שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית
February 6th, 2009
כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.
להפיק רישומים אלקטרופיזיולוגיים יציבים מצמתים עצביים-שריריים של זחלי ג'וף. ראשית יש לנתח זחל כדי לחשוף את דופן הגוף, השרירים ומערכת העצבים לפני ההקלטה. האקסונים בבסיס מערכת העצבים המרכזית נחתכים מאחור לגנגליון הגחוני.
לאחר מכן מניחים אלקטרודת הקלטה על השריר המעניין ואלקטרודה מגרה ממוקמת ליד הנוירונים המוטוריים העצבניים. האקסונים המנותקים של הנוירונים המוטוריים נשאבים לתוך הפיפטה המגרה. לאחר מכן ניתן לרשום פוטנציאלים של צומת מעורר.
היי, אני וונדי MLA ממעבדת מקייב במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה תאית באוניברסיטת קולומביה. היום נראה לכם נוהל למדידת העברת טיקים בצומת העצבי-שרירי של לבה מהונדסת גנטית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור פיזיולוגיה סינפטית והולכה עצבית.
אז בואו נתחיל. כדי להתחיל את הניסוי, נתחו זחלי שלישי וכוכב נודדים כדי לחשוף את דופן הגוף. פרוטוקול זה מותאם לניסויים אלקטרופיזיולוגיים על ידי שימוש בפיני חיתוך קצרים.
אורכם כשניים עד ארבעה מילימטרים ויש להם פחות סיכוי לפגוע במטרת המיקרוסקופ באלקטרודות במהלך הניסוי. לאחר חשיפת דופן הגוף, השתמש במלקחיים כדי להחזיק את מערכת העצבים המרכזית ולהרים אותו מעט. ואז חתוך את האקסונים המוטוריים העצביים ההיקפיים והסר את המוח.
לאחר הסרת שטיפת המוח יש לבצע את ההכנה המנותחת פעמיים עם מאגר HL 3.1 עם סידן מילי-מולרי אחד. כעת, לאחר שהדיסקציה הושלמה, ניתן לבצע הקלטות תוך-תאיות מתאי שריר הזחל. הנח את לוחית החיתוך על המיקרוסקופ האלקטרופיזיולוגיה וטבל את ההכנה עם מאגר HL 3.1 בתוספת סידן.
ואז תקן את אלקטרודת האמבטיה כך שהיא תהיה במגע עם התמיסה. אלקטרודת היניקה משמשת לגירוי העצבים ההיקפיים המעצבנים את השריר. מקם תחילה את אלקטרודת היניקה בצלחת כדי למנוע רעידות כאשר האלקטרודה התוך תאית מונחת על השריר.
ברגע שהאלקטרודה נמצאת בצלחת, מקם אותה קרוב לנוירון המוטורי שמעצבב את שריר 6. בקטע הבטן השלישי, הפעל יניקה עדינה עד שהעצב החתוך נמצא בתוך פיפטת הזכוכית. היזהר לא למתוח את העצבים בעת הפעלת יניקה.
הרם מעט את הפיפטה כך שהיא לא תיגע בשריר. ואז מקם אותו כך שהוא לא מושך את סיבי העצב החתוכים. לאחר שאלקטרודת היניקה נמצאת במקומה, מקם את אלקטרודת ההקלטה עבור ההקלטות התוך תאיות.
השתמש במיקרו אלקטרודה חדה מלאה בשלושה אשלגן כלורי מולארי. מקם את אלקטרודת ההקלטה מעל מרכז השריר השישי. התאם את היסט הקלט כך שיקרא אפס עבור תמיסת האמבטיה.
הורד לאט את האלקטרודה והתקרב לשריר בהגדלה אופטית גבוהה עד שהוא נוגע במשטח השריר. כדי לאשר שהשריר נפרץ, צפו באוסילוסקופ. פוטנציאל הממברנה במנוחה צריך להיות לפחות 60 מילי-וולט שלילי.
פוטנציאל nplate מיניאטורי ספורדי אמור להיות גלוי כעת. לאחר שאלקטרודת ההקלטה נמצאת במקומה, תנו לתאים להתייצב למשך דקה אחת. לפני תחילת ההקלטות, השתמש באקסון HS שתיים, שלב ראש במגבר מהדק ציר שני B כדי לזהות שינויים בפוטנציאל הממברנה.
מהדק הציר שני B הוא ממשק למחשב המפעיל תוכנת מהדק P דרך נתוני הספרות. 1322 A, שהופך את האות לדיגיטלי. רשום את פוטנציאל הממברנה במחשב. עם תוכנת מהדק X, הפעל גירויים על האקסון המוטורי כדי ליצור פוטנציאל ממברנה מעורר או ejs.
לאחר יצירת ה-ejs, הקלט את ה-ejs המיניאטורי במשך תקופה של שלוש דקות ללא סינפסה של גירויים. ניתן להשתמש בתוכנת ניתוח מיני רכה כדי לנתח את העקבות ולקבוע משרעת ותדירות מיני EJP. כדי ליצור ejs.
השתמש במחולל פולסים מאסטר שמונה כדי לעורר לקצה המנותק של תוכנית נוירונים מוטוריים. הגנרטור לספק תוכנית פולסים של מתח מרובע של 0.3 אלפיות השנייה. מרווח זמן של חמש שניות בין גירויים כדי לאפשר התאוששות סינפטית.
ב- NMJ רשום לפחות 10 פוטנציאלים מעוררים מכל שריר וממוצע המשרעות. איור זה מציג עקבות טיפוסיים שתועדו משריר 6 של זחל סאל מסוג בר עם תגובות EJP מעוררות ומיני EJ.PS ספונטניות זה עתה הראינו לכם כיצד לרשום פוטנציאל cy מהצומת העצבי-שרירי של לבה דרוזופילה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשלים את הדיסקציה תוך שלוש עד 10 דקות ולהתחיל את ההקלטות האלקטרופיזיולוגיות מיד כשהתאים עדיין בריאים ומגיבים.
אם הדיסקציה נמשכת זמן רב מדי, פוטנציאל הממברנה במנוחה של תאי השריר יהיה פחות ממינוס 60 מילי-וולט, שהוא נמוך מכדי לרשום אותו. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת העברת סינפסות בצומת העצב-שריר (NMJ) של זחלי Drosophila. התהליך כולל ניתוק הזחלים כדי לחשוף את דופן הגוף ומערכת העצבים, ואחריו הצבת אלקטרודות הקלטה וגירוי כדי למדוד פוטנציאל צומת עוררות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- נוירולוגיה
- העברת סינפסות
רקע
- הבנת העברת סינפסות היא חיונית לתובנות בתקשורת עצבית.
- זחלי Drosophila משמשים כאורגניזם מודלי לחקר NMJ.
- טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מאפשרות מדידה מדויקת של פעילות סינפטית.
- שחרור מושהה ב-NMJ יכול להיות מגורה באופן מלאכותי לצורך ניתוח.
מטרת המחקר
- להדגים שיטות לרישום העברת סינפסות ב-NMJ.
- לספק פרוטוקול לחוקרים המעוניינים בלימודים אלקטרופיזיולוגיים.
- להעמיק את ההבנה של מנגנוני איתות עצב-שריריים.
שיטות ששימשו
- ניתוק של זחלי Drosophila כדי לחשוף שרירים ומערכת עצבים.
- הצבת אלקטרודות הקלטה על השריר המעניין.
- שימוש באלקטרודות גירוי ליד נוירונים מוטוריים.
- רישום של פוטנציאלים צומתיים עוררים לאחר גירוי.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של העברת סינפסות ב-NMJ.
- הדגמה של פוטנציאלים צומתיים עוררים מושהים.
- אימות של הגישה האלקטרופיזיולוגית לחקר NMJ.
- תובנות לגבי הדינמיקה של איתות סינפטי ב-Drosophila.
מסקנות
- השיטות המתוארות מספקות גישה אמינה לחקר העברת NMJ.
- הקלטות אלקטרופיזיולוגיות יכולות לחשוף היבטים חשובים של תפקוד סינפטי.
- מחקר זה תורם להבנה הרחבה יותר של אינטראקציות עצב-שריריות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Electrophysiological recording at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ) provides a genetically tractable, quantitative platform for interrogating synaptic function and neurotransmission. This model enables high-confidence target validation and mechanistic de-risking in early discovery, supporting predictive assessment of synaptic modulation and genetic perturbations. The approach is directly relevant for portfolio teams seeking robust, reproducible systems for neurobiology-driven drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of synaptic transmission and quantal content for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating genetic or pharmacological effects on neurotransmission.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of synaptic pathways in a defined, manipulable system.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible assay for quantifying excitatory junction potentials (EJPs) and miniature EJPs (mEJPs).
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across genetic backgrounds or compound treatments.
- Enables preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant synaptic mechanisms for translational continuity in neurobiology programs.
- Supports risk-adjusted advancement by providing predictive data on synaptic function and modulation.
- Offers a bridge from genetic discovery to preclinical validation in neuromuscular and synaptic disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This electrophysiological method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, enabling iterative hypothesis testing and mechanistic evaluation.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification by quantifying synaptic responses to defined manipulations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of EJP amplitude and frequency for robust assay development.
- Analytics: Provides digitized, statistically analyzable data for cross-condition and cross-genotype comparisons.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant synaptic endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, genetically flexible platform for ongoing neurobiology and synaptic function studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic target validation.
- Operational Value: Standardizes electrophysiological workflows for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage based on quantitative synaptic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology-focused assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology and Drosophila genetics for optimal execution.
- Demands specialized instrumentation, including microelectrodes, amplifiers, and digitization hardware.
- Necessitates cross-team standardization of dissection and recording protocols for reproducibility.
- Adaptable to various genetic backgrounds and experimental manipulations within the Drosophila system.
- Limited to model organism context; translational extrapolation requires careful validation.
