Murine נוהל השתלת כליה
10 ביולי 2009
השתלת כליה בעכברים היא הליך מאתגר מבחינה טכנית זה דורש טיפול זהיר שלאחר הניתוח והטיפול להצלחה.
הליך השתלת כליה בעכבר מתחיל בהוצאת איבר מהתורם, שבה הכליה השמאלית מוסרת מהעכבר התורם ונשמרת על קרח. הכליה הימנית מוסרת מהעכבר המקבל כדי לפנות מקום לכלית התורם. לאחר מכן, כלית התורם מוצאת מהקרח ומושתלה אל העכבר המקבל.
העכבר נשאר להחלים במשך ארבעה ימים לפני הסרת הכליה המקורית שנותרה. לאחר שבעה ימים, רמות הקריאטינין מנוטרות באמצעות אנלייזר קליני נייד מסוג I STAT כדי להעריך את תפקוד הש transplanted. שלום, אני שרה היימר מהמעבדה של ד"ר גרג האדלי ומחלקת כירורגיית השתלה באוניברסיטת אוהיו סטייט.
היום נדגים לכם פרוצדורה להשתלת כליה בעכבר. ניתוח השתלת הכליה שתראו היום יבוצע על ידי המומחה הנוירוכירורג של המעבדה שלנו, Jing Wing. אנא השתמשו בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את האירועים האימונולוגיים של דחיית הש transplanted, כמו גם אסטרטגיות למניעת התרחשות דחייה.
בואו נתחיל. כדי להתחיל את קצירת איבר התורם, יש לבצע צביטה של בהונות הרגליים כדי לוודא שהחיה נמצאת תחת הרדמה מלאה. תוך עבודה בשטח סטרילי ובשימוש במכשירים שעברו סטריליזציה, בצעו חתך בקו האמצע בעכבר המורדם, מהסטרנום (עצם החזה) ועד לפוביס (עצם החיק), וחשפו את הכליה השמאלית על ידי הזזת המעי לצד ימין כדי לבצע פרפוזיה של כלית התורם. קשרו תפרי משי TY 4-0 מסביב לאאורטה ולוריד החלול התחתון, מתחת ומעל לעורק ולוריד הרנליים.
ביצוע פרפוזיה איטית in situ באמצעות תמיסת רינגר לקטט קרה והפריניזית דרך האורטה האינפרנלית. בידוד הכליה השמאלית על ידי ליגציה וחיתוך של כלי הדם של בלוטת האדרנל, האשכים ומספר ענפי מותניים באמצעות תפר משי 8-0. לאחר מכן, שחרור החיבור שבין האורטה לווריד הנבוב התחתון לבין העורק והווריד הרנליים השמאליים; קשירה של ארבעה תפרי משי 8-0 מסביב לאורטה ולווריד הנבוב התחתון, מתחת ומעל לעורק ולווריד הרנליים.
כדי למזער דימומים, קשרו תחילה את האורטה מתחת לכלי הדם הכליתי. לאחר מכן, בצעו דיסקציה של השופכן השמאלי מהקילת הכליה ועד לשלפוחית השתן. חשפו את נקודת החיבור בין השופכן לשלפוחית באמצעות רטרקציה של כיפת השלפוחית.
תוך הקפדה על הימנעות מהשופכן הימני, כורתים פיסת רקמה אליפטית קטנה מהשלפוחית השתן הכוללת את נקודת החיבור של השופכן השמאלי לשלפוחית. פיסת רקמה זו תשמש לשחזור השתן באמצעות אנסטומוזה בין שלפוחית לשלפוחית. לאחר מכן, קושרים את האאורטה מעל העורק והוריד הרנליים.
בצעו פרפוזיה איטית של ה-raft in situ באמצעות תמיסת רנגרס לקטט (ringers lactate) קרה עם הפרין, דרך האאורטה התת-כלייתית. חתכו את האאורטה באופן אלכסוני כשני מילימטרים מתחת לעורק הכליתי. לבסוף, הוציאו את הכליה ואת אספקת הדם הווסקולרית שלה, כאשר השופכן מחובר לרقعת השלפוחית כבלוק אחד.
יש לשמור את הכליה בתמיסת ringer's lactate על קרח עד להשתלתה בגוף המקבל, ולהקריב את עכבר התורם באמצעות דיסלוקציה צווארית תחת הרדמה. כפי שהודגם בעבר, את השתלת המקבל מתחילים בצביטה כדי לוודא שהבעלי חיים מורדמים לחלוטין. כדי להתחיל את הניתוח, בצעו חתך בקו האמצע, כסו את המעי בגזה רטובה והסיטו אותו בזהירות לצד שמאל.
על מנת להשלים בהצלחה השתלה זו של כליה, יש לבצע אנסטומוזה בין שולי האורטה של התורם לבין האורטה של המקבל. כמו כן, יש לבצע חיבור בין הווריד הרנלי של התורם לווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava) של המקבל, ובין טלאי השלפוחית של התורם לבין קשרי השלפוחית של המקבל. השופכן הימני, העורק הרנלי והווריד.
הסר את הכליה לאחר קשירה. במידה ובזהירות, בודד את ענפי המותניים ובצע תסמכימה (cross clamp) של האורטה התת-כלייתית (infrarenal aorta) והוריד הנבובת התחתון (inferior vena cava) באמצעות שני תסמיכים מיקרו-וסקולריים של 4 מילימטר. העבר תפר ניילון 10-0 דרך כל עובי האורטה ומתוח אותו כדי ליצור פתח אליפטי באורטה באמצעות חיתוך יחיד של כחמישית מקוטר כלי הדם.
בשלב הבא, בצעו פתיחה אורכית של הווריד (venotomy) על ידי דקירה של الوريد המערפכי התחתון (inferior vena cava) באמצעות מחט בדרגה 30, והרחיבו את הפתח כנדרש בעזרת מיקרו-מספריים. שטפו הן את האורטה והן את الوريد המערפכי התחתון בתמיסת מלח עם הפרין כדי לנקות דם או קרישי דם מהלומן. הוציאו את כלית התורמה מהקרח והניחו אותה בצד ימין של חלל הבטן (right flank) של העכבר.
מקם שתי תפרים מקבעים (stay sutures) בשיא הפרוקסימלי והדיסטלי של הפתח באורטה של הרכיב עם השרוול האורטלי של התורם. בצע אנסטומוזיס מקצה לדופן (end to side) בין השרוול האורטלי של התורם לבין הדופן הקדמית של הפתח באורטה של הרכיב, תוך שימוש בשניים עד שלושה תפרי ניילון רציפים במידה 10 בצד החיצוני של האורטה. לאחר מכן, העבר את הש transplanted kidney של התורם לצד השמאלי של הרכיב.
חזור על הפרוצדורה הקודמת בין שרוול האורטה של התורם לבין הדופן האחורית של האורטה של המקבל. חשוב לזכור כי יש להשלים את האנסטומוזה של הווריד והעורק תוך 20 דקות. כמו כן, יש לשטוף את הש transplanted graft בתמיסת סליין קרה מספר פעמים במהלך האנסטומוזה.
בצעו אנסטומוזיס מקצה לדופן (end to side) בין וריד הכליה של התורם לבין הדופן האחורית של הווריד הנבוב התחתון (Inferior vena cava) של המקבל, באמצעות ארבעה עד חמישה תפרירי ניילון 10 רציפים בתוך הווריד הנבוב התחתון. סגרו את הדופן הקדמית של הווריד הנבוב התחתון ואת וריד הכליה של התורם באמצעות ארבעה עד חמישה תפרירי רצף מחוץ לווריד הנבוב התחתון. השלב הבא הוא חיתוך כיפת שלפוחית השתן של המקבל.
עצרו את הדימום באמצעות קויה. ברגע שהקיבוע הושלם, בצעו חתך קטן בכיפת השלפוחית, הניחו שתי תפרים מקבעים (stay sutures) של nylon 10 כדי לבצע אנסטומוזה בין טלאי השלפוחית הקטן של התור לבין כיפת השלפוחית של המקבל. תפרו כל צד של האנסטומוזה באמצעות שמונה עד 10 תפרים רציפים. לבסוף, סגרו את הבטן בשני שכבות באמצעות תפרי vicryl סינתטיים, סטריליים וספיגים, מסוג 4 oh ברצף.
הטיפול לאחר הניתוח מתחיל במתן זריקה תוך-שרירית בודדת של penicillin. המקבל של הש移植 מקבל בנוסף 0.05 מיליגרם לקילוגרם buprenorphine באופן תוך-שרירי ביום אפס וביום הראשון לאחר הניתוח לשיכוך כאבים, וכן אספקה רציפה של מים המכילים sulfa trim. במהלך 24 השעות הראשונות לאחר הניתוח, העכברים נשמרים באינקובטור בטמפרטורה מבוקרת.
תפרים בעור מוסרים שבועיים לאחר הניתוח. הסרתו של הכליה המקורית שנותרה היא חיונית כדי שניתן יהיה לנטר ירידה בתפקוד השתל הכליתי באמצעות מדידות קריאטינין בסרום. הפעולה מבוצעת בדרך כלל ארבעה עד שבעה ימים לאחר ההשתלה הראשונית של הכליה מהתורמת, והיא כוללת את השלבים העיקריים המבוצעים בעת כריתת הכליה מהעכבר התורם.
הרדמה ב-ISO fluorine משמשת להרגעת חיית המארח על מנת שניתן יהיה לאסוף דגימות דם. רמות קריאטינין כמותיות בדם מלא שנלקחו מרטרו-אורביטלית משמשות כמדד להערכת תפקוד הש transplanted graft, והן נקבעות באמצעות אנלייזר קליני נייד מסוג I stat. יחידות קונבנציונליות מומרות ליחידות SI על ידי הכפלת היחידות הקונבנציונליות ב-88.4.
ריכוז הקריאטינין מבוטא במיקרומול לליטר. בעלי החיים יתאוששו בדרך כלל שתיים עד שלוש שעות לאחר הניתוח ויפגינו התנהגות עכברים רגילה לאחר הסרת הכליה הטבעית שנותרה. הישרדות בעל החיים תלויה בתפקוד השתל הכליתי, אותו ניתן להעריך באמצעות בדיקות יומיות של מצב הבריאות הכללי של בעל החיים ושל רמת הקריאטינין.
מדידת דם מלא באמצעות אנלייזר קליני נייד i-STAT לצורך ייחוס. לעכבר רגיל שאינו מושתל יש רמת קראטינין קרובה ל-20 micromolar. תפקוד לקוי של השתלה כלייתית נחשב כאשר העכבר מראה סימני מחלה ורמת הקראטינין עולה לסביבות 100 micromolar.
הרגע הצגנו בפניכם את ההליך להשתלת כליה בעכבר. למרות שההליך מאתגר מבחינה טכנית, המעבדה שלנו השיגה הצלחה רבה בביצועו. זהו כל ההליך.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
השתלת כליה בעכברים היא הליך מאתגר מבחינה טכנית הדורש טיפול ומעקב קפדניים לאחר הניתוח לצורך הצלחתו. ההליך כולל הוצאה של הכליה מהתורם והשתלתה בעכבר המקבל, ולאחריה ניטור של תפקוד השתל.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של השתלה
- מודלים של עכברים
- טיפול פוסט-אופרטיבי
רקע
- השתלת כליות היא הליך קריטי במחקר.
- הדבר דורש טכניקות ניתוח מדויקות וניטור.
- הבנת תפקוד השטמא היא חיונית להצלחה.
- מודלים של עכברים נמצאים בשימוש נפוץ במחקרי השתלה.
מטרת המחקר
- להדגים את הליך השתלת כליה בעכבר.
- להדגיש את חשיבות הטיפול לאחר הניתוח.
- להעריך את תפקוד השתל באמצעות ניטור רמות קריאטינין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קציר הכליה השמאלית מהעכבר התורם.
- הסרת הכליה הימנית מהעכבר המקבל.
- השתלת כלית התורם אל העכבר המקבל.
- ניטור רמות creatinine באמצעות אנלייזר קליני נייד מסוג I STAT.
תוצאות עיקריות
- השתלת הכליה התורמת אל העכבר המקבל בוצעה בהצלחה.
- ההחלמה לאחר הניתוח מנוטרת לאורך ארבעה ימים.
- רמות הקריאטינין נבדקות לאחר שבעה ימים כדי להעריך את תפקוד השתל.
- הפרוצדורה מדגימה את ההיתכנות של השתלת כליה בעכברים.
מסקנות
- השתלה של כליות בעכברים היא מודל בר-קיימא לחקר תפקוד הכליות.
- ניטור קפדני לאחר הניתוח הוא קריטי להצלחה.
- מודל זה יכול לסייע בהבנת הביולוגיה של השתלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביסוס של מודלים מהימנים להשתקת כליות בעכברים מאפשר הפחתת סיכונים מכנית עבור מועמדים לאימונותרפיה המכוונים למסלולי דחיית השתלה. הליך זה תומך בתיקוף פרה-קליני של תכשירים ביולוגיים ומולקולות קטנות על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת הישרדות ותפקוד השטבל. ניטור כמותי של קראטינין באמצעות אנליזים ניידים מספק התאמה של סמנים ביולוגיים תרגומיים לצורך קבלת החלטות של go/no-go בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות אימונולוגיות במודלים של דחיית השתלה באמצעות תוצאות מבוקרות של הישרדות הש Transplant.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה כירורגית סטנדרטית עם שיעור הצלחה של >90%, ובכך מפחית שונות במחקרי תיקוף של מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: ייצור תוצאות כמותיות של קריאטינין בדם מלא באמצעות אנליזרי I-STAT להערכת תגובה למינון של תרכובות אימונו-מודולטוריות.
- ערך תפעולי: ביסוס פרוטוקולי טיפול לאחר ניתוח הניתנים לשחזור, כולל מתן פניצילין וסולפטריים, למעקב עקבי אחר תפקוד הש Transplant.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות הרלוונטי למחלה על ידי מתן אפשרות להערכה אורכית של תפקוד השתל באמצעות מדידות קריאטינין סדרתיות.
- ערך תפעולי: מסייע ברציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לביצוע נפרטומיה של הכליות המקוריות ביום 4-7, כדי לבודד את תפקוד הכליה התורמת לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
שילוב צינורות עיבוד וזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת מדדי תפקוד של השתל הניתנים לכימות, אשר מסייעים בזיהוי המועמדים המובילים ובקידום מבוסס ניהול סיכונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מטרות אימונומודולטוריות באמצעות שינויים מדידים ברמות הקריאטינין המשקפים פגיעה או הגנה של השתל.
- סקר (Screening): מספק מוכנות של הבדיקה באמצעות בקרה סטנדרטית של פגיעת רפרפוזיה ומניעת תרומבוזה במהלך האנסטומוזיס.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידות כמותיות של משתנה תלוי של קריאטינין בדם מלא במיקרומול לליטר, כאשר סף הדיספונקציה הוא סביב 100 µmol/L.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית על ידי שימוש בקריאטינין כסמן ביולוגי תרגומי התואם להערכה קלינית של תפקוד השתל.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את הפרוצדורה כפלטפורמה רב-פעמית עבור צוותי אימונולוגיה ונפרולוגיה החוקרים מנגנוני דחייה במגוון מודליות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באימונולוגיה של השתלות על ידי אספקת מודל מתוקף עם בקרות מוגדרות לפגיעה מרפרפוזיה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה באמצעות מפרט תפרים (10-0 nylon) ופרוטוקולי פרפוזיה של ringer's lactate עם הפרין.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי קישור עליית רמת ה-creatinine לתפקוד לקוי של הש Transplant, מה שמאפשר סיום מוקדם של מועמדים לא יעילים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות ספי שמרים אובייקטיביים לתפקוד הש Transplant, הנגזרים מניטור סדרתי של creatinine.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוכירורגיה בטכניקות של אנסטומוזה וסקולרית ושחזור השופכן.
- תלוי בגישה לאנליזים קליניים ניידים מסוג I-STAT לכמות קריאטינין בנקודת הטיפול.
- מחייב משטרי טיפול סטנדרטיים לאחר הניתוח, כולל פרופילקסה של אנטיביוטיקה וניהול כאב.
- כולל שיקולי התאמה עבור זני עכברים שונים המשפיעים על גודל כלי הדם ועל הטיפול בתפרים.
- מוגבל לחלון זמן של 20 דקות להשלמת האנסטומוזה כדי למנוע תרומבוזה ולהבטיח את חיוניות השתומה.
