman Optima max E למשך 10 דקות ב-109,000 ×g בטמפרטורה של 4°C. בסיום הסבב, הסירו את הנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן השביו את המשקע (pellet) ב-500 µL של תמיסת פירוק (disruption buffer). ערבבו את המשקע שהושבה בריסקו (vortex) בעוצמה, ולאחר מכן נערנערה ב-31°C למשך 20 דקות ב-Eppendorf thermo mixer.

בסיום הנעירה, המשיכו לצנטריפוגציה במהירות שיקוע בגרדיאנט גליצרין. להכנת גרדיאנט הגליצרין, העבירו את כמויות הגליצרין הבאות לשפופרת צנטריפוגה מסוג Beckman UltraClear במידות 13 מילימטר על 51 מילימטר: 1 מיליליטר GLYCEROL בריכוז 70% נפח לנפח, 0.75 מיליליטר גליצרין בריכוז 50%, 0.375 מיליליטר גליצרין בריכוז 40%, ו-1.8 מיליליטר גליצרין בריכוז 33%. תמיסות גליצרין אלו מוכנות על ידי ערבוב גליצרין טהור עם NM buffer.

הכינו גם מבחנה מאזנת המכילה גליצרול ובופר. לאחר מכן, ערבבו שוב את דגימת הווירוס המפורקת באמצעות וורטקס והעמיסו אותה על מדרג הגליצרול. הניחו את המבחנה ברוטור מסוג swinging bucket מדגם Beckman MLS 50 וסבבו את המדרג בצנטריפוגה במשך שלוש שעות ו-45 דקות ב-217,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר סיום הסבוב במערך הצנטריפוגה, אספו ידנית אליקוטיות של 250 µL מהגרדיאנט, החל מהחלק העליון של המבחנה. שמרו את הפרקציות על קרח או בטמפרטורה של 4 °C. לאחר איסוף הפרקציות, ניתן לנתח אותן באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ב-SDS.

כדי להתחיל בניתוח ה-SDS page, העבירו 20 µL מכל פרקציה למבחנה נקייה. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של בופר לדגימות SDS page בריכוז 5x, וחממו את הדגימה ל-95 °C למשך חמש דקות. לאחר החימום, סובבו את הדגימות (spin down) לזמן קצר והעמיסו אותן על ג'ל Polyacrylamide בריכוז 10%; יש לכלול סממני משקל מולקולרי באחד הבארים. לאחר מכן, הריצו את הדגימות דרך הג'ל עד שצבע הטעינה brom phenol blue מגיע קרוב לתחתית הג'ל.

הוצא את הג'ל ממכשיר ה-SDS page וצבע את הג'ל ב-kumasi blue. בהתבסס על תוצאות הצביעה, זהה את הפראקציות המכילות בעיקר nucleo protein של influenza.

חלבון ה-NP של שפעת A הוא בגודל של כ-56 kilodaltons והוא החלבון העיקרי המצוי בקומפלקסים של ribonucleoprotein ויראליים. לכן, פס ה-NP הוא בדרך כלל הפס החזק ביותר במנות המכילות את ה-VRN ps. בחלק הבא, נרכז את מנות ה-VRNP הללו.

שלבו את פראקציות הגליצרול המכילות בעיקר NP, וחלקו אותן לשתי מבחנות צנטריפוגה מפוליקרבונט של Beckman בגודל 11 מילימטר על 34 מילימטר; מלאו כל מבחנה במים אולטרא-טהורים שעובדו ב-ethyl pyro carbonate או DEPC. לאחר מכן, בצעו שאיבות ופליטות (pipette up and down) מספר פעמים כדי לערבב. הניחו את המבחנות ברוטור Beckman TLA 120.2 וסובבו בצנטריפוגה במשך ארבע שעות וחצי ב-157,000 ×g בטמפרטורה של 4°C.

בסיום הסבוב, הסר את העלייה (supernatant) ותלה את המשקע. בתוך מניה של 50 µL מים שעובדו ב-DEPC, המבודדים של V NPS, הותר מניה אחת בצד ואת השאר אחסן ב-80°C- . כעת אנו מוכנים להמשיך לצביעה שלילית של VRPs.

דללו מיקרוליטר אחד של VRNP מופקת לתוך תשעה מיקרוליטרים של באפר PBS שהוכן טרי וסונן פעמיים; בצעו פריקה חשמלית (glow discharge) לסבב רשת דגימה של TEM נחושת למשך 30 שניות. רשת זו קושתה מראש עם Parlow Dion ומעטפת פחמן. בעזרת פינצטה לאחיזת רשת הדגימה לאחר הפריקה החשמלית, טפטפו טיפה של חמישה מיקרוליטרים של VRNP מדולל על רשת הדגימה.

המתן שמונה דקות כדי לאפשר לטיפה להיספג ברשת. הנח רצועה קטנה של parfum בתבנית, ולאחר מכן טפטף על ה-parfum שתי טיפות של 10 µL כל אחת של PBS buffer, וכן טיפה של 80 µL של תמיסת צביעה שהוכנה acabado, המורכבת מ-1% ammonium meli date. כעת שטוף את רשת הדגימה על ידי הורדה זהירה שלה אל תוך שתי טיפות ה-PBS למשך זמן כולל של דקה אחת.

לאחר מכן, השתמש בחתיכת נייר סינון כדי לספוג חלק מתמיסת הדגימה מרשת הדגימה, מבלי לאפשר לרשת להתייבש. מיד לאחר ספיגת טיפת התמיסה האחרונה מרשת הדגימה, טבול את הרשת לחלוטין בטיפת הצבע. המתן דקה אחת.

לאחר דקה אחת, השתמש בחתיכה חדשה של נייר סינון כדי לספוג לחלוטין את תמיסת הצביעה מרשת הדגימה. הנח לרשת הדגימה להתייבש באוויר למשך מספר דקות לפני התבוננות. תחת מיקרוסקופ אלקטרונים חודר, להלן תמונות מייצגות של מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת של V nps שנצבעו בצביעה שלילית.

כפי שניתן לראות כאן, ה-V NPS דומות לחלקיקים דמויי מוט באורך משתנה, שנע בקירוב בין 30 nanometers ל-120 nanometers. ה-NP האוליגומרי מאורגן כשרשרת של מולקולות NP המקופלת בהמשך למבנה חוזר של סליל כפול. לכן, לעיתים ניתן לראות לולאות בשני קצותיהם של חלקיקים דמויי מוט אלו.

הרגע הדגמנו כיצד לטהר ולהדגים קומפלקסים של ריבונוקלאואופרוטאין ויראלי של שפעת. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להימנע משימוש ב-PBS לדילול ה-vRNPs אם אתם משתמשים ב-uranyl acetate לצביעה שלילית.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.