Name: Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: למד טכניקות מיקromanipulation לתאי שמרים לניתוח גנטי מיוטי ובחירת זיגוטות דיפלואידיות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבודד תאים בדייקות וללמוד על תפקוד גנים ב-Saccharomyces cerevisiae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדה של המחבר ממומנת על ידי מכוני המחקר הקנדי הבריאות, קרן קנדה עבור חדשנות, למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר ואת אוניברסיטת קונקורדיה.

בנייה של זנים דיפלואידי פרוטוקול לייצור diploids ידי הזדווגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זנים הראשוני צריך להיות הכה על YPD בינוני, או סלקטיבי במידת הצורך, כדי לייצר מושבות אחת. שני זנים הפלואידים צריך להיות סוג של הזדווגות ההפוך (כלומר, מאטה ו MATα). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאה חיסון סטרילי לקחת חלק קטן במושבה מאחד שני זנים הפלואידים. על צלחת פס חדש YPD את הלולאה פעם אחת בקו ישר על פני הצלחת. סמן את כיוון פס עם חץ בתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו עבור זן השני בצלחת YPD אותו. הפעם פס בניצב אל המושבה הראשונה, חציית פס הראשון עם השני. סמן את כיוון פס השני וציין את האזור שבו פס second חוצה את הראשון. אזור זה יהיה שם diploids יופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת YPD ב 30 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Replica צלחת צלחת YPD על גבי מדיה סלקטיבית כי יהיה סלקטיבי היתר גידול שזה עתה קמו diploids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה אחת אם אפשר, או חלק קטן של פס דיפלואידי ו פס על המדיום סלקטיבית אותו כדי ליצור מושבות אחת. </li></ol> נביגה ועיכול asci פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות אחת מהצלחת לעיל ולעשות קטן (1cm x 1cm) כתמים על נביגה (SPO) צלחות לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 3-7 ימים sporulate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נביגה ניתן לבדוק על ידי הסתכלות על התאים מפני תיקון כל במיקרוסקופ אור. תאים מקום בשקופית מיקרוסקופ μl 5-10 של מים, במקום coverslip על גבי אגל, ולחפש בנוכחות asci. אם asci לא נמצאים בקלות ואז להחזיר בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש נביגה יעיל אחד התיקונים, להכין צינור סטרילי חרוטי עם 15 מ&quot;ל של מיץ 100μL הטטרדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תאים למעלה מ תיקון זה נביגה עם לולאה חיסון סטרילי 3mm (תאים אמור לכסות ¼ של הלולאה) ומניחים מיץ הטטרדה. מערבולת בעדינות את הלולאה על מנת לאפשר לתאים ליפול הלולאה ומערבבים עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו במיץ הטטרדה (המכיל zymolyase) עבור 4-10mins (תלוי בריכוז ופעילות של zymolyase והמתח עצמה). זה מאפשר עיכול של התא הקיר המקיף את ascospores. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את החלק העליון והתחתון של האזור inoculum על צלחת YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי. תגובת ניתן לעצור על ידי הוספת 1mL של קרים כקרח סטרילי DH 2 O. אפשר התאים להסתפק 5mins. הסר 1mL מ supernatant ואז לערבב קלות ביד ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 5μL של תאים מתעכל משלב 5 ומניחים בעדינות טיפות בקו באזור inoculum צלחת מראש סימנה את YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לולאה סטרילי חיסון 3mm להפיץ מאוד בעדינות את טיפות 1-3 פעמים בקו בעוד בקושי ביצירת קשר עם אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לספוג את הנוזל לתוך אגר (אם צעד 7 מושמט, זה כאשר מערכת העיכול של התא הקיר החיצוני יהיה מופחת או להפסיק). המשך המיקרוסקופ לנתיחה. </li></ol> Dissection של Asci פרוטוקול ראוי לציין, כי פרוטוקול הבאים מתוארת עבור מיקרוסקופ זינגר MSM מערכת המיקרומניפולציה 200. פרוטוקול זה יכול להיות מלווה בשינויים קלים אם באמצעות micromanipulator ידני כגון micromanipulator MR Zeiss. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמקד באזור של צלחת שבה מחצית השדה מכיל תאים חצי ריקה. לאט לאט מביאים את המחט להתמקד כזאת שזה נוגע באזור ריק השדה. זה יבטיח כי המחט אינו מכיל תאים משימוש קודם. קשר בין מחט לבין אגר נחשבת עיגול שחור כהה לאט מתחדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המטריצה ​​ב A1 עמדה ולעשות סימן על ידי פירסינג אגר שוב. זו נועדה לסייע לקבוע את הכיוון של הצלחת אם הוא הוריד את המיקרוסקופ לפני סיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב החיפוש. איתור asci. רצוי לבחור asci אשר נמצאים באזורים בהם התאים מפוזרים היטב. הימנע שטחים עם אשכולות התא. ארבעת ascospores מ asci עדיין צריך להיות קשור אחד לשני. שני ascospores עשוי להיות מעט גדול יותר משני האחרים. הימנע לקטוף asci שבו ascospore רופף ולא מחובר לשאר ascospores. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי נאד עם המחט. לאט לאט מביאים את המחט את הצלחת. כאשר צל של microneedle הוא ראה, בשורה הזאת עם נאד כדי להיות נטל. שוב הגישה את המחט עד קו המתאר השחור של מעגל (קצה המחט) נתפסת. מגע הטטרדה עם המעגל הזה ולאחר מכן במהירות למשוך את המחט משם. ודא כל ארבעת ascospores מתוך נאד דבקו המחט וכי אין תאים נוספים נאספו על microneedle כי אינם חלק נאד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את microneedle הרחק מן הצלחת וללכת המטריצה ​​(עבור נאד הראשונה, ללכתעמדת A1). שימו לב למיקום שבו כל נאד היא עברה. מניחים את נאד על ידי נגיעה צלחת עם microneedle ו מתרחק עד כל ארבעת ascospores ירדה microneedle. לחיצה עדינה של הזרוע מחט או את הפלטפורמה מחזיק את צלחת YPD הוא לעתים קרובות שימושי בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3-5 ומקום asci לעבר עמדות ברציפות על המטריצה ​​עד המספר הרצוי של asci כבר הרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל נאד כל לשבור את ארבעה תאים לגזרים על ידי מתגרה עם המחט, הקשה על פלטפורמה בעדינות או שילוב של שניהם. תרים את התאים לעזוב אחד מאחורי במיקום חדש המטריצה ​​עד שכל ascospore ב נאד כל מופרד בשורות של ארבעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת YPD באינקובטור ב 30 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים כדי לבחון את דפוס הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Replica צלחת התאים גזור עד בינוני סלקטיבי במידת הצורך. </li></ol> רילוקיישן של Zygotes פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak את שני זנים הפלואידים עם סוגים הזיווג ההפוך על המדיום המתאים כדי להשיג מושבות אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלה Mate שני זנים כמתואר לעיל ולאפשר לגדול מ 4 עד 6 שעות (או לילה במקרה הצורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק zygotes תחת מיקרוסקופ אור. Zygotes יופיעו המשקולת בצורת תאים עם או בלי ניצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תאים עם לולאה חיסון 3mm (תאים אמור לכסות ¼ של הלולאה) ומקום בעדינות 100μL של סטרילית DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את החלק העליון והתחתון של האזור inoculum על צלחת YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 5μL ומניחים בעדינות טיפות בקו באזור inoculum צלחת מראש סימנה את YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לולאה חיסון 3mm להפיץ את טיפות בקו בעדינות רבה תוך בקושי ביצירת קשר עם אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לספוג את הנוזל לתוך אגר. המשך המיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמקד באזור של צלחת שבה מחצית השדה מכיל תאים חצי ריקה. לאט לאט מביאים את המחט להתמקד כזאת שזה נוגע באזור ריק השדה. זה יבטיח כי המחט אינו מכיל תאים משימוש קודם. קשר בין מחט לבין אגר נחשבת עיגול שחור כהה לאט מתחדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המטריצה ​​ב A1 עמדה ולעשות סימן על ידי פירסינג אגר שוב. זו נועדה לסייע לקבוע את הכיוון של הצלחת אם הוא הוריד את המיקרוסקופ לפני סיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב החיפוש. אתר זיגוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי זיגוטה עם המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום zygotes בנפרד על המטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר zygotes לגדול במשך כמה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת Replica zygotes על המדיום סלקטיבית המתאימה. </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> איור 1: זיווג של שני זנים הפלואידים סוגי ההזדווגות מול יוצרת זן דיפלואידי. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> איור 2: (א) צלחת YPD עם תוצאות thre של הזיווג בין זן טמפרטורה רגיש (עם auxotrophy leu2 א) ו זן סוג בר (LEU2). תאים מתעכל פרושים באזור inoculum בצד שמאל איפה צמיחה עבה בין שני קווים שחורים נתפסת. Asci כי כבר גזור לגדול מחולקת באופן שווה במטריצה ​​בצד ימין. (ב) צלחת ב (א) היה משוכפל לצלחת הנשירה SD-לאוצין. הערה הצמיחה 02:02 עבור הסמן LEU2 המעידים על ascospore תוקף היה גזור. (ג) צלחת ב (א) היה משוכפל על צלחת YPD וטופחו על 37 ° C. שים לב כי הצמיחה 2:02 נוסף מאמת כי ascospore היה גזור.

<ol><li>Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).</li>
</ol>

דיסקציה שמרים הוא כלי שימושי כדי לבחור זנים חדשים עם סמנים הרצוי. בעת קביעת דפוס הצמיחה התיאורטי של ארבעה ascospores חשוב להסתכל גנוטיפ של התא הווגטטיבי. אם הפלסמיד הוא ההווה, צריך לדעת אם הוא עותק יחיד, נמוך או גבוה כמו זה ישפיע אשר ascospore (ים) לקבל את הפלסמיד ואת ישפיע התחזיות והמסקנות לגבי זנים להיות מניפולציות. זנים מסוימים יכולים sporulate טוב יותר מאחרים לייצר ascospores רבים בתקופה קצרה של זמן. זנים אחר...

<table><tbody><tr><td>Singer MSM System 200</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Singer Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>SOR508</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>ריאגנט</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>פפטון</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>PEP 403</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>בסיס חנקן לשמרים</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Bio-tryptone</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן אצטט</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>POA 301</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>אדנין סולפט</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-uracil</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>URA 241</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophan</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP 100</td><td></td></tr><tr><td>L-histidine</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS 200</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine</td><td>ריאגנט</td><td>Amresco</td><td>0877-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>MET 222</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrosine</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR 333</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucine</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO 910</td><td></td></tr><tr><td>L-valine</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL 201</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS 101</td><td></td></tr><tr><td>L-phenylalanine</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA 302</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamic acid</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU 202</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>ריאגנט</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU 222</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection של saccharomyces cerevisiae asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

שמרים היא מערכת מודל ממושמע מאוד המשמש מחקר רבים בתהליכים תאיים שונים. המתח מעבדה משותפת<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; קיים הפלואידים או מצב דיפלואידי. היכולת לשלב שני אללים haploids ואת היכולת להנהיג שינויים בגנום מחייבת ייצור של asci לנתיחה. ייצור Asci מתאי הפלואידים מתחיל החיזור של שני זני שמרים הפלואידים עם סוגים ההזדווגות תואם לייצר זן דיפלואידי. ניתן להשיג זאת במספר דרכים או על מדיום מוצק או נוזלי. זהו יתרון לבחור עבור diploids במדיום זה סלקטיבי מקדם צמיחה שלהם לעומת כל אחד הזנים הפלואידים. Diploids מותר אז sporulate על מדיום תזונתי דל להקים asci, חבילה של ארבעה תאים הפלואידים בת הנובע רבייה meiotic של דיפלואידי. תערובת של התאים הצמחיים, asci מטופל אז עם zymolyase את האנזים לעכל משם את שק קרום המקיף את ascospores של asci. שימוש המיקרומניפולציה עם microneedle תחת מיקרוסקופ לנתיחה אחד יכול להרים asci הפרט נפרד להעביר את ארבעת ascopores. Asci גזור גדלים במשך כמה ימים נבדקו סמנים או אללים של עניין על ידי ציפוי העתק על גבי מדיה סלקטיבית המתאימה.

המיקרומניפולציה בתאי שמרים דרוש ניתוח גנטי meiotic או לבחור zygotes דיפלואידי. Micromanipulations אלה מתבצעות באמצעות microneedle של מיקרוסקופ לנתיחה. Microneedle משמש להעביר תאים נשלטת על ידי micromanipulator אשר זמינים עם דרגות שונות של אוטומציה.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

שמרים הם מערכת מודל נוחה מאוד המשמשת לחקר תהליכים תאיים רבים ושונים. זן המעבדה הנפוץ Saccharomyces cerevisiae ...

הליך זה מתחיל בהכלאה של שני תאי שמרים מסוג haid השונים גנטית. דיפלואידים נבחרים באמצעות זריעה משכפלת (replica plating) על מצע המאפשר צמיחה של דיפלואידים בלבד. לאחר מכן, הדיפלואידים מועברים לצלחות הסתיו (sation plates) או לצורת אסי (asci form).האסי (asci) מודגשים תוך הצבת ההפלואידים (haplos) במיקום מוגדר על הצלחת. לאחר שההפלואידים שהתקבלו גדלו למושבה נראית לעין, מבצעים רפליקציה של הצלחת למצע נבחר כדי לזהות את הגנוטיפ של התאים הבודדים. שלום, אני אדריאן מוריס.ואני אודרי מאה. אנחנו מהמעבדה של ד"ר Michael Satcher באוניברסיטת קונקורדיה במונטריאול. היום נראה לכם הליך לדיסקציית שמרים שכיניו בדרך כלל ra.השתמשו בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי להנחית זני haplo D עם גנוטיפים חדשים וכדי לבחון את ההשפעות של שילוב שתי מוטציות יחד. אז בואו נתחיל. כדי לבנות זן דיפלואידי, מזביגים שני זני haplo מסוגי הזיווג המנוגדים. ראשית, זני ה-haplo נזרעים על מצע מתאים, במקרה שלנו YPD, כדי להפיק מושבות בודדות. באמצעות לולאת הזרקה סטרילית, קחו חלק קטן ממושבה של אחד משני זני ה-haplo, והעבירו אותו לצלחת YPD חדשה באמצעות זריעה בלולאה.לאחר ביצוע קו ישר לרוחב הצלחת, סמנו את כיוון המריחה באמצעות חץ בתחתית הצלחת. לאחר מכן, בחרו חלק קטן מקולוניה של זן ההפלואיד השני מאותה צלחת YPD. מרחו את הקולוניה בניצב לזן הראשון, כך שהמריחה השנייה תחתוך את המריחה הראשונה, וסמנו את כיוון המריחה השנייה.שימו לב לאזור שבו הפס של הריסוס השני חוצה את הפס הראשון. זהו האזור שבו ייווצרו הדיפלואידים.דגרו את צלחת ה-YPD בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך לילה. לאחר הדגירה של לילה, בצעו העברה של המושבות (replica plate) מצלחת ה-YPD אל מצע ברירה שיאפשר באופן סלקטיבי צמיחה של הדיפלואידים שנוצרו acabado. דגרו את הצלחת למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius.לאחר שהדיפלואידים גדלו על הצלחת, בחר מושבה בודדת אם הדבר אפשרי, או חלק קטן מהפס של הדיפלואידים ובצע פס על אותו מצע סלקטיבי כדי להפיק מושבות בודדות. לאחר שהזן הדיפלואידי הופק, בחר מושבות בודדות וצור כתמים קטנים על צלחות לספורולציה. דגור בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה עד שבעה ימים כדי להגיע לספורולציה.כדי לבדוק ספורולציה, בחנו תאים מכל טלאי תחת מיקרוסקופ אור. הניחו תאים על זכוכית כיסוי והוסיפו 5 עד 10 µL של מים.הנח זכוכית כיסוי מעל הטיפה וחפש נוכחות של asci. אם אלו אינם נמצאים או שאינם נראים בקלות, העבר את הצלחת לאינקובטור. אם קיימת ספורולציה יעילה באחת מהדגימות, הכן מבחנה קונית סטרילית של 15 milliliter עם 100 µL של tetra juice.אספו תאים מכתם ספורולציה זה באמצעות לולאת הזרקה סטרילית בקוטר שלושה מילימטרים והניחו אותם במיץ הטטרדות. סובבו בעדינות את הלולאה כדי לאפשר לתאים להתרחק ממנה ולהתערבב עם התמיסה. השאירו את התאים במיץ הטטרדות למשך ארבע עד 10 דקות.פעולה זו מאפשרת עיכול של דופן התא המקיפה את נבגי ה-ASCO. כדי להכין צלחת לדיסקציה של האסקי (asci), סמנו את החלק העליון והתחתון של אזור ההוחדרה על צלחת YPD. כאשר התאים מעוכלים מספיק, קחו חמישה µL של תאים מעוכלים וטפטפו אותם בעדינות בשורה באזור ההוחדרה של צלחת ה-YPD המסומנת מראש, באמצעות לולאת הזרקה סטרילית של 3 מילימטרים.מרחו בעדינות רבה את הטיפות פעם אחת עד שלוש פעמים בקו ישר, תוך מגע מינימלי עם המקדח. המתינו עד שהנוזל ייספג במקדח. כעת ניתן להתחיל בניתוח של ה-asci.כדי להתחיל בדיסקציה של האסקי (asci), מקמו את פלטת הדיסקציה תחת מיקרוסקופ המניפולציה המיקרוסקופית singer MSM system 200. התמקדו באזור בפלטה שבו מחצית מהשדה מכילה תאים ומחציתו ריקה. הביאו את המחט למיקוד באיטיות, כך שתגע באזור הריק של השדה.המגע בין המחט לאגר נראה כעיגול שחור כהה שמתמקד לאט. לאחר שהמחט נוגעת באגר, משוך אותה מעט לאחור ובדוק שלא הופקדו תאים באזור שבו המחט נגעה באגר. פעולה זו מבטיחה שהמחט אינה מכילה תאים משימוש קודם.גשו למטריצה במיקום A1 וסמנו אותה על ידי דקירה עם המקדח. שוב, פעולה זו נועדה לסייע בקביעת האוריינטציה של הפלטה. יש להסירו לאחר השלמת הדיסקציה.עברו למצב חיפוש. אתרו ascus. ארבעת הנבגים של ה-ASCUS מאותו ASCUS אמורים להיות עדיין מחוברים זה לזה.שתי נבגי ASCUS עשויות להיות גדולות מעט משתי האחרות. הימנעו מבחירת אסי (asci) שבהם נבג ASCA אחד משוחרר ואינו מחובר לשאר נבגי ה-ASCA. כדי לאסוף אסקוס, הגבירו באיטיות את המחט לעבר הפלטה.כאשר נראה צל המיקרו-מחט, יישרו אותו עם האסכוס (ascus) שברצונכם לדגום. הזיזו את המחט עד שיופיע קו מתאר שחור של עיגול. געו בטטרהד (tetrad) באמצעות עיגול זה ולאחר מכן משכו את המחט במהירות החוצה.וודאו שארבעת הנבגים מה-ascus נצמדו למחט, וכי לא נאספו על ידי המיקרו-מחט תאים נוספים שאינם חלק מ-ascus זה. לאחר שה-ascus נאסף על ידי המיקרו-מחט, הרחיקו את המיקרו-מחט מהצלחת ועברו למטריצה. עבור ה-ascus הראשון, עברו לעמדה a1.הניחו את ה-ascus על ידי נגיעה בצלחת עם המיקרו-מחט ומשיכה עד שכל ארבעת ה-ascus spores יתרחקו מהמיקרו-מחט; נקישה עדינה של זרוע המחט או של הפלטפורמה המחזיקה את צלחת ה-YPD מועילה לעיתים קרובות בשלב זה.המשיכו לאתר, לבחור ולהניח asci במיקומים עוקבים על המטריצה עד לקבלת המספר הרצוי של ASCI. רשמו את כל מיקום שבו הועבר ASCUS. כאשר מספר ה-asci הרצוי נבחר, חזרו לכל אחד מהם והפרידו את ארבעת התאים על ידי גירוי עם המחט, טפיחות עדינות על הפלטפורמה או שילוב של השניים.הרמו את התאים והשאירו אחד מאחור. העבירו את השאר. העבירו את E למיקום חדש במטריצה וחזרו על הפעולה עד שכל תא יועבר.ה-APO בכל ascus מופרד לשורות של ארבעה. דיסקציית ascus אחת הושלמה. מקמי את צלחת ה-YPD באינקובטור בטמפרטורה של 30 °C למשך מספר ימים כדי לצפות בדפוס הגדילה.לאחר שה-asci המבודדים גדלו, יש להעבירם בהדפסת רפליקה (replica plate) למצע סלקטיבי. במידת הצורך, מדובר בצלחת שעברה רפליקה, כאשר הן צלחת הבידוד המקורית והן הצלחת הסלקטיבית גדלו למשך לילה. יש לדרג את התוצאות הנצפות בצלחת הסלקטיבית, ולזהות ולבחור את התא ההפלואידי המתאים.במקרים שבהם לא ניתן לזהות דיפלואידים על מצעים סלקטיביים, יש לבחור באופן ידני תאי הפלואיד שהזדווגו, הנקראים זיגוטים, אשר ניתנים לזיהוי בקלות בשלב מוקדם לאחר ההזדווגות. הפרוצדורה להכנת תאי ההפלואיד ולהזדווגות זהה לזו שתוארה כבר, למעט העובדה שהאזור שבו אמור להימצא הדיפלואיד נבחן לאחר זמני אינקובציה קצרים יותר ב-30 degrees Celsius. מצאנו שארבע עד שש שעות הן נקודת התחלה טובה, אך את משך הזמן יש לקבוע בסופו של דבר באופן אמפירי.בדקו את נוכחותם של זיגוטים תחת מיקרוסקופ אור; הזיגוטים ייראו כתאים בצורת פלס (dumbbell), עם או בלי ניצן. אספו תאים באמצעות לולאת הזרקה של 3 mm והניחו אותם בעדינות ב-100 µL של מים סטריליים. לאחר העברת התאים לצלחת YPD מסומנת מראש, השתמשו בלולאת הזרקה של 3 mm כדי למרוח את הטיפות בקו בעדינות רבה, תוך מגע מינימלי עם האגר. המתינו עד שהנוזל ייספג באגר.עברו למיקרוסקופ הדיסקציה. התמקדו באזור בלוח שבו מחצית מהשדה מכילה תאים ומחציתו ריקה. הביאו את המחט בהדרגה למצב של פוקוס, כך שהיא תיגע באזור הריק של השדה.כפי שהודגם קודם לכן. ודאו שהמחט אינה מכילה תאים משימוש קודם. עברו למטריצה במיקום A1 וסמנו אותה על ידי דקירה עם המקדח.שוב, כדי לסייע בקביעת אוריינטציית הפיתח. עברו למצב חיפוש ואתרו זיגוטה. אספו את הזיגוטה באמצעות המחט.הניחו את הזייגוטים באופן פרטני על המטריצה. אפשרו לזייגוטים לגדול במשך מספר ימים. העבירו את התאים הדיפלואידיים בשיטת פאץ' (patch) לצלחות ספורולציה והמשיכו כפי שפורט בחלק השלישי.הזדווגות של שני זנים הפלואידיים מסוגי הזדווגות מנוגדים יוצרת זן דיפלואידי. צלחת YPD זו מציגה את תוצאות ההזדווגות בין זן רגיש לטמפרטורה עם atrophy lu two ox לבין זן מסוג בר (wildtype). זנים שעברו עיכול מפוזרים באזור האינוקולום משמאל, שם נראה צמיחה עבה בין שני הקווים השחורים.אסי (Asci) שבוצע להם דיסקציה גדלים במרווחים שווים במטריצה שמימין. כאשר צלחת YPD זו הועתקה לצלחת SD עם מחסור בלוסין (leucine dropout plate), אנו רואים צמיחה של שניים לשניים עבור הסמן LU two, המעידה על כך שבוצעה דיסקציה של נבג ASCO תקין. צלחת ה-YPD המקורית הועתקה גם לצלחת YPD אחרת ודגרה בטמפרטורה גבוהה יותר של 37 °C, שבה צמיחה של שניים לשניים מאשרת עוד יותר כי בוצעה דיסקציה של נבג ASCO.הראינו הרגע כיצד להכין שני תאי היבריד (hybrid cells) ולבצע ברירה לתאי דיפלואידים. הדבר התבסס על שתי שיטות שונות, אחת המשתמשת בסמנים טרופיים והשנייה המבוססת על מורפולוגיה של התא. בשימוש בהליך זה, חשוב מאוד לזכור לבצע ברירה של תאי ההיבריד שנוצרו באמצעות דיסקציה של טטרה (tetra dissection), שבה הסמנים האטרופיים מיוצגים כצפוי.חשוב לזכור גם להימנע מעיכול יתר או מעיכול חסר. ה-tetra as asci נכשלו להישאר יחד כטטראדים, אשר עברו עיכול יתר, ומקשה על הפרדתם בטטראדים שעברו עיכול חסר. וזה הכל.בהצלחה בניסויים שלכם.

dissection-of-saccharomyces-cerevisiae-asci

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים assay איכותי עבור הידבקות שמרים הפלישה אגר כאמצעי בידול פולשני pseudohyphal. Assay זה פשוט יכול לשמש כדי להעריך את פנוטיפ פולשני של מוטנטים שונים, כמו גם את ההשפעות רמזים סביבתיים איתות המסלולים על בידול שמרים.

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

כדי לחקור את תהליכי ההתפתחות של ascospores ב Gibberella zeae, נוהל איסוף בתנאים סטריליים מצולם על מנת להפיק את הרמה הגבוהה ביותר של מידע עבור תיאור פרוטוקול. זה אמור להקל על שחזור של הניסוי, היבט חיוני כאשר ביטוי מלא הגנום בדיקות פרופיל מיושמים.

Gibberella zeae Ascospore ייצור אוסף לניסויים microarray.

שיטה להטבעת מושבות שמרים המאפשר חתך של מיקרוסקופ אור אלקטרונים. פרוטוקול זה מאפשר קביעה של חלוקת תאים sporulated ותאי pseudohyphal בתוך מושבות מתן כלי חדש לקראת הבנת הארגון של סוגי תאים בתוך קהילה פטרייתי.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים...

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

צלבים מיניים ובידוד של הצאצאים רקומביננטי הם כלי מחקר חשובים פטריות...

התפתחות מינית והפרשות Ascospore ב Fusarium graminearum</em

אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.

Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

מוצגת שיטה לכרומוזומים המתפשטים על פני השטח משמרים ניצנים. שיטה זו נגזרת משיטה שתוארה בעבר על ידי לוידל וקליין. בנוסף, אנו מדגימים הליך לצביעה חיסונית של כרומוזומים מפוזרים.

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי עיבוד מפורטים לדימות דגימות רקמה עדינה באמצעות סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM). שלוש שיטות עיבוד שונות, כלומר, האודיאתיל disilazana (HMDS) ייבוש כימי, ייבוש אוויר פשוט, וייבוש נקודה קריטית מתוארים להכנת קליפות בביצה נוקשה, עוברים בשלבים התפתחותיים מוקדם, ותרבויות פטרייתי בהתאמה.

עיבוד העובר, קליפת ביצה, ופטרייתי תרבות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamella של דגימות ביולוגיות קפואות לצלול על ידי מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולולים במקום עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. הפרוטוקול המוצג מספק קווים מנחים להכנת lamellae באיכות גבוהה עם רבייה גבוהה לאפיון מבני של macromolecules בתוך cerevisiae Saccharomyces.

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

מחקר זה מתאר כיצד לנתח את השק האנדולימפטי מהאוזן הפנימית של העכבר בגילאים שונים. התוצאה של דיסקציה דומה מוצגת במודל עכבר Slc26a4-null של הגדלת השק האנדולימפטי. עכבר מהונדס עם כתב ניאון המתבטא בשק האנדולימפטי מוצג כמודל לדמיין בקלות את השק האנדולימפטי, ואת הכלי החינוכי.

נתיחת השק האנדולימפטי מעכברים

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

למד טכניקות מיקromanipulation לתאי שמרים לניתוח גנטי מיוטי ובחירת זיגוטות דיפלואידיות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבודד תאים בדייקות וללמוד על תפקוד גנים ב-Saccharomyces cerevisiae.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

גלה סרטונים נוספים