שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

להפיק רישומים אלקטרופיזיולוגיים יציבים מצמתים עצביים-שריריים של זחלי ג'וף. ראשית יש לנתח זחל כדי לחשוף את דופן הגוף, השרירים ומערכת העצבים לפני ההקלטה. האקסונים בבסיס מערכת העצבים המרכזית נחתכים מאחור לגנגליון הגחוני.

לאחר מכן מניחים אלקטרודת הקלטה על השריר המעניין ואלקטרודה מגרה ממוקמת ליד הנוירונים המוטוריים העצבניים. האקסונים המנותקים של הנוירונים המוטוריים נשאבים לתוך הפיפטה המגרה. לאחר מכן ניתן לרשום פוטנציאלים של צומת מעורר.

היי, אני וונדי MLA ממעבדת מקייב במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה תאית באוניברסיטת קולומביה. היום נראה לכם נוהל למדידת העברת טיקים בצומת העצבי-שרירי של לבה מהונדסת גנטית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור פיזיולוגיה סינפטית והולכה עצבית.

אז בואו נתחיל. כדי להתחיל את הניסוי, נתחו זחלי שלישי וכוכב נודדים כדי לחשוף את דופן הגוף. פרוטוקול זה מותאם לניסויים אלקטרופיזיולוגיים על ידי שימוש בפיני חיתוך קצרים.

אורכם כשניים עד ארבעה מילימטרים ויש להם פחות סיכוי לפגוע במטרת המיקרוסקופ באלקטרודות במהלך הניסוי. לאחר חשיפת דופן הגוף, השתמש במלקחיים כדי להחזיק את מערכת העצבים המרכזית ולהרים אותו מעט. ואז חתוך את האקסונים המוטוריים העצביים ההיקפיים והסר את המוח.

לאחר הסרת שטיפת המוח יש לבצע את ההכנה המנותחת פעמיים עם מאגר HL 3.1 עם סידן מילי-מולרי אחד. כעת, לאחר שהדיסקציה הושלמה, ניתן לבצע הקלטות תוך-תאיות מתאי שריר הזחל. הנח את לוחית החיתוך על המיקרוסקופ האלקטרופיזיולוגיה וטבל את ההכנה עם מאגר HL 3.1 בתוספת סידן.

ואז תקן את אלקטרודת האמבטיה כך שהיא תהיה במגע עם התמיסה. אלקטרודת היניקה משמשת לגירוי העצבים ההיקפיים המעצבנים את השריר. מקם תחילה את אלקטרודת היניקה בצלחת כדי למנוע רעידות כאשר האלקטרודה התוך תאית מונחת על השריר.

ברגע שהאלקטרודה נמצאת בצלחת, מקם אותה קרוב לנוירון המוטורי שמעצבב את שריר 6. בקטע הבטן השלישי, הפעל יניקה עדינה עד שהעצב החתוך נמצא בתוך פיפטת הזכוכית. היזהר לא למתוח את העצבים בעת הפעלת יניקה.

הרם מעט את הפיפטה כך שהיא לא תיגע בשריר. ואז מקם אותו כך שהוא לא מושך את סיבי העצב החתוכים. לאחר שאלקטרודת היניקה נמצאת במקומה, מקם את אלקטרודת ההקלטה עבור ההקלטות התוך תאיות.

השתמש במיקרו אלקטרודה חדה מלאה בשלושה אשלגן כלורי מולארי. מקם את אלקטרודת ההקלטה מעל מרכז השריר השישי. התאם את היסט הקלט כך שיקרא אפס עבור תמיסת האמבטיה.

הורד לאט את האלקטרודה והתקרב לשריר בהגדלה אופטית גבוהה עד שהוא נוגע במשטח השריר. כדי לאשר שהשריר נפרץ, צפו באוסילוסקופ. פוטנציאל הממברנה במנוחה צריך להיות לפחות 60 מילי-וולט שלילי.

פוטנציאל nplate מיניאטורי ספורדי אמור להיות גלוי כעת. לאחר שאלקטרודת ההקלטה נמצאת במקומה, תנו לתאים להתייצב למשך דקה אחת. לפני תחילת ההקלטות, השתמש באקסון HS שתיים, שלב ראש במגבר מהדק ציר שני B כדי לזהות שינויים בפוטנציאל הממברנה.

מהדק הציר שני B הוא ממשק למחשב המפעיל תוכנת מהדק P דרך נתוני הספרות. 1322 A, שהופך את האות לדיגיטלי. רשום את פוטנציאל הממברנה במחשב. עם תוכנת מהדק X, הפעל גירויים על האקסון המוטורי כדי ליצור פוטנציאל ממברנה מעורר או ejs.

לאחר יצירת ה-ejs, הקלט את ה-ejs המיניאטורי במשך תקופה של שלוש דקות ללא סינפסה של גירויים. ניתן להשתמש בתוכנת ניתוח מיני רכה כדי לנתח את העקבות ולקבוע משרעת ותדירות מיני EJP. כדי ליצור ejs.

השתמש במחולל פולסים מאסטר שמונה כדי לעורר לקצה המנותק של תוכנית נוירונים מוטוריים. הגנרטור לספק תוכנית פולסים של מתח מרובע של 0.3 אלפיות השנייה. מרווח זמן של חמש שניות בין גירויים כדי לאפשר התאוששות סינפטית.

ב- NMJ רשום לפחות 10 פוטנציאלים מעוררים מכל שריר וממוצע המשרעות. איור זה מציג עקבות טיפוסיים שתועדו משריר 6 של זחל סאל מסוג בר עם תגובות EJP מעוררות ומיני EJ.PS ספונטניות זה עתה הראינו לכם כיצד לרשום פוטנציאל cy מהצומת העצבי-שרירי של לבה דרוזופילה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשלים את הדיסקציה תוך שלוש עד 10 דקות ולהתחיל את ההקלטות האלקטרופיזיולוגיות מיד כשהתאים עדיין בריאים ומגיבים.

אם הדיסקציה נמשכת זמן רב מדי, פוטנציאל הממברנה במנוחה של תאי השריר יהיה פחות ממינוס 60 מילי-וולט, שהוא נמוך מכדי לרשום אותו. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.