Name: שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: למד שיטות אלקטרופיזיולוגיות להקלטת פוטנציאלי חיבור מעוררים בזחלי Drosophila. הפרוטוקול כולל ניתוח חשיפת שרירים ומערכת עצבים, הצבת אלקטרודות הקלטה וגירוי, ומדידה מדויקת של מוליכות סינפטית ב-NMJ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

לפני שמתחילים להכין: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנודד yhird instar הזחלים תסיסנית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HL3.1 (השתנה hemolymph דמוי) פתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sylgard (גומי סיליקון שקוף) צלחות לנתיחה שהוכנו קטן (35 x 10 מ&quot;מ) צלחות פטרי מפלסטיק בשיטות שתוארו על ידי ברנט מקייב (2008) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור סיכות לנתיחה קצר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גירוי pipettes אלקטרודה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטה pipettes שארפ </li></ul> HL3 פתרון: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך והניתוחים וניסויים אלקטרו, הזחל שקועים פתרון HL3.1 2 המכיל (מ&quot;מ): 70 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalose, 115 סוכרוז, ו 5 HEPES, pH 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוזים של CaCl 2 מתווספים פתרון HL3.1 כדי לספק את הריכוז הדרוש של תאי Ca 2 +. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזחל והניתוחים מבוצעים על Ca 2 + בריכוז נמוך (כדי למנוע התכווצות שרירים) באמצעות HL3.1 + 0.25 mM CaCl 2, שמרה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים אלקטרו נרשמות בדרך כלל HL3.1 + 1 mM CaCl 2, אבל זה יכול להיות מותאם 0.4-1 mM Ca 2 + כנדרש. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון HL3.1 מעוקר לסנן לפני השימוש, ומאוחסנים ב 4 ˚ C. </li></ol> הכנת מגרה הקלטה pipettes: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes הקלטה מגרה נמשכים עם P-2000 סאטר חולץ מבוסס לייזר micropipette באמצעות ההגדרות הבאות: חום = 390, נימה = 4, מהירות = 35, עיכוב = 200 ו - Pull = 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות גירוי מוכנים מן דק דופן בורוסיליקט זכוכית נימים עם קצוות רחב כי היו מעט גדולים יותר מאשר רוחב של אקסונים המנוע ניתק. מסתיים בצורת הם firepolished לתת גימור חלק (בעזרת פיפטה Narashiga לטש), כדי למזער פגיעה בעצב. אלקטרודות גירוי מלאים פתרון אמבטיה (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות ההקלטה מוכנים מן הכוס בורוסיליקט 1.2 מ&quot;מ, אשר משך להקים פיפטה חדה (30-60 mΩ), ומלא 3M KCl. </li></ol> חלק 1: Dissection של הזחלים תסיסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלישי הזחלים instar נדודים הם גזור לחשוף את שרירי הגוף הקיר כפי שתואר לעיל 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והניתוחים המבוצעים HL3.1 + 0.25 mM Ca 2 + על לוחות סיליקון קטן (35 x 10 מ&quot;מ). HL3.1 הפתרון חייב להיות קר כקרח עבור והניתוחים על מנת לטשטש את הזחל, והוא שמר על הקרח לפני ובמהלך והניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזחלים הם גזור בשיטות שתוארו על ידי ברנט מקייב (2008), כי הוא שונה עבור ניסויים electrophysiology ידי הוספת 0.25 mM Ca 2 + פתרון HL3.1 את הנתיחה, וכן באמצעות סיכות לנתיחה קצר (~ 2 מ&quot;מ אורך), כי הם פחות סביר פגע אובייקטיבי מיקרוסקופ ואלקטרודות במהלך ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לנתיחה, אקסונים את המנוע של הזחלים נותקו. הדבר נעשה על ידי בעדינות מחזיק את מערכת העצבים המרכזית והעלאת זה כל כך מעט העצבים ההיקפיים כי innervate את השרירים האחוריים עד הגנגליון הגחון ניתן לקצץ מבלי לפגוע בשרירים (איור 1). המוח הוא הוסר לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה הזחל גזור נשטף פעמיים עם HL3.1 + 1 mM Ca 2 +. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1109/fig1.png" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי המציג את הצעדים הכרוכים חיתוך האקסונים המנוע של הזחלים גזור. CNS היא הרים עם מלקחיים את האקסונים מנוע נחתכים בבסיס המוח. חלק 2: הקלטות תאיים מתאי השריר הזחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת לנתיחה על המיקרוסקופ electrophysiology ו להטביע את הכנה עם HL3.1 + 1.5 מ&quot;מ Ca 2 + ולתקן את האלקטרודה אמבטיה כך במגע עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניסויים מבוצעים על השריר 6 במגזר הבטן השלישי (A3). העצבים ההיקפיים כי innervate השרירים הם גירוי באמצעות אלקטרודה יניקה 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום האלקטרודה מגרה בצלחת הראשונה, כדי למנוע תנודות כאשר האלקטרודה תאיים נמצא במקום. מניחים את האלקטרודה מגרה באזור קרוב הנוירון המוטורי innervating שריר 6 וליישם שאיבה עדינה עד עצב הוא לחתוך בתוך פיפטה מזכוכית. היזהרו לא למתוח את העצבים כאשר יניקה מוחל. הרם את פיפטה מעט כך שזה לא נוגע שריר ומקם אותה כך שזה לא מושך על סיבי העצב בסלע (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/1109/fig2.png" alt="איור 2" width="600" height="296" /> איור 2. סכימטי של השרירים ועל הנוירונים המנוע innervating קטע אחד של הבטן מתוך הגולם תסיסנית. המיקום של פיפטה מגרה עצבים ניתקה את האלקטרודה הקלטה במצב בו השרירים 6 מומחשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוךהקלטות הסלולר עשויים עם microelectrodes חדה מלא 3M KCl. מיקום האלקטרודה הקלטה מעל מרכז שרירים 6 בקטע בטן השלישי (A3) ולהתאים את הקלט לקזז כך קורא אפס לפתרון אמבטיה. לאט לאט להוריד את האלקטרודה ואת הגישה את השריר תחת הגדלה אופטית גבוהה עד שזה נוגע משטח השרירים. צפה אוסצילוסקופ כדי לאשר את השריר כבר חדרו. פוטנציאל הממברנה מנוחה צריך להיות לפחות -60 mV, או בעל חיים לא אמור לשמש. ספוראדי הפוטנציאלים endplate מיניאטורי כעת אמור להיות גלוי. השאר את התא כדי לייצב למשך דקה אחת לפני שמתחילים להקליט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינויים בפוטנציאל הממברנה מזוהים עם הבמה אקסון HS-2A ראש מגבר 2B Axoclamp והקליט עם Clampex v 8.2.0.235 (אקסון מכשירים). 2B Axoclamp הוא interfaced למחשב שמפעיל תוכנה pCLAMP ועובד בשיתוף עם ממשק Digidata 1322A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נרשמו במשך 3 דקות בלי שום גירויים כדי למדוד את התגובות mEJP. עקבות נותחו באמצעות תוכנת ניתוח מיני (Synaptosoft, v 6.0.3) לבין המשרעת בתדירות mEJP ונחוש. </li></ol> גירוי עצבי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסוף הכרות של הנוירון המוטורי מגורה עם סדרה של פולסים מתח מרובע (0.3 משך ms) בעצימות כי די בשני אקסונים מוטוריים, לעורר תגובות עקבית השריר כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגירוי נוצר עם גנרטור מאסטר 8-הדופק, אשר מתוכנת לספק פולסים ברציפות על פי משך הזמן ושעות ההפסקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר חמש שניות בין גירוי להתאוששות הסינפטי על NMJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת קביעת עוצמת הגירוי, מתחילים ברמה הנמוכה ביותר ולהגדיל את העוצמה באיטיות על מספר ניסויים. עוצמת הגירוי המינימלית כי התוצאות בתגובה עורר אמור לשמש בניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עוצמת הגירוי המתאים הוא הגיע, צריך להיות אחד EJP מתחם אחד התכווצות שרירים שעורר הגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא לפחות 10 הפוטנציאלים עורר מן השריר כל הממוצע אמפליטודות. </li></ol> חלק 3: תוצאות נציג <img src="/files/ftp_upload/1109/fig3.png" alt="דמות 3" width="600" height="358" /> איור 3. ההקלטה תאיים נציגת שריר 6 מראה את זה הוא עורר EJP בתגובה גירוי חשמלי של עצב סגמנטלי, ואת הפוטנציאלים ספורדיים endplate מיניאטורי, או mEJP של. EJP אמפליטודות בשריר 6 של הזחלים wild-type בריאים, כגון S קנטון, הם בדרך כלל סביב 40 ​​mV ואת אמפליטודות mEJP בין 1-3 mV.

<ol><li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li>
</ol>

השיטות שתוארו כאן לספק דרך מהירה יחסית רחבה כדי לזהות שינויים בתפקוד סינפטי ב NMJ. היכולת לבצע הקלטות אלקטרו באמצעות בעלי חיים שלמים in vivo, ולבצע מניפולציות גנטיות או תרופתי, לעשות תסיסנית מודל חיה אידיאלית לחקר היבטים פיזיולוגיים הגנטי של עצבית. מכיוון שתאי השריר הם גדולים מאוד, חלקם אולי מעדיפים להוסיף צעד נוסף לפרוטוקול זה שתי מתח הקלטה אלקטרודה (TEVC) מהדק. זה יכול להתבצע על הכנת הזחל אותו עם האלקטרודה תאיי...

<table><tbody><tr><td>צלחות פטרי קטנות (35 x 10 mm)</td><td>BD Biosciences</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון SYLGARD 182</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>475002-9902</td><td></td></tr><tr><td>תאורה למיקרוסקופ</td><td>Schott AG</td><td>KLI500</td><td></td></tr><tr><td>סיכות דיסקציה</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת pClamp 9</td><td>Molecular Devices</td><td>PCLAMP 9 STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>מספרי דיסקציה: מספרי קפיץ Vannas 3mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-0</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>קפילריות זכוכית בורוסיליקט דקות-דופן, עם פילמנט (1.0 mm, 4 in)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>קפילריות זכוכית בורוסיליקט, עם פילמנט (1.2 mm, 4 in)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות מבוסס לייזר Sutter P-2000</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-2000</td><td></td></tr><tr><td>מלטש פיפטות</td><td>Narishige International</td><td>MF-83</td><td></td></tr><tr><td>ראש Axon HS-2A</td><td>Molecular Devices</td><td>Model HS-2A</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטורים</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td></td></tr><tr><td>מגבר Axoclamp 2B</td><td>Molecular Devices</td><td>AXOCLAMP 2B</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Clampex</td><td>Molecular Devices</td><td>v 8.2.0.235</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Mini analysis. v 6.0.3</td><td>Synaptosoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגבר דיוק Brownlee</td><td>Brownlee</td><td>Model 410</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker/VWR</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p-9333</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6297-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TO167</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp220-212</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>h-3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>m2670-1kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>c79-500</td><td></td></tr><tr><td>מחולל פולסים Master-8</td><td>A.M.P.I</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שולחן רעידות להקמת מערכת אלקטרופיזיולוגית</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלוב פאראדיי</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים synaptic מן nmj של הזחלים תסיסנית

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטות אלקטרו הקלטה בשידור סינפטי בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחל תסיסנית. מערכת הזחל neuromuscular היא סינפסה מודל לחקר הפיזיולוגיה עצבית הסינפטי ו, ו הוא כלי מחקר חשוב זה הגדיר גנטיקה נגיש מניפולציה ניסויית. הזחלים יכולים להיות גזור כדי לחשוף את הגוף קיר השרירים, מערכת העצבים המרכזית ומערכת העצבים ההיקפית. שרירי תסיסנית דפוס העצבוב שלהם מאופיינים היטב את שרירי קל לגשת להקלטה תאיים. שרירים בודדים ניתן לזהות על ידי מיקומם ואת כיוון בתוך 8 קטעים בטן, כל אחד עם 30 השרירים מסודרים דפוס זה חוזר על עצמו בקטעים A2 - A7. גזור הזחלים תסיסנית הם שרירי רזה הפרט צרורות של אקסונים הנוירון המוטורי ניתן דמיינו ידי שקוף<sup&gt; 1</sup&gt;. בונה טראנסגנטי ניתן להשתמש בתווית תאים היעד לצורך זיהוי חזותי או מניפולציה מוצרים גנים ברקמות ספציפיות. ב זחלים, צומת מעוררים פוטנציאלים (EJPs) נוצרות בתגובה לשחרר שלפוחי של גלוטמט מן motoneurons ב הסינפסה. ב הזחלים גזור, EJP ניתן להקליט בשריר עם אלקטרודה תאיים. פוטנציאל פעולה יכול להיות עורר באופן מלאכותי הנוירונים המנוע, כי כבר לחתוך האחורי אל הגנגליון הגחון, להיגרר פיפטה כוס ידי יניקה עדין מגורה עם אלקטרודה. אלו הנוירונים המנוע יש סף ירי נפרדים כאשר מומרץ, וכשהם אש זמנית, הם מייצרים תגובה בשריר. האותות משודרים ברחבי סינפסה NMJ ניתן להקליט בשרירים כי הנוירונים המנוע innervate. EJPs מיניאטורי הפוטנציאלים צומת מעוררים (mEJPs) נתפסים שינויים פוטנציאל הממברנה. התגובות אלקטרו נרשמות בטמפרטורת החדר בפתרון שונה hemolymph כמו מינימלי<sup&gt; 2</sup&gt; (HL3) המכיל 5 מ&quot;ג mM<sup&gt; 2 +</sup&gt; ו - 1.5 mM Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;. שינויים משרעת של EJPs עורר יכול להצביע על הבדלים בתפקוד המבנה הסינפטי ו. הקלטות סרוקים מנותחים עבור EJP אמפליטודה, תדירות mEJP ואת משרעת ותוכן quantal.

כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

בסרטון זה, אנו מתארים את השיטות האלקטרופיזיולוגיות להקלטה של תמסורת סינפטית בחיבור העצבי-שרירי (NMJ) של זחל Drosophila. ...

כדי להפיק רישומים אלקטרופיזיולוגיים יציבים מצומת עצב-שריר של פקעות Joof. ראשית, יש לבצע דיסקציה של הפקעה כדי לחשוף את דופן הגוף, השרירים ומערכת העצבים לפני הרישום. יש לחתוך את האקסונים בבסיס ה-CNS אחורית לגנגליון הוונטרלי.לאחר מכן, מניחים אלקטרודת רישום על השריר הנבדק ואלקטרודת גירוי בקרבת הנוירונים המוטוריים המעצבבים אותו. האקסונים הקטועים של הנוירונים המוטוריים נשאבים אל תוך פיפטת הגירוי. לאחר מכן ניתן לרשום פוטנציאלי צומת מעוררים.שלום, אני Wendy MLA ממעבדת McCabe במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה תאית באוניברסיטת קולומביה. היום נדגים לכם פרוטוקול למדידת תמסורת סינפטית בצומת העצבי-שרירי של GE lava. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו כדי לחקור פיזיולוגיה סינפטית ותמסורת עצבית.אם כך, נתחיל. כדי להתחיל בניסוי, בצעו דיסקציה של זחלים בשלבי wandering third ו-star כדי לחשוף את דופן הגוף. פרוטוקול זה הותאם לניסויי אלקטרופיזיולוגיה באמצעות שימוש בסיכות דיסקציה קצרות.אלה הם באורך של כ-שני עד ארבעה מילימטרים, והסבירות שהם יפגעו בעדשת המיקרוסקופ או באלקטרודות במהלך הניסוי נמוכה יותר. לאחר חשיפת דופן הגוף, השתמש בפינצטה כדי להחזיק את ה-CNS ולהרים אותו מעט. לאחר מכן, חתוך את האקסונים המוטוריים של העצבים ההיקפיים והסר את המוח.לאחר הוצאת המוח, שטפו את הדגימה המנותחת פעמיים בבופר HL 3.1 עם 1 mM סידן. כעת, לאחר השלמת הניתוח, ניתן לבצע הקלטות תוך-תאיות מתאי השריר של הזחלים. הניחו את פלטת הניתוח על מיקרוסקופ האלקטרופיזיולוגיה והטבילו את הדגימה בבופר HL 3.1 בתוספת סידן.לאחר מכן, קבעו את אלקטרודת האמבט כך שתהיה במגע עם התמיסה. אלקטרודת היניקה משמשת לעיבור של העצבים ההיקפיים המעצבבים את השריר. מקמו תחילה את אלקטרודת היניקה בצלחת כדי למנוע רעידות בעת הנחת האלקטרודה התוך-תאית על השריר.ברגע שהאלקטרודה נמצאת בצלחת, מקמו אותה קרוב לנוירון המוטורי המעצב את שריר שש. במקטע הבטני השלישי, הפעילו שאיבה עדינה עד שהעצב החתוך ייכנס לתוך הפיפטה מזכוכית. היזהרו לא למתוח את העצבים בעת הפעלת השאיבה.הרם את הפ pipette מעט כך שלא תיגע בשריר. לאחר מכן, מקם אותה כך שלא תמשוך את סיבי העצב החתוכים. ברגע שאלקטרודת היניקה במקומה, מקם את אלקטרודת ההקלטה עבור ההקלטות התוך-תאיות.השתמשו במיקרו-אלקטרודה חדה הממולאת ב-potassium chloride בריכוז three molar. מקמו את אלקטרודת ההקלטה מעל מרכז שריר שש. כווננו את ה-input offset כך שירשום אפס עבור תמיסת הרחצה.הורד לאט את האלקטרודה והקרב אותה אל השריר תחת הגבלה אופטית גבוהה עד שהיא תיגע במשטח השריר. כדי לוודא שהאלקטרודה חדרה לשריר, עקוב אחר האוסצילוסקופ. פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה צריך להיות לפחות 60- millivolts.כעת אמור להיות נראה פוטנציאל מנוחה מינימלי ספורדי. לאחר שהאלקטרודה להקלטה במקומה, המתן דקה לייצוב התאים. לפני תחילת ההקלטות, השתמש ב-axon HS two, head stage ובמגבר axle clamp two B כדי לזהות שינויים בפוטנציאל הממברנה.מתג clamp two B מחובר למחשב המריץ את תוכנת P clamp באמצעות ה-digit data. 1322 A, הממיר את האות לערכים דיגיטליים. רשום את פוטנציאל הממברנה במחשב PC. באמצעות תוכנת clamp X, החל גירויים על האקסון המוטורי כדי ליצור פוטנציאלים ממברנתיים מעוררים או ejs.לאחר יצירת ה-ejs, הקליטו את ה-ejs המיניאטוריים לאורך תקופה של שלוש דקות ללא סינפסיס של גירויים. ניתן להשתמש בתוכנת Soft mini analysis כדי לנתח את העקבות ולקבוע את האמפליטודה והתדירות של ה-mini EJP. כדי ליצור ejs.השתמש במחולל פולסים ראשי בן שמונה ערוצים כדי לעורר את הקצה הקטוע של נוירון מוטורי. הגדר את המחולל למסירת פולסי מתח ריבועיים של 0.3 millisecond. הגדר מרווח של חמישה שניות בין הגירויים כדי לאפשר התאוששות סינפטית.בצומת העצבי-שרירי (NMJ), רשמו לפחות 10 פוטנציאלים מעוררים מכל שריר וחשבו את ממוצע האמפליטודות. איור זה מציג רישום טיפוסי שנלקח משריר מספר שש של פupa מסוג wild type של sal, הכולל תגובות EJP מעוררות ו-mini EJPs ספונטניות. הרגע הצגנו לכם כיצד לרשום פוטנציאלים מהצומת העצבי-שרירי של זחלי דרוזופילה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשלים את הדיסקציה תוך 3 עד 10 דקות ולהתחיל את הרישומים האלקטרופיזיולוגיים באופן מיידי, בעוד התאים עדיין בריאים ומגיבים.אם הנתיחה תימשך זמן רב מדי, פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה של תאי השריר יהיה נמוך מ-60- millivolts, ערך שהוא נמוך מכדי שניתן יהיה להקליטו. וזהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

electrophysiological-methods-for-recording-synaptic-potentials-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוצדורה זו משתמשת ערוץ תכלת המופעל אצות תא ספציפי כלי הביטוי הגנטי לעורר פוטנציאלים סינפטיים עם להבזקי האור בצומת neuromuscular (NMJ)...

Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

מערכת סיבים הענק הוא מעגל עצבי פשוטה של...

הקלטות אלקטרו מתוך מסלול של סיבים ענק ד melanogaster</em

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לרישום אלקטרופיזיולוגי של פעילות קולטני אור בעין של דרוזופילה משותקת, המאפשר מדידה מדויקת של שינויי מתח בתגובה לגירויי אור.

רישום אלקטרופיזיולוגי של תגובות מתח של פוטורצפטורים ברשתית דרוזופילה לגירויי אור

סרטון זה מדגים את הטכניקה להקלטת זרמים סינפטיים מבוטון סינפטי בצומת העצבית-שרירית של זחל דרוזופילה. טכניקה זו מאפשרת ניטור הפעילות של בוטון סינפטי יחיד, החשוב לחקר קווי זבובים מוטנטיים בעלי פעילות סינפטית ספונטנית או אסינכרונית מוגברת.

הקלטת זרמים סינפטיים בצומת הנוירומוסקולרית של זחל דרוזופילה

פרוטוקול זה מתאר הקלטה תאית מתגובות פוטנציאל הפעולה שנורו על ידי נוירונים טעם labellar בדרוזופילה.

הקלטת אלקטרו מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Labellar טעם Sensilla

מיקרואלקטרודות חדות מאפשרות אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תפוקת קולטני האור והאינטרנוירונים החזותיים בדרוזופילה חיה. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להקליט תגובות מתח באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור מבוקר. שיטה זו אידיאלית לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים של תרכובות חרקים.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .

צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

למד שיטות אלקטרופיזיולוגיות להקלטת פוטנציאלי חיבור מעוררים בזחלי Drosophila. הפרוטוקול כולל ניתוח חשיפת שרירים ומערכת עצבים, הצבת אלקטרודות הקלטה וגירוי, ומדידה מדויקת של מוליכות סינפטית ב-NMJ.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

גלה סרטונים נוספים