Murine נוהל השתלת כליה
10 ביולי 2009
השתלת כליה בעכברים היא הליך מאתגר מבחינה טכנית זה דורש טיפול זהיר שלאחר הניתוח והטיפול להצלחה.
הליך השתלת הכליה בעכבר מתחיל בהוצאת איבר תורם, במסגרתה מוציאים את הכליה השמאלית מהעכבר התורם ומאחסנים אותה על קרח. את הכליה הימנית מוציאים מהעכבר המקבל כדי לפנות מקום עבור הכליה התורמת. לאחר מכן, מוציאים את הכליה התורמת מהקרח ומשתילים אותה בעכבר המקבל.
העכבר נשאר להתאושש במשך ארבעה ימים לפני הסרת הכליה הטבעית שנותרה. לאחר שבעה ימים, רמות הקריאטינין מנוטרות באמצעות מנתח קליני נייד מדגם I STAT כדי להעריך את תפקוד השתל. שלום, אני שרה היימר מהמעבדה של ד"ר גרג האדלי וממחלקת כירורגיית השתלות באוניברסיטת אוהיו סטייט.
היום נציג בפניכם פרוצדורה להשתלת כליה בעכבר. ניתוח השתלת הכליה שתראו היום יבוצע על ידי המומחית למדעי העצבים שלנו, Jing Wing. אנא השתמשו בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את האירועים האימונולוגיים של דחיית השתלה, כמו גם אסטרטגיות למניעת דחייה.
אם כן, בואו נתחיל. כדי להתחיל בהוצאת האיברים מהתורם, יש לבצע צביטה של מתג (toe pinch) כדי לוודא שהחיה נמצאת תחת הרדמה מלאה. תוך עבודה בשדה סטרילי ובשימוש במכשירים סטריליים, בצעו חתך בקו האמצע בעכבר המורדם, מהסטרנום (עצם החזה) ועד לעצם הפובס, וחשפו את הכליה השמאלית על ידי הזזת המעיים לצד ימין, וזאת כדי לבצע פרפוזיה של כלית התורם. קשרו תפרי משי 4-0 מסביב לאאורטה ולוריד החלול התחתון (inferior vena cava), מתחת ומעל לעורק ולוריד הרנליים.
בצעו פרפוזיה איטית in situ באמצעות תמיסת רינגר לקטט קרה והפריניזית דרך האורטה התת-כלייתית (infrarenal aorta). בודדו את הכליה השמאלית על ידי קשירה וחיתוך של כלי הדם של בלוטת האדרנל, השחלה/אשכים ומספר ענפים לומבריים באמצעות תפר משי 8-0. לאחר מכן, נגשו לחיבור שבין האורטה לווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava) יחד עם העורק והווריד הרנליים השמאליים; קשרו ארבעה תפרי משי 8-0 סביב האורטה והווריד הנבוב התחתון, מתחת ומעל לעורק ולווריד הרנליים.
כדי למזער דימומים, קשרו תחילה את האורטה מתחת לכלי הדם הכליותי. לאחר מכן, השתחררו את השופכן השמאלי מההילום הכליותי ועד לשלפוחית השתן. חשפו את נקודת החיבור של השופכן עם השלפוחית באמצעות רתק (retraction) של כיפת השלפוחית.
תוך הקפדה על הימנעות מהשופכן הימני, כריתה חלק אליפטי קטן מהשלפוחית השתן המכיל את חיבור השופכן השמאלי לשלפוחית. חלק זה ישמש לשחזור השתן באמצעות אנסטומוזה בין שלפוחית לשלפוחית. לאחר מכן, קשרו את האורטה מעל העורק והורין הכליתיים.
בצעו פריפוזיה איטית של הרפס (raft) in situ באמצעות תמיסת רינגר לקטט קרה והפריניזציה, דרך האורטה התת-כלייתית (infrarenal aorta). חתכו את האורטה באלכסון כשני מילימטרים מתחת לעורק הכליה. לבסוף, הוציאו את הכליה ואת אספקת הדם שלה, כאשר השופכן מחובר לרقعת השלפוחית (bladder patch) על גבי הבלוק.
יש לשמור את הכליה בתמיסת ringer's lactate על קרח עד לרגע השתלתה בגוף המקבל, ולהקריב את עכבר התורם באמצעות נשירת צוואר תחת הרדמה. כפי שהודגם בעבר, את השתלת המקבל מתחילים בלחצנית (pinch) כדי להבטיח שהחיה מורדמת באופן מלא. כדי להתחיל בניתוח, בצעו חתך בקו האמצע, כסו את המעי בגזה רטובה והסיטו אותו בזהירות לצד שמאל.
על מנת להשלים בהצלחה השתלה זו של כליה, יש לבצע אנסטומוזה בין השרוול האורטלי של התורם לבין האורטה של הרכיב. יש לבצע חיבור בין הווריד הרנלי של התורם לבין הווריד הנבוב התחתון של הרכיב, ובין טלאי שלב השפך של התורם לבין קשרי שלב השפך של הרכיב. השופכן הימני, העורק הרנלי והווריד.
הסר את הכליה לאחר קשירה. בודד בזהירות את הענפים הלומבריים ובצע תפסית (cross clamp) של אבי העורקים התת-כלייתי (infrarenal aorta) והוריד הנחית (inferior vena cava) באמצעות שני תפסים מיקרו-וסקולריים במידה של 4 מילימטרים. העבר תפר ניילון 10-0 דרך עוביו המלא של אבי העורקים ומשוך אותו כדי ליצור פתח אליפטי באבי העורקים (aorta otomy) באמצעות חיתוך יחיד שגודלו כחמישית מקוטר הכלי.
לאחר מכן, בצעו פתיחה אורכית של הווריד (venotomy) על ידי דקירה של הווריד הנחית (inferior vena cava) עם מחט בקוטר 30 gauge והרחיבו את הפתח כנדרש באמצעות מיקרו-מספריים. שטפו הן את האורטה והן את הווריד הנחית בתמיסת סלין עם הפרין כדי לנקות דם או קרישי דם מהלומן. הוציאו את הכליה התורמת מהקרח והניחו אותה בצדו הימני של העכבר.
מקמו שתי תפרים מקבעים (stay sutures) בשיא הפרוקסימלי והדיסטלי של ה-otomy באורטה של הרסיפיינט יחד עם השרוול האורטלי של התורם. בצעו אנסטומוזה מקצה לדופן (end to side) בין השרוול האורטלי של התורם לבין הדופן הקדמית של ה-otomy באורטה של הרסיפיינט, תוך שימוש בשני עד שלושה תפרי ניילון רציפים במידה 10 בחלק החיצוני של האורטה. לאחר מכן, הפנו את השתל של כלית התורם לעבר הצד השמאלי של הרסיפיינט.
חזור על הפרוצדורה הקודמת בין שרוול האורטה של התורמדופן האחורי של האורטה של המקבל. חשוב לזכור כי יש להשלים את האנסטומוזה של הווריד והעורק יחד בתוך 20 דקות. יש לשטוף את השתל עם סליין קר מספר פעמים במהלך האנסטומוזה.
בצעו אנסטומוזיס מקצה לדופן (end to side) בין הווריד הרנלי של התורם לבין הדופן האחורית של הווריד המערך התחתון (Inferior vena cava) של הרכיב, באמצעות ארבעה עד חמישה תפריים רציפים של nylon 10 בתוך הווריד המערך התחתון. סגרו את הדופן הקדמית של הווריד המערך התחתון ואת הווריד הרנלי של התורם באמצעות ארבעה עד חמישה תפריים רציפים מחוץ לווריד המערך התחתון. השלב הבא הוא חיתוך כיפת שלפוחית השתן של הרכיב.
עצרו את הדימום באמצעות כהות (cautery). עם השלמת הקיבוע, בצעו חתך קטן בכיפת השלפוחית והניחו שתי תפרים מקבעים (stay sutures) של 10-0 ניילון כדי לבצע אנסטומוזה בין טלאי השלפוחית הקטן של התורם לבין כיפת השלפוחית של המקבל. תפרו כל צד של האנסטומוזה באמצעות 8 עד 10 תפרים רציפים. לבסוף, סגרו את הבטן בשתי שכבות באמצעות תפרי ויקריל (vicryl) סינתטיים, סטריליים וספיגים, בחוט 4-0 רציף.
הטיפול לאחר הניתוח מתחיל במתן זריקה תוך-שרירית בודדת של penicillin. למקבל השתלה ניתן גם buprenorphine במינון של 0.05 milligrams per kilogram באופן תוך-שרירי ביום אפס וביום הראשון לאחר הניתוח לשיכוך כאבים, וכן אספקה רציפה של מים המכילים sulfa trim. ב-24 השעות הראשונות לאחר הניתוח, המיסר נשמר באינקובטור בעל בקרת טמפרטורה.
תפרי העור מוסרים שבועיים לאחר הניתוח. הסרת הכליה הטבעית הנותרת חיונית על מנת שניתן יהיה לנטר את הירידה בתפקוד השתל הכליתי באמצעות מדידות קריאטינין בנסיוב. פעולה זו מבוצעת בדרך כלל ארבעה עד שבעה ימים לאחר השתלת הכליה הראשונית מהתורם, והיא כוללת את השלבים העיקריים שבוצעו בעת כריתת הכליה מהעכבר התורם.
הסתרה באמצעות איזופלורן משמשת להרגעת חיית המארח כדי לאפשר איסוף של דגימות דם. רמות קריאטינין כמותיות בדם מלא שנלקחו מהווריד הרטרו-אורביטלי משמשות כמדד להערכת תפקוד הש Transplant ונקבעות באמצעות מכשיר ניתוח קליני נייד I stat. יחידות קונבנציונליות מומרות ליחידות SI על ידי הכפלת היחידות הקונבנציונליות ב-88.4.
ריכוז הקריאטינין מבוטא במיקרומול לליטר. בעלי החיים יתאוששו בדרך כלל שעתיים עד שלוש לאחר הניתוח, ויפגינו התנהגות עכברים רגילה לאחר הסרת הכליה המקורית שנותרה. הישרדות בעל החיים תלויה בתפקוד הש transplanted הכליה, שניתן להעריכו באמצעות בדיקות יומיות של בריאותו הכללית של בעל החיים ורמת הקריאטינין.
מדידת דם מלא באמצעות אנליזר קליני נייד מדגם i-STAT לצורך ייחוס. לעכבר נורמלי שלא עבר השתלה יש רמה של קראטינין הקרובה ל-20 micromolar. תפקוד לקוי של הש transplanted kidney ייחשב כאשר העכבר מראה סימני מחלה ורמת הקראטינין עולה לסביבות 100 micromolar.
הצגנו בפניכם את ההליך להשתלת כליה בעכבר. למרות שההליך מאתגר מבחינה טכנית, במעבדה שלנו השגנו הצלחה רבה בביצועו. זהו כל הפרוצדורה.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
השתלת כליה בעכברים היא הליך מאתגר מבחינה טכנית הדורש טיפול ומעקב קפדניים לאחר הניתוח לצורך הצלחתו. ההליך כולל הוצאה של הכליה מהתורם והשתלתה בעכבר המקבל, ולאחריה ניטור של תפקוד השתל.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של השתלה
- מודלים של עכברים
- טיפול פוסט-אופרטיבי
רקע
- השתלת כליות היא הליך קריטי במחקר.
- הדבר דורש טכניקות ניתוח מדויקות וניטור.
- הבנת תפקוד השטמא היא חיונית להצלחה.
- מודלים של עכברים נמצאים בשימוש נפוץ במחקרי השתלה.
מטרת המחקר
- להדגים את הליך השתלת כליה בעכבר.
- להדגיש את חשיבות הטיפול לאחר הניתוח.
- להעריך את תפקוד השתל באמצעות ניטור רמות קריאטינין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קציר הכליה השמאלית מהעכבר התורם.
- הסרת הכליה הימנית מהעכבר המקבל.
- השתלת כלית התורם אל העכבר המקבל.
- ניטור רמות creatinine באמצעות אנלייזר קליני נייד מסוג I STAT.
תוצאות עיקריות
- השתלת הכליה התורמת אל העכבר המקבל בוצעה בהצלחה.
- ההחלמה לאחר הניתוח מנוטרת לאורך ארבעה ימים.
- רמות הקריאטינין נבדקות לאחר שבעה ימים כדי להעריך את תפקוד השתל.
- הפרוצדורה מדגימה את ההיתכנות של השתלת כליה בעכברים.
מסקנות
- השתלה של כליות בעכברים היא מודל בר-קיימא לחקר תפקוד הכליות.
- ניטור קפדני לאחר הניתוח הוא קריטי להצלחה.
- מודל זה יכול לסייע בהבנת הביולוגיה של השתלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביסוס של מודלים מהימנים להשתקת כליות בעכברים מאפשר הפחתת סיכונים מכנית עבור מועמדים לאימונותרפיה המכוונים למסלולי דחיית השתלה. הליך זה תומך בתיקוף פרה-קליני של תכשירים ביולוגיים ומולקולות קטנות על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת הישרדות ותפקוד השטבל. ניטור כמותי של קראטינין באמצעות אנליזים ניידים מספק התאמה של סמנים ביולוגיים תרגומיים לצורך קבלת החלטות של go/no-go בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות אימונולוגיות במודלים של דחיית השתלה באמצעות תוצאות מבוקרות של הישרדות הש Transplant.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה כירורגית סטנדרטית עם שיעור הצלחה של >90%, ובכך מפחית שונות במחקרי תיקוף של מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: ייצור תוצאות כמותיות של קריאטינין בדם מלא באמצעות אנליזרי I-STAT להערכת תגובה למינון של תרכובות אימונו-מודולטוריות.
- ערך תפעולי: ביסוס פרוטוקולי טיפול לאחר ניתוח הניתנים לשחזור, כולל מתן פניצילין וסולפטריים, למעקב עקבי אחר תפקוד הש Transplant.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות הרלוונטי למחלה על ידי מתן אפשרות להערכה אורכית של תפקוד השתל באמצעות מדידות קריאטינין סדרתיות.
- ערך תפעולי: מסייע ברציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לביצוע נפרטומיה של הכליות המקוריות ביום 4-7, כדי לבודד את תפקוד הכליה התורמת לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
שילוב צינורות עיבוד וזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת מדדי תפקוד של השתל הניתנים לכימות, אשר מסייעים בזיהוי המועמדים המובילים ובקידום מבוסס ניהול סיכונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מטרות אימונומודולטוריות באמצעות שינויים מדידים ברמות הקריאטינין המשקפים פגיעה או הגנה של השתל.
- סקר (Screening): מספק מוכנות של הבדיקה באמצעות בקרה סטנדרטית של פגיעת רפרפוזיה ומניעת תרומבוזה במהלך האנסטומוזיס.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידות כמותיות של משתנה תלוי של קריאטינין בדם מלא במיקרומול לליטר, כאשר סף הדיספונקציה הוא סביב 100 µmol/L.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית על ידי שימוש בקריאטינין כסמן ביולוגי תרגומי התואם להערכה קלינית של תפקוד השתל.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את הפרוצדורה כפלטפורמה רב-פעמית עבור צוותי אימונולוגיה ונפרולוגיה החוקרים מנגנוני דחייה במגוון מודליות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באימונולוגיה של השתלות על ידי אספקת מודל מתוקף עם בקרות מוגדרות לפגיעה מרפרפוזיה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה באמצעות מפרט תפרים (10-0 nylon) ופרוטוקולי פרפוזיה של ringer's lactate עם הפרין.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי קישור עליית רמת ה-creatinine לתפקוד לקוי של הש Transplant, מה שמאפשר סיום מוקדם של מועמדים לא יעילים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות ספי שמרים אובייקטיביים לתפקוד הש Transplant, הנגזרים מניטור סדרתי של creatinine.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוכירורגיה בטכניקות של אנסטומוזה וסקולרית ושחזור השופכן.
- תלוי בגישה לאנליזים קליניים ניידים מסוג I-STAT לכמות קריאטינין בנקודת הטיפול.
- מחייב משטרי טיפול סטנדרטיים לאחר הניתוח, כולל פרופילקסה של אנטיביוטיקה וניהול כאב.
- כולל שיקולי התאמה עבור זני עכברים שונים המשפיעים על גודל כלי הדם ועל הטיפול בתפרים.
- מוגבל לחלון זמן של 20 דקות להשלמת האנסטומוזה כדי למנוע תרומבוזה ולהבטיח את חיוניות השתומה.
