Name: בידוד של Protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: למדו לבודד פרוטופלסטים שלמים מנבטי Arabidopsis thaliana בני 14 יום. השיטה משתמשת בפתרון אנזימים ומדרג סוכרוז לטיהור, ומספקת תאים ברי-קיימא למשך 96 שעות לפחות לניסויים בביולוגיה צמחית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תחנת אוניברסיטת קורנל ניסוי חקלאי (CUAES) NYC-125433 הצוהר גרנט קורנל Start-Up גרנט הוענק OKV

חלק 1. הכנת בינוני מוצק לגידול צמחים. אנחנו בדרך כלל מפעלי התרבות על מדיום מרוכז (MS) ו Murasige Skoog בתוספת 1% סוכרוז ו אגר 0.7%. הוא מכיל את כל המרכיבים הדרושים כדי לשמור על צמחים בריאים. להכנת 1 ליטר של MS, מדיה pH 5.7 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.15 גר &#39;של MS האבקה לתוך 800 מ&quot;ל מים בבקבוק 1.5-2.0L autoclavable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום בר ערבוב לתוך הבקבוק ואת לפזר אבקת MS ידי ערבוב בינוני על צלחת ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך כדי ערבוב, להוסיף טיפה אחר טיפה, 1N KOH להתאים את ה-pH של 5.7 עד בינוני MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 10 גרם של סוכרוז, לבחוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 גרם של אגר *. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמת עוצמת השמע הסופי של המדיום מוכן מ&quot;ל ו - 1000 על ידי לעקר מעוקר .* </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום autoclaved בינוני על צלחת בחישה ומצננים אותו תוך ערבוב, כך אגר זה לא המשקע בתחתית הבקבוק. תירגע בינוני ~ 60 ° C. * </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 100 מ&quot;מ צלחות פטרי. שמור על צלחות ב 4 ° C. </li></ol> * טיפ 1: אל תנסה לפזר אגר. זה יהיה solubilize במהלך מעוקר. * טיפ 2: שמור את בר ערבוב בבקבוק במהלך מעוקר, תצטרך אותו יותר מאוחר. * טיפ 3: אם אתה יכול לשמור את הידיים על הבקבוק autoclaved במשך 10 שניות, זה אומר בינוני יש התקרר מספיק ואתה יכול להתחיל לשפוך צלחות. חלק 2. הצמח חומר ותנאי הגידול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר זרעי thaliana ארבידופסיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 100 מ&quot;ג של זרעי לתוך צינורות Eppendorf microcentrifuge ולהוסיף 1 מ&quot;ל של אתנול 70%. מערבבים היטב דגירה דקות 2. ספין זרעים מטה, לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של תמיסת אקונומיקה 1.8% * המכיל 0.1% Tween-20. מערבבים במשך 10 דקות. ספין למטה זרעים פתרון אקונומיקה לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד זה חייב להיעשות במנדף זרימה למינרית. הוסף 1 מ&quot;ל של מים סטריליים כדי זרעים, ומערבבים היטב. ספין למטה זרעים, לשאוב מים. חזור על פעולה זו 5 פעמים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים על גבי זרעים מוכן בשלב 1 צלחות (100 זרעים / צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על צלחות seeded עבור 24-48 שעות ב 4 ° C בחושך עבור ריבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל צמחים במשך 14 ימים בתא צמיחה עם 8 שעות light/16 h photoperiod כהה (צפיפות השטף פוטוסינתטיים פוטון של 250 μmol s -1 m -2) ב 23 / ​​19 ° C אור / חושך משטר הטמפרטורה היחסית 75% לחות. </li></ol> * טיפ 1: פתרון Bleach היא מאופרת על ידי דילול משק בית Clorox, המכיל נתרן hypochlorite 6% והוספת Tween-20 לריכוז סופי של 0.1%. חלק 3. בידוד של protoplasts מן השתילים ארבידופסיס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים 2 גרם של 14 יום בן שתילים בסכין גילוח טרי 15 מ&quot;ל של פתרון, מסנן מעוקרים TVL. אנחנו קוצצים חומר צמח חד פעמיות צלחות פטרי סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמות קצוץ לתוך כוס 200 מ&quot;ל, להוסיף 20 מ&quot;ל של פתרון אנזימים פילטר מעוקרים, לערבל את הגביע כדי לאפשר לרקמות לערבב עם פתרון אנזימים, מכסים בנייר אלומיניום parafilm ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake רקמות צמח ב 35 סל&quot;ד בחושך בטמפרטורת החדר למשך 16-18 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את protoplasts שוחרר לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל ידי סנון עד 8 שכבות של בד גבינה, טרום רטוב פתרון W5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sieve protoplasts מפעם אחת גבינה בד יותר על ידי שטיפת בד עם 15 מ&quot;ל של פתרון W5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות protoplasts כיסוי עם 10 מ&quot;ל של פתרון W5, נא לא להפריע שיפוע סוכר; צנטריפוגות 7 דקות ב 100 גרם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף של 10 מ&quot;ל protoplasts על הממשק של פתרון האנזים W5 פתרון (איור 1B) ומעבירים צינור חדש פלקון 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מ&quot;ל W5 פתרון, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 60 גרם הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף protoplasts ללא פתרון על ידי אנזימים resuspending protoplasts בצנטריפוגה 15 מ&quot;ל של W5 פתרון, עבור 5min ב 60 גרם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, protoplasts pelleted resuspend בפתרון W5 1-3ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת התשואה protoplast על ידי תא סופר עם hemocytometer. </li></ol> חלק 4. ריאגנטים: TVL: 0.3 M סורביטול, 50 מ&quot;מ CaCL 2 Filter-לעקר ולאחסן ב -20 ° C. הפתרון אנזימים: סוכרוז 0.5 M, 10 mM MES-KOH [pH 5.7], 20 מ&quot;מ CaCl 2, 40 mM KCl, cellulase 1% (Onozuka R-10), Macerozyme 1% (R10). מסנן לעקר טרי להשתמש. W5 פתרון: 0.1% (w / v) גלוקוז, 0.08% (w / v) KCl, 0.9% (w / v) NaCl, 1.84% (w / v) CaCl 2, 2 מ&quot;מ MES-KOH pH 5.7. מסנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר. חלק 5: תוצאות נציג: תנאי שימוש תרבות ארבידופסיס המתואר חלקים 1 ו 2 הופך שתילים בריאים, מתאים לבודד protoplasts (איור 1A). Protoplast הם מטוהרים על ידי צפיפות סוכרוז gradient צנטריפוגה ואסף על הממשק של W5 פתרונות אנזימים (איור 1B). באמצעות בידוד protoplast ההליך המתואר בפרק 3 אנו בדרך כלל הקציר 05-10 אוקטובר 6 של protoplasts שלמים (איור 1C) מ גרם אחד של שתילים רעננים. <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. בידוד של protoplasts מן השתילים ארבידופסיס. , רקמות מ -14 יום בן שתילים של ארבידופסיס נאספו המרה protoplasts על ידי הליך של שינוי (חן Halkier, 2000). B, Protoplasts היו מטוהרים על ידי צנטריפוגה צפיפות סוכרוז שיפוע ואסף על הממשק של תמיסת האנזים W5 uffer (חיצים לבנים). C, מוארת שדה מיקרוסקופית של protoplasts. Microphotographs נאספו באמצעות מצלמה מקורר CCD interfaced עם Axioscope Zeiss 2 פלוס מיקרוסקופ.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

הפטנט הזמנית המתאר הליך זה לשימושו מנתח פונקציונלית של גנים צמח הוגשו עם קורנל המרכז Enterprise טכנולוגיה מסחור (CCTEC), יוני 2008. יומן לא 50341/015001: Vatamaniuk, אישור Zhai, שיטת Z. עבור ניתוחים פונקציונלי מהיר של גנים צמחיים.

כדי להבטיח תשואה גבוהה של protoplast שלם חשוב מאוד start-up עם צמחים בריאים. שימוש במסנן-לעקר פתרונות לבידוד protoplasts. זכור כי protoplasts שבירים. לכן, כאשר אתה מטפל protoplasts, לא מתערבבים, pipet או מערבולת אותם נמרצות מאז זה יהיה בלם אותם. במקום זאת, לערבב protoplasts ידי מסתובב לאט או מקליטה את הצינור צנטריפוגות. התשואה תיאר הליך protoplasts שלם כי הם קיימא לפחות 96 ח לכן, protoplasts ניתן ללמוד מגוון רחב של תהליכים תאיים, כגון לוקליזציה subcellular של חלבונים, בידוד ומנתח ...

<table><tbody><tr><td>תערובת מלחים בסיסית של Murashige and Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי (100x15mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>צלולאז (OnozukaR&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>מקרזים (R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>ניגוני בד גזה</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>רוטטור למעבדה</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה AllegraX&amp;#8208;15R</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Axioskop 2 Plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts נמצאים בתאי צמח כי יש לו קירות התא שלהם הוסר enzymatically. בידוד של protoplasts מרקמות צמח שונים דווח לראשונה יותר מאשר לפני 40 שנה<sup&gt; 1</sup&gt; ומאז מותאם ללמוד מגוון רחב של תהליכים תאיים, כגון לוקליזציה subcellular של חלבונים, בידוד של אברונים שלמים ממוקד גנים איון על ידי כפול תקועים התערבות RNA (RNAi)<sup&gt; 2-5</sup&gt;. רוב הפרוטוקולים בידוד protoplast להשתמש ברקמות עלה של ארבידופסיס בוגר (למשל 35 יום בת צמחים)<sup&gt; 2-4</sup&gt;. שינינו פרוטוקולים הקיימים על ידי העסקת 14 יום בן שתילים ארבידופסיס. בהליך זה, גרם אחד של 14 יום בן שתילים הניבו 5 10<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt; Protoplasts כי נותרו על כנן לפחות 96 שעות. התשואה של protoplasts מן השתילים ניתן להשוות עם ההכנות מן העלים של ארבידופסיס בוגרת, אבל במקום 35-36 ימים, בידוד של protoplasts תושלם בתוך 15 ימים. זה מאפשר להקטין את זמן תא שטח הגידול הנדרשים בידוד protoplasts כאשר צמחים בוגרים נמצאים בשימוש, ו מזרז את המחקרים במורד הדורשים protoplasts ללא פגע.

וידאו זה מציג את נוהל בידוד protoplasts שלם מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס. בהתחשב בכך protoplasts מבודדים נותרו על כנן לפחות 96h והם מבודדים שתילים במקום אחד בן חודש צמחים בוגרים, הליך זה מזרז מבחני המחייב protoplasts ללא פגע.

בידוד של Protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana</em

פרוטופלסטים הם תאי צמחים שהסירו מהם את דפנות התא באופן אנזימטי. בידוד של פרוטופלסטים מרקמות צמחים שונות בוצע לראשונה...

הליך זה מתחיל בזריעת זרעי Arabidopsis על Ms.Agar ביום 14. לאחר נביטת הזרעים, הנבטים נאספים ונחתכים. לאחר מכן, החומר הצמחי מעובד בעיכול בתמיסת אנזימים המפרקת את הדופן התאית.מסננים את התערובת שהתקבלה דרך בד גזה כדי להפריד את הפרוטופלסטים משאר חומרי הצמח. מטהרים את הפרוטופלסטים שנאספו בהמשך במדרג צפיפות של סוכרוז על ידי שכבה של תמיסת W five. הפרוטופלסטים נתרכזים בממשק שבין תמיסת האנזים לתמיסת ה-W five.הם נאספים ונשטפים לפני הניסוי. שלום, אני Jang Ja מהמעבדה של Lina Wauk במחלקה למדעי הגידולים והקרקע באוניברסיטת Cornell. היום נראה לכם פרוצדורה לבידוד של פוטוגרפים שלמים מ-TH בני 14 ימים של aro Ana.אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את הלוקליזציה התת-תאית של חלבוני העניין, לצורך בידוד של אברונים שלמים ולניתוח פונקציונלי של גנים באמצעות השתקת RNA (RNA interference) דו-גדילית. אז בואו נתחיל. נפתח את הפרוצדורה בהכנת מצעי MS בריכוז 0.5, מועשירים ב-1% sucrose וב-0.7% agar, עבור ליטר אחד של מצע.שקלו 2.15 גרם של אבקת MS. הוסיפו את האבקה ל-800 מיליליטר של מים בבקבוק בנפח 1.5 ליטר הניתן לעיקור (autoclavable) המכיל מגנט ערבוב, וערבבו את המצע על פלטת ערבוב עד להמסה מלאה של האבקה. הוסיפו טיפה אחר טיפה פתרון potassium hydroxide בריכוז נורמלי אחד כדי לכוון את ה-pH ל-5.7.המשיכו בערבוב והוסיפו 10 גרם סוכרוז. לאחר מכן, הוסיפו שבעה גרם אגר, אשר אינו נמס, אך ימומס מאוחר יותר במהלך האוטוקלאב. ולסיום, השלימו את הנפח ל-1000 מיליליטר.עקרו את מצע ה-MS באמצעות אוטוקלב בטמפרטורה של 121 °C למשך 20 דקות. השאירו את מוט השקיעה בתוך הבקבוק לאחר העיקור. ערבלו את המצע על גבי פלטת ערבוב עד לקירורו לטמפרטורה של כ-60 °C.ערבוב בזמן הקירור מונע מהאגר לשקוע בתחתית הבקבוק. אם ניתן להחזיק את הבקבוק בידיים למשך 10 שניות, סימן שהתווך התקרר מספיק וניתן למזוג אותו. עברו למנדף כדי למזוג את התווך לצלחוני פטרי בקוטר 150 מ"מ וגובה 15 מ"מ.90 מיליליטר לצלחת. יש לאחסן את הצלחות בטמפרטורה של 4°C. כעת, לאחר שהצלחות גדלו, הצמחים מוכנים.נכין את זרעי ה-Arabidopsis. נתחיל את גידול הצמחים על ידי עיקור של זרעי ה-Arabidopsis לצורך זריעה בצלחת פטרי אחת. נניח זרעים בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית של einor בכמות השקולה לנפח של 50 microliters.ראשית, חטרו את הזרעים באתנול על ידי הוספה של 1 mL של 70% ethanol וערבוב. דגרו היטב עם האתנול למשך שתי דקות, שבמהלכן ישקעו הזרעים. הוציאו כמה שיותר מהאתנול באמצעות פיפטה, ולאחר מכן חטרו עם תמיסת הלבנה על ידי הוספה של 1 mL של תמיסת bleach tween וערבוב למשך 10 דקות, תוך ביצוע vortexing מדי שתיים עד שלוש דקות.כדי להקל על הסרת תמיסת תמיסת ההלבנה, בצעו לסמנים ספינט-דאון (spin down) קצר ושאבו החוצה כמה שיותר מהתמיסה. שלב העיקור הסופי מבוצע במCב מנשבת זרימה למינרית. הוסיפו מיליליטר אחד של מים סטריליים לסמנים וערבבו היטב.סבבו את הזרעים במהירות בנצנץ (spin down) ושאבו את המים. חזרו על שטיפה זו במים ארבע פעמים נוספות. כעת, לאחר שהזרעים עוקרו, פזרו אותם על מצע ה-MS.לאחר פיזור הזרעים, השאירו את הפתחים המזרעים למשך 24 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחשכה לצורך סטריפיקציה. לאחר 24 שעות של דגירה, העבירו את הצמחים לתא גידול וגדלו אותם במשך 14 ימים. במחזור של שמונה שעות אור ו-16 שעות חושך, השתילים בני ה-14 ימים יהיו מוכנים לקציר.כעת, לאחר שהשתילים גדלו במשך שבועיים, הגיע הזמן להכין את הפרוטופלסטים תחת מנדף. השתמשו בלהב תער חד כדי לחתוך שני גרמים של שתילים ב-15 milliliters של תמיסת TVL שעברה סטריליזציה בסינון, בתוך צלחת פטרי. לאחר מכן, העבירו את הרקמות הקצוצות לכוס כימית של 200 milliliters העטופה בנייר אלומיניום.הוסיפו 20 milliliters של תמיסת אנזיםK סטרילית שעברה סינון והוכנה זה עתה כדי לפרק את דופן התא הצמחי. סובבו את הכלי לערבוב וכסו בנייר סופג ובנייר אלומיניום כדי לשמור על הרקמה בחשכה. המשיכו לנער את רקמות הצמח בתמיסת האנזים למשך 16 שעות בטמפרטורת החדר.בסיום הדגירה עם תמיסת האנזים, אספו את הפרוטופלסטים ששוחררו אל מבחנת פלקון של 50 מיליליטר על ידי סינון התערובת דרך שמונה שכבות של בד גזה שהורטבו מראש בתמיסת W five. שלפו את הפרוטופלסטים שנותרו על ידי שטיפה איטית של בד הגזה ב-10 מיליליטר של תמיסת W five. כעת הפרוטופלסטים נאספו במבחנת הפלקון. כסו בזהירות את הפרוטופלסטים ב-5 מיליליטר של תמיסת WW five.הקפידו לא להפר את מדרג הסוכר שנוצר על ידי הוספת תמיסת ה-W five. לאחר מכן, סבבו את הפרוטופלסטים בצנטריפוגה למשך שבע דקות ב-100 Gs. הפרוטופלסטים נאספים בממשק שבין תמיסת האנזים לתמיסת ה-W five. אספו 10 milliliters של נוזל מהממשק.העבירו את הפרוטופלסטים שנאספו לפלקון חד בנפח 50 milliliters והוסיפו 15 milliliters של תמיסת W five. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-60 gs. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו את העל-משקע (supernatant) ותלו את הפרוטופלסטים מחדש ב-15 milliliters של תמיסת W five.שוב, סבב את הפרוטופלסטים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-60 gs. לאחר הסבב, הסר את העלייה (supernatant) ושבב את המשקע. השהה את הפרוטופלסטים המשוקעים ב-1 עד 2 מיליליטר של תמיסת W five.לבסוף, העריכו את תנובת הפרוטופלסטים באמצעות ספירת תאים עם המוציטומטר תחת המיקרוסקופ. הליך התרבית המתואר כאן מניב נבטי arabidopsis בריאים המתאימים לבידוד פרוטופלסטים לאחר עיכול והפרדה במעלה דחיסות. קציר של גרם אחד של נבטים טריים מניב בדרך כלל 5 עד 10 פעמים 10⁶ פרוטופלסטים שלמים.הדגמנו כיצד לבודד פרוטופלסטים מעלים בני 14 ימים של aosis. בעת ביצוע הליך זה, חשוב מאוד לזכור שההצלחה תלויה בצמחים בריאים. לפיכך, חשוב לשמור על יחס של נבטים לצלחת ועל המפרטים המופיעים בפרוטוקול זה עבור net mills, ms.מדיום לכל צלחת. לבסוף, זכרו, ה-port plus שבריים מאוד. לאחר הוצאת התא, טיפלו ב-put bus בזהירות, ערבבו באמצעות פיפטינג במקום וורטקס, ובצעו פיפטינג למעלה ולמטה.זהו זה. תודה שצפיתם. בהצלחה בניסוי שלכם.

isolation-protoplasts-from-tissues-14-day-old-seedlings-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת...

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח...

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

השעון הביולוגי מווסת כשליש של transcriptome ארבידופסיס, אך אחוז הגנים המזינים בחזרה מדידת זמן נותר עלום. כאן אנו להמחיש שיטה להעריך פנוטיפים יממה במהירות בכל קו מוטציה של ארבידופסיס באמצעות הדמיה זורחת של עיתונאי יממה הביע זמני ב פרוטופלאסט.

ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

ההיתכנות והיעילות של שיטות scRNA-seq בעלות תפוקה גבוהה מבשרות על עידן חד-תאי בחקר צמחים. מוצג כאן הליך חזק ומלא לבידוד סוגי תאי שורש ספציפיים של Arabidopsis thaliana ובנייה וניתוח של ספריית שעתוק לאחר מכן.

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

פרוטוקול זה מתאר הכנת דגימות שלמות של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי Arabidopsis thaliana . השיטה דורשת רק ציוד מעבדה נפוץ, כגון מחט הזרקה ומלקחיים מדויקים, ומאפשרת הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה של תאי אנדוספרם בזרעים מתפתחים ובוגרים כאחד.

הכנת רקמה שלמה לאנליזה מיקרוסקופית של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי ארבידופסיס מתפתחים ובוגרים

מאמר זה ממחיש את הפרחים, טובלים...

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

למדו לבודד פרוטופלסטים שלמים מנבטי Arabidopsis thaliana בני 14 יום. השיטה משתמשת בפתרון אנזימים ומדרג סוכרוז לטיהור, ומספקת תאים ברי-קיימא למשך 96 שעות לפחות לניסויים בביולוגיה צמחית.

בידוד של Protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana

גלה סרטונים נוספים