Name: טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: חקור טיהור ויזואליזציה של מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי של שפעת A באמצעות צנטריפוגה ומיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבני מפורט של רכיבי וירוס השפעת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן קנדה עבור חדשנות (CFI), המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR), ואת למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC).

חלק 1: שיבוש של שפעת Virion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 750 μl של חיץ MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 מ&quot;מ טריס, pH 7.5) לתוך הגליל האחד פוליקרבונט צנטריפוגות Beckman (11 מ&quot;מ x 34 מ&quot;מ) נועדה להשתלב הרוטור TLA-120.2 לשימוש אופטימה Beckman Max-E ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של שפעת וירוס (H3N2 X-31 A/AICHI/68 זן, 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לתוך הצינור. מערבבים את הנגיף עם למאגר MNT ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 דקות על 109,000 XG, 4 ° C, צנטריפוגה אופטימה Max-E Beckman באמצעות הרוטור TLA-120.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend גלולה במאגר 500 שיבוש μl (100 מ&quot;מ KCl, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 5% (w / v) גליצרול, octylglucoside 50 מ&quot;מ, 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל lysolecithin, dithiothreitol 1.5 מ&quot;מ, 100 מ&quot;מ MES, pH 5.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במרץ, ולאחר מכן ללחוץ על 31 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות thermomixer Eppendorf. </li></ol> חלק 2: צבע גליצרול משקעים צנטריפוגה מהירות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שיפוע גליצרול על ידי הצבת את הסכומים הבאים של גליצרול לתוך צינור Beckman צנטריפוגות ultraclear (13 מ&quot;מ x 51 מ&quot;מ): 1 מ&quot;ל 70% (v / v) גליצרול, 0.75 מ&quot;ל גליצרול 50%, 0.375 מ&quot;ל גליצרול 40%, ו - 1.8 מ&quot;ל 33% גליצרול. פתרונות גליצרול מבוצעים על ידי ערבוב גליצרול טהור עם חיץ NM (150 mM NaCl, 50 מ&quot;מ MES, pH 5.5). כמו כן להכין צינור המכיל איזון גם גליצרול חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס שיבשו מדגם ויראלי שוב, לטעון אותו על השיפוע גליצרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שיפוע עבור 3.75 שעות 217.000 XG, 4 ° C, רוטור MLS-50-Beckman מתנדנד דלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה תושלם, ידני לאסוף 250 aliquots μl של שיפוע החל מהחלק העליון של הצינור. שמור שברים על הקרח או 4 ° C. </li></ol> חלק 3: ניתוח של שברים Gradient גליצרול על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה SDS polyacrylamide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 20 μl כל חלק מן לצינור טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של חיץ SDS-PAGE 5x המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את דגימות בקצרה ומעלים אותם על ג&#39;ל polyacrylamide 10%, והם כוללים סמנים משקל מולקולרי באחת הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הדגימות על הג&#39;ל עד לצבוע bromphenol טעינת כחול מגיע קרוב לתחתית הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם ג&#39;ל עם Coomassie כחול. </li></ol> חלק 4: ריכוז של שברים vRNP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את השברים גליצרול המכיל בעיקר NP, לשלב אותם, ולהפיץ אותם לשתי מבחנות צנטריפוגה Beckman פוליקרבונט (11 מ&quot;מ x 34 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כל צינור עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) שטופלו מים ultrapure ו pipet מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עבור 4.5 שעות ב 157,000 XG, 4 ° C, רוטור TLA-120.2 Beckman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 50 μl מים DEPC שטופלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, 280 של vRNPs מרוכז ניתן למדוד. כפי NP היא כיום מרכיב מרכזי אספו את השברים, אומדן molarity של NP יכול להיות מחושב באמצעות מקדם הכחדה של 55,350 M -1 cm -1 (כפי שנקבע באמצעות ProtParam 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot vRNPs מטוהרים, ולאחסן אותם קפואים ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> חלק 5: מכתים שלילי של vRNPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 1 μl של vRNP מטוהרים לתוך μl 9 של טרי מתוצרת מסונן, פעמיים חיץ MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 מ&quot;מ טריס, pH 7.5). מאגרים נוספים הם גם אישור כדי לדלל את vRNPs כדי לשטוף את הרשת הדגימה (שלב 5.5), אבל לא להשתמש PBS אם אצטט uranyl משמש מכתים שלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוהר פריקה טיפוס (TEM נחושת) מצופה בעבר עם parlodion הסרט פחמן למשך 30 שניות רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את רשת טרי זוהר משוחררים הדגימה עם פינצטה, ולהחיל על ירידה של 5 μl של vRNP מדולל על הרשת הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשאיר את טיפה של הדגימה על רשת במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, במקום רצועה קטנה של Parafilm על הספסל, ולחלק 2 טיפות המכילות 10 μl כל חיץ MNT (כדי לשטוף את הרשת), וירידה של 80 μl של הפתרון מכתים טריים (1% אמוניום molybdate או 1 uranyl אצטט%) על Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 8 דקות של ספיחה, הפתיל את חלק מהפתרון מדגם מרשת הדגימה עם פיסת נייר סינון (לחתוך למשולשים). אל תתנו את רשת הדגימה לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רשת הדגימה ב 2 טיפות המכילות 10 μl כל חיץ MNT זמן הכולל של דקה 1. הדבר נעשה על ידי הורדת בזהירות את הרשת הדגימה על ירידה, ולאחר מכן את הפתילה חלק מהפתרון מדגם מרשת הדגימה עם פיסת נייר סינון (בלי לתת את הרשת הדגימה יבש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הפתילה את הטיפה האחרונה של חיץ מרשת הדגימה, להשליםלצלול ly רשת הדגימה בתוך טיפה את הכתם ולהמתין 1 דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתיל לחלוטין את פתרון הכתם מן הרשת את הדגימה עם פיסת נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את רשת הדגימה לאוויר יבש במשך כמה דקות לפני תצפית במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. </li></ol> חלק 6: תוצאות נציג: <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_1/1105_Figure2.png" alt="איור 2" width="600" height="215" /> איור 1 כמו שפעת A NP (~ 56 KDA) הוא החלבון העיקרי המצוי מתחמי ribonucleoprotein ויראלי, הלהקה NP בדרך כלל היא הלהקה החזקה ביותר שברים המכיל את vRNPs (איור 1). בנוסף NP, כל vRNP שפעת מכיל גם עותק של פולימראז RNA מורכב trimeric (משקולות מולקולרית של kDa 82, 86 ו - 86.5). אלה עשויה או לא עשויה להיות גלוי על ידי מכתים כחול Coomassie בגלל השפע שלהם הוא נמוך בהשוואה לזה של NP. Polymerases, לעומת זאת, ניתן להבחין אם, במקום כחול Commassie כתם, כסף כתם של הג&#39;ל מתבצעת. מטריקס שפעת חלבון M1 (~ 28 KDA) צריכים להיות נוכחים מינימלית של שברים שבו שיא חלבון שברים NP נוכחים. <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_2/1105_3.png" alt="איור 3" width="600" height="360" /> איור 2 VRNPs שלילי מוכתם כמו דמיינו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים אמור להניב vRNPs הדומות מוט בצורת חלקיקים בעלי אורך משתנה, כי הם כ -30 ננומטר עד 120 ננומטר אורך (איור 2 א). NP oligomeric מאורגן כמו שרשרת של מולקולות NP כי הוא מקופל נוספת לתוך מבנה הסליל הכפול לחזור, אז לולאות משני קצותיו של מוט אלה חלקיקים דמויי לפעמים ניתן לראות (איור 2b).

<ol><li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> Virology. 202, 1028-1033 (1994).</li>
<li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> Virol J. 4, 49-49 (2007).</li>
<li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).</li>
</ol>

טיהור vRNPs מבוסס על ההליך המתואר על ידי קמלר et al. (1994). 1 אנו ואחרים משמשים גם בפרוטוקול זה על מנת לבודד vRNPs ללמוד לייבא הגרעין שלהם. 2,4,5 אנו ממליצים להשתמש RNase ללא טיפים וצינורות כאשר מניפולציה vRNPs כי הגנום הנגיפי מורכב של רנ&quot;א, ולכן הנשחק בקלות בנוכחות RNA. בנוסף, חוצצי כל צריך להיעשות במים כי הוא RNase חינם. הפרוטוקול המתואר כאן בוצע מיצוי חומצי (למשל, ה-pH של ל...

<table><tbody><tr><td>שפעת A מסוג H3N2 X-31 A/AICHI/68</td><td>Charles River Laboratories</td><td>490715</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8250</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>אוקטילגלוקוזיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O-8001</td><td></td></tr><tr><td>ליזולציטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4129</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותריטול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9779</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue G-250</td><td>Kodak</td><td>1367796</td><td></td></tr><tr><td>מים שעובדו ב-diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Invitrogen</td><td>750024</td><td></td></tr><tr><td>אורניל אצטט</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום מוליבדט</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה Optima MAX-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>434491</td><td></td></tr><tr><td>מארז רוטור MLS-50, דליים נתיכים</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>מכלול רוטור TLA-120.2, זווית קבועה, טיטניום</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>לאודה ברינקמן</td><td>022670000</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים ribonucleoprotein ויראלי

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

שפעת A הגנום הנגיפי מורכב תחושה שלילית ושמונה, יחיד מולקולות RNA תקועים, ארוזים בנפרד עם מספר עותקים של שפעת nucleoprotein (NP) לחלקיקים ribonulceoprotein ויראלי (vRNPs). VRNPs שפעת מוקפים בתוך מעטפת נגיפיים. במהלך כניסה לתא, לעומת זאת, קומפלקסים אלה vRNP משתחררים לתוך הציטופלסמה, שם הם לקבל גישה מכונות התחבורה גרעיני המארח. על מנת ללמוד את הייבוא ​​הגרעין של vRNPs שפעת שכפול של הגנום שפעת, כדאי לעבוד עם vRNPs מבודד כך רכיבים אחרים של הנגיף לא להפריע לתהליכים אלה. כאן אנו מתארים הליך לטהר אלה vRNPs משפעת וירוס. ההליך מתחיל עם הפרעה של שפעת virion עם דטרגנטים על מנת לשחרר את מתחמי vRNP מ virion אפף. VRNPs מופרדים אז מן המרכיבים האחרים של שפעת virion על שיפוע 33-70% גליצרול רציפה על ידי שקיעה מהירות. שברים המתקבל השיפוע גליצרול מנותחים לאחר מכן צביעה עם Coomassie כחול על דרך עמוד SDS. שברים השיא המכיל NP אז הם אספו יחד מרוכז על ידי צנטריפוגה. לאחר ריכוז, שלמות vRNPs הוא מאומת על ידי הדמיה של vRNPs ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים לאחר מכתים שלילי. טיהור הדרגתי גליצרול הוא שינוי כי מן קמלר<em&gt; Et al.</em&gt; (1994)<sup&gt; 1</sup&gt; ו מכתים השלילי שבוצעה על ידי וו<em&gt; Et al.</em&gt; (2007).<sup&gt; 2</sup

הגנום של שפעת וירוס כוללת שמונה מתחמים נפרדים של רנ&quot;א וחלבונים, כינה מתחמי ribonucleoprotein ויראלי (vRNPs). מאמר זה מתאר את שיפוע גליצרול טיהור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים להדמיה של שפעת vRNPs.

טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

גנום נגיף השפעת A מורכב משמונה מולקולות RNA בעלות גדיל יחיד בעל חוט מינוס (negative-sense), הארוזות בנפרד עם עותקים מרובים של השפעת A...

הליך זה מתחיל בהסרת שאריות מתוך תמיסת נגיף השפעת על ידי צנטריפוגציה. לאחר מכן, קרום הנגיף מפורק באמצעות דטרגנט, ו-VR nps שהשתחררו מופרדים במדרג גליצרין.שברי סבב (fractions) מהמדרג נאספים, ואליקוט מכל שבר מורץ. על ג'ל SDS-PAGE, הג'לים נצבעים ב-Coomassie Blue כדי לקבוע את השברים השיא המכילים V NPS; השברים המכילים V NPS מרוכזים לאחר מכן על ידי סבב, וה-VRPs המופקים מועברים לרשת דגימה של נחושת עבור TEM, אשר נצבעת לאחר מכן בצביעה שלילית להדמיה של ה-VRPs באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני חולף. שלום, אני WinCo Wu מהמעבדה של ד"ר Nellie Pane במחלקה לזואולוגיה באוניברסיטת קולומביה הבריטית.אני לינדזי וויבר, בעבר ממעבדת פיין. היום נדגים לכם הליך לניקוי של influenza, קומפלקסים של ריבו-נוקלאו-פרוטאין ויראליים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את הייבוא הגרעיני של נגיף influenza A בתרביות רקמה של תאים.בואו נתחיל. כדי להתחיל את הניסוי, העבירו 750 µL של MNT buffer לתוך פרועת צנטריפוגה אחת של Beckman מפוליקרבונט בגודל 11 מ"מ על 34 מ"מ. לאחר מכן, הוסיפו לפרועת 500 µL של תמיסה בריכוז 2 mg/mL של influenza A virus; שאיפו והוציאו את הנוזל עם הפפיטה מספר פעמים כדי לערבב את הווירוס עם ה-MNT buffer.לאחר הערבוב, מקמו את המבחנה ברוטור TLA one 20.2 וסובבו בצנטריפוגת Beckman Optima max E למשך 10 דקות ב-109,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. עם סיום הסבוב, הסירו את העילוי, ולאחר מכן השעיקו את המשקע ב-500 µL של disruption buffer. ערבבו את המשקע המושעה בחוזקה באמצעות וורטקס, ולאחר מכן נערנרו ב-31 °C למשך 20 דקות ב-einor thermo mixer.עם סיום הנעורה, המשיכו לסבב צנטריפוגה במהירות שיקוע במדרג גליצרול. כדי להכין את מדרג הגליצרול, העבירו את כמויות הגליצרול הבאות למבחנה של צנטריפוגה מסוג Beckman UltraClear בנפח 13 מילימטר על 51 מילימטר: 1 מיליליטר 70% (נפח לנפח) GLYCEROL,‏ 0.75 מיליליטר 50% glycerol,‏ 0.375 מיליליטר 40% glycerol, ו-1.8 מיליליטר 33% glycerol. תמיסות גליצרול אלו הוכנו על ידי ערבוב גליצרול טהור עם NM buffer.הכינו גם מבחנה מאזנת המכילה הן גליצרול והן תמיסת בופר. לאחר מכן, ערבלו שוב במערבל וורטקס (vortex) את דגימת הנגיף המרוסק והעמיסו אותה על מדרג הגליצרול. הניחו את המבחנה ברוטור מסוג swinging bucket מדגם Beckman MLS 50 וסובבו את המדרג בצנטריפוגה למשך שלוש שעות ו-45 דקות ב-217,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלמת הסריפוגציה, אספו ידנית מנות של 250 µL מהמדרג, החל מהחלק העליון של המבחנה. שמרו את הפראקציות על קרח או בטמפרטורה של 4 °C. לאחר איסוף הפראקציות, ניתן לנתח אותן באמצעות SDS poly acrylamide gel electrophoresis.כדי להתחיל את אנליזת ה-SDS page, העבירו 20 µL מכל פרקציה לשפופרת נקייה. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של באפר לדגימות SDS page בריכוז פי 5, וחממו את הדגימה ל-95 °C למשך חמש דקות. לאחר החימום, centrifugate את הדגימות קצרות והעמיסו אותן על ג'ל Poly acrylamide בריכוז 10% תוך הוספת סממני משקל מולקולרי לאחת הבארים. לאחר מכן, הריצו את הדגימות דרך הג'ל עד שצבע הטעינה brom phenol blue מגיע קרוב לתחתית הג'ל.הוצא את הג'ל ממכשיר ה-SDS page וצבע את הג'ל ב-kumasi blue. בהתבסס על תוצאות הצביעה, זהה את הפראקציות המכילות בעיקר נקלאו-פרוטאין של שפעת.חלבון ה-NP של שפעת A הוא בגודל של כ-56 kilodaltons והוא החלבון העיקרי הנמצא בקומפלקסים של ribonucleoprotein ויראליים. לכן, פס ה-NP הוא בדרך כלל הפס החזק ביותר בפרקציות המכילות את ה-VRNPs. בחלק הבא, נרכז את פרקציות ה-VRNP הללו.שלבו את פראקציות הגליצרול המכילות בעיקר NP, וחלקו אותן לשני מבחנות צנטריפוגה מפוליקרבונט של Beckman במידות 11 מילימטר על 34 מילימטר; מלאו כל מבחנה במים אולטרה-טהורים שעובדו ב-ethyl pyro carbonate או DEPC. לאחר מכן, בצעו פיפטינג מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב. הניחו את המבחנות ברוטור Beckman TLA 120.2 וסובבו בצנטריפוגה במשך ארבע שעות וחצי ב-157,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C.עם סיום הסבב, הסירו את העילאי ושחזרו את המשקע. חלקו את ה-V NPS המופק למנות של 50 µL של מים שעברו טיפול ב-DEPC; הניחו מנה אחת בצד ואת השאר אחסנו בטמפרטורה של 80- °C. כעת אנו מוכנים להמשיך לצביעה שלילית של ה-VRPs.דללו מיקרוליטר אחד של VRNP מטוהר לתוך תשעה מיקרוליטרים של באפר PBS שהוכן טרי ועבר סינון כפול; בצעו פריקה חשמלית (glow discharge) לרשת דגימה של נחושת עבור TEM למשך 30 שניות. רשת זו הייתה מצופה בעבר בשכבת Parlow Dion ופילם פחמן. בעזרת פינצטה לאחיזת רשת הדגימה לאחר הפריקה החשמלית, טפטפו טיפה של חמישה מיקרוליטרים של VRNP מדולל על רשת הדגימה.המתן שמונה דקות כדי לאפשר לטיפה להיספג ברשת. הנח רצועה קטנה של סבב (parfum) במגש, ולאחר מכן טפטף על הסבב שתי טיפות של 10 µL כל אחת של בופר PBS, וכן טיפה של 80 µL של תמיסת צביעה שהוכנה זה עתה, המורכבת מ-1% ammonium mellite. כעת שטוף את רשת הדגימה על ידי הורדתה בזהירות אל תוך שתי טיפות ה-PBS למשך זמן כולל של דקה אחת.לאחר מכן, השתמש בחתיכת נייר סינון כדי לספוג חלק מתמיסת הדגימה מרשת הדגימה, מבלי לאפשר לרשת להתייבש. מיד לאחר ספיגת טיפת הבאפר האחרונה מרשת הדגימה, טבול את הרשת לחלוטין בתוך טיפת הצבע. המתן דקה אחת.לאחר דקה אחת, השתמשו בחתיכה חדשה של נייר סינון כדי לספוג לחלוטין את תמיסת הצבע מרשת הדגימה. הניחו לרשת הדגימה להתייבש באוויר במשך מספר דקות לפני התצפית. תחת מיקרוסקופ אלקטרוני חודר, מוצגות כאן תמונות מייצגות של מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת של V nps בצביעה שלילית.כפי שניתן לראות כאן, ה-V NPS דומים לחלקיקים דמויי מוט בעלי אורך משתנה, שנע בקירוב בין 30 nanometers ל-120 nanometers. ה-NP האוליגומרי מאורגן כשרשרת של מולקולות NP המקופלת הלאה למבנה חוזר של סליל כפול. לכן, ניתן להבחין לעיתים בלולאות בשני קצותיהם של חלקיקים דמויי מוט אלו.הרגע הצגנו בפניכם כיצד לטהר ולחזות קומפלקסים של ריבנוקלאו-חלבון נגיפי (viral ribonucleoprotein complexes) של שפעת. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לא להשתמש ב-PBS בעת דילול ה-vRNPs אם אתם משתמשים ב-uranyl acetate לצביעה שלילית.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

purification-visualization-influenza-viral-ribonucleoprotein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. זוהי טכניקה אמין מבוסס על אינטראקציה בין חרוזים מגנטיים החלבונים המתויגים (למשל Nanobodies) מצד אחד, את הזיקה בין חלבון מתויג החלבון השני, שכותרתו (poliovirus למשל) מצד שני.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

נגיפי שפעת לשכפל גנום הרנ"א שלהם בשיתוף עם הכרומטין מארח תאים. כאן, אנו מציגים שיטה לטיהור שלמים מתחמי ribonucleoprotein ויראלי של הכרומטין של תאים נגועים. מטוהרים מתחמי ויראלי יכול להיות מנותח על ידי כתם הן המערבי תחל הרחבה של חלבון ותוכן RNA, בהתאמה.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

פרוטוקול קו-אימונו-משקעים זה מאפשר לחקור את האינטראקציה בין נוקלאופרוטאין של נגיף השפעת A לבין החלבון האנטי-ויראלי Mx1 בתאים אנושיים. הפרוטוקול מדגיש את החשיבות של N-ethylmaleimide להצלחה של קו-אימונו-משקעים של Mx1 ונוקלאופרוטאין של נגיף השפעת A.

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

אנו מספקים אסטרטגיה חדשה לבידוד תאי שכפול ויראלי (RC) מתאים אנושיים נגועים באדנו-וירוס (Ad). גישה זו מייצגת מערכת נטולת תאים שיכולה לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את שכפול הגנום הנגיפי וביטויו, כמו גם ויסות האינטראקציות הוויראליות-מארח שהוקמו ב-RC.

בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus

פירוק ליבות נגיף שפעת A במהלך כניסת הנגיף לתאי המארח הוא תהליך רב-שלבי. אנו מתארים שיטה במבחנה לניתוח השלבים המוקדמים של הסרת ציפוי נגיפי. בגישה זו, צנטריפוגה בשיפוע מהירות משמשת לניתוח ביוכימי של השלבים המתחילים הסרת ציפוי בתנאים מוגדרים.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.

ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

מחקר זה מתאר   מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

אניון להחליף שיטה מבוססת-שרף, הותאם לנוזל הוכח bioaerosol מבוסס-impingement דגימה של וירוסים. כאשר יחד עם זיהוי מולקולרי במורד הזרם, השיטה מאפשרת גילוי נתיישב ורגיש של וירוסים bioaerosols.

זיהוי של וירוסים Bioaerosols באמצעות אניון Exchange שרף

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד נתונים של נגיפי שפעת שצולמו באמצעות טומוגרפיה קריו-אלקטרונית וממוצע תת-טומוגרפיה לאחר מכן של גליקופרוטאין המגלוטינין. פרוטוקול זה מכסה עיבוד נתונים שלב אחר שלב, החל מעיבוד מקדים של תמונה ועד לליטוש המודל הסופי.

קביעה מבנית ברזולוציה תת-ננומטרית של המגלוטינין מטומוגרפיה קריו-אלקטרונית של נגיפי שפעת

חקור טיהור ויזואליזציה של מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי של שפעת A באמצעות צנטריפוגה ומיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבני מפורט של רכיבי וירוס השפעת.

טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

גלה סרטונים נוספים