הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית
9 ביולי 2009
כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.
אנו מנתחים את הזחלים על ידי תפיסת הקצוות האחורי והקדמי, ולאחר מכן משיכת הפינצטה בכיוונים מנוגדים. רקמה עודפת מוסרת באמצעות מספריים דקים במיוחד. פעולה זו תחשוף את שני ההמיספרים של הדיסקים האימגינליים של מוח ועין הזחל.
החוט העצבי הבטני ווסי הפיה. קומפלקס העין והמוח של הזחל מועבר לתא תרבית. אנו מפרידים את אונו המוח מהגבעול האופטי כדי להדמיות נדידת תאי גליה בתוך דיסק דמיוני של עין מסוג פראי.
כדי לצפות בתאי גליאה שנעצרו בתוך הגבעול האופטי של מוטנט, אנו נשאיר את האונה המוחית מחוברת לגבעול האופטי. שלום, אני פטריק קאפרטי מהמעבדה של ונסה אל במחלקה לזואולוגיה באוניברסיטת הבריטיש קולומביה. שלום, אני רין.
החל מהיום, נראה לכם פרוצדורה להדמיה של תאי גליאה נודדים בעין של דרוזופילה (drosophila) בהתפתחות. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפתחות תאי הגליאה. אז בואו נתחיל.
שבוע לפני תחילת הניסוי, מזביגים זבובים כדי להפיק זחלים המבטאים GFP תחת שליטתו של מקדם ספציפי לגליות. ניסוי זה כולל ויזואליזציה של GFP המסומן ברצף למיקום גרעיני (nuclear localization sequence) המבטא בתאי גליה. באמצעות המקדם בעל הקוטביות ההפוכה, הכינו כיסויים עגולים בקוטר 18 מילימטר לפחות יום אחד מראש, על ידי השרייתם למשך 10 דקות בתמיסת 1% poly L lysine, ולאחר מכן ייבושם באוויר למשך הלילה ביום שלפני הניסוי.
נקה תא תרבית מגנטי בעל שרשרת על ידי השריה של רכיביו למשך לילה ב-70% ethanol ביום הניסוי. השתמש בטכניקות אספטיות להכנת מצע התרבית. הוסף fetal bovine serum, תמיסת penicillin ו-streptomycin, ו-insulin ל-10 milliliters של Schneider's insect medium.
יש לאפשר לתא תרבית מגנטי נקי עם שרשראות להתייבש באוויר בתוך מ cốcסיה של תרביות תאים, לפני שמיכולים שאריות אתנול על ידי שטיפה עם מדיום תרבית שהוכן. לאחר ביצוע הכנות אלו, ניתן להתחיל בניתוח של קומפלקס העין והמוח של ה-drosophila. כדי להתחיל בתהליך זה, יש לבחור פשפש בשלב הזחלים הנודדים (third instar wandering larvae) מצד של בקבוקר זבובים ולהניחו בטיפה של מדיום תרבית מקורר על צלחת פטרי על קרח למשך מספר דקות לצורך קירור.
מומלץ להמתין להאטה של התכווצויות הגוף הפריסטלטיות של הזחלים כדי להקל על הנתיחה. לאחר מכן, מקמו את הזחלים המקוררים בטיפה של מצע תרבית על צלחת מצופה בשעווה תחת מיקרוסקופ נתיחה; השתמשו בצבת דומון (Dumont) עדינה כדי לאחוז בחוזקה בזחלים. במרחק של כשליש מקצה הגב, המתינו עד שהזחלים יוציאו את וווי הפה מהקצה הקדמי, וכאשר וווי הפה פתוחים במלואם, אחזו בהם באמצעות זוג צבתות שני.
כדי לנצח את הזחלים, משכו באיטיות את שני זוגות הפינצטות לכיוונים מנוגדים. קומפלקס העין-מוח, יחד עם בלוטות הרוק, גופי השומן והרקמות האימגינליות, יישלפו מגוף הזחל. אין למשוך את ווים הפה במהירות רבה מדי, שכן הם עלולים להיקרע מקומפלקס ה-iBrain.
הסיר את בלוטות הרוק, את גופי השומן ואת הדיסקים האימגינליים. באמצעות מספרי חיתוך דקים במיוחד, שני המיספרות של המוח ודיסקי העין יישארו מחוברים לחוט העצבים הוונטרלי ולקרסי הפה. לאחר מכן, הנח כיסוי זכוכית של 18 מילימטר על גבי שלחית זכוכית, כך שאחד מקצוות כיסוי הזכוכית יבלוט מעבר לקצה השלחית. כדי לאפשר הרמה של כיסוי הזכוכית מאוחר יותר, הוסף טיפה של מצע תרבית על גבי כיסוי הזכוכית.
אחזו בוויי הפה בעזרת פינצטה והעבירו את קומפלקס המוח (iBrain complex) אל תוך תוצרי התרבית שעל לבידה המכסה (cover slip). לאחר שהועבר קומפלקס העין והמוח ללבידה המכסה, השתמשו במספרי ניתוח עדינים כדי לגזור את וויי הפה מקומפלקס העין והמוח.
הסרת וויי הפה (mouth hooks) חשובה לצורך דימוי חי, שכן וויי הפה ימשיכו להתכווץ בתוך תוצר התרבית ויגרמו לרקמה לזוז במהלך המיקרוסקופיה. כדי להדגים GL בתוך הגבעול האופטי (optic stalk), השאירו את הגבעול האופטי של המוח ואת הדיסק האימגינלי של העין שלמים. כדי להדגים נדידה גליאלית בתוך הדיסק האימגינלי של העין, חתכו בזהירות את הגבעול האופטי, הרקמה הדקה המחברת בין המוח לדיסק העין, והסיטו או השליכו את המוח.
לבסוף, הרימו את זכוכית הכיסוי באמצעות פינצטה ושרטטו עיגול מתחתיה מסביב לרקמה הרצויה בעזרת מרקר קבוע. עיגול זה יסייע באיתור הרקמה לצורך מיקרוסקופיה מאוחר יותר. כעת, הדיסק הדמיוני של העין (eye imaginal disc) מוכן להעברה לתא תרבית מגנטי.
כדי להרכיב את הדיסק האימג'ינלי של העין בתא תרבית מגנטי, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את הקצה התלוי של לביבת הזכוכית (cover slip) והעבירו את לביבת הזכוכית ללוח התחתון של תא המגנט מסוג chain line, מבלי להפריע לרקמה בתרבית. לאחר מכן, הניחו את טבעת הסיליקון (o-ring) על גוף התא הראשי של ה-chain line. התקינו את גוף התא על גבי הלוח התחתון באיטיות.
הוסיפו מצע גידול לתא. אין להוסיף את מצע הגידול במהירות רבה מדי כדי למנוע הפרעה לרקמה ולאפשר חילוף גזים תחת הכיסוי. אין למלא את התא לחלוטין; הניחו בעדינות את הכיסוי השקוף מעל תא קו השרישרת.
כדי לדמיין תאי גליה נודדים, הניחו את תא התרבית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקאלי או מיקרוסקופ פלואורסצנציה. אתרו את הדגימה בעזרת העיגול שעל זכוכית הכיסוי כנקודת ייחוס בהגדלה נמוכה. התמקדו בדגימה באמצעות עדשה של 40 פעמים.
אפשרו לרקמה להתייצב וצלמו את דיסקיות העין או את הגבעול האופטי בכל 10 עד 15 דקות לאורך של שלוש עד ארבע שעות, במידה שפרוטוקול זה בוצע נכון. פרוטוקול זה יניב סדרה של תמונות של תאי גליה המסומנים ב-GFP הנודדים מהגבעול האופטי אל תוך הדיסקית האימגינלית של העין. בעוד שדימות חיה למשך 60 דקות הספיקה כדי להבחין בשינויים במיקומם של גרעיני הגליה בדיסקיות עין אימגינליות מסוג בר (wild type), גרעיני הגליה בדיסקיות עין אימגינליות של מוטנט לגן ההכרחי לנדידת תאי גליה נכשלו לחלוטין ביציאה מהגבעול האופטי.
גידלנו קומפלקסים של עין-מוח למשך פרקי זמן של עד 240 דקות לפני שצפינו בהידרדרות של הרקמה המגודלת. לאחר נקודת הזמן של 240 דקות, התחלנו להבחין בתאים חיוביים ל-GFP במצע הגידול שסביב קומפלקסי העין-מוח המגודלים. בנוסף, GFP יצטבר בנקודות מפוזרות ברחבי הרקמות, מה שמרמז על פגיעה בשלמות הרקמה.
הראינו לכם כעת כיצד לתרבת דיסקים דמיוניים (imaginal discs) כדי לחקור נדידה של תאי גליה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לבחינת נדידת תאי גליה אל תוך עין ה-Drosophila המתפתחת. המחקר עושה שימוש בניתוח מיקרוסקופי של תאים חיים עם תאי גליה המסומנים ב-GFP כדי להמחיש תהליך זה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- תאי גליה ממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות מערכת העצבים.
- עין ה-Drosophila משמשת כמודל לחקר הגירה תאית.
- טכניקות של דימוי חי מאפשרות תצפית בזמן אמת על תהליכים תאיים.
- סימון ב-GFP מספק שיטה להדמיה של סוגי תאים ספציפיים.
מטרת המחקר
- לחקר הדינמיקה של נדידת תאי גליה במהלך התפתחות העין.
- להעמקת ההבנה של תפקודי תאי הגליה במערכת העצבים.
- לביסוס פרוטוקול למחקרים עתידיים על התנהגות תאית ב-Drosophila.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של פגלי Drosophila להגעה לדיסקים אימגינליים של העין.
- שימוש במספריים עדינים במיוחד להסרת רקמה עודפת לצורך ויזואליזציה.
- העברה של קומפלקס העין-מוח של הפג לרקמת תרבית.
- הפרדה של אונה של המוח מהגבעול האופטי לצפייה בנדידה של תאי גליה.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של נדידת תאי גליה בעין המתפתחת.
- הדגמת יעילות הפרוטוקול לצילום חי (live imaging).
- תובנות לגבי התנהגות תאי גליה בהקשר התפתחותי.
- ביסוס תשתית למחקרים עתידיים על תאי גליה.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקר מפורט של דינמיקת תאי גליאה.
- הממצאים תורמים להבנת ההתפתחות של מערכת העצבים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול מחקרים על תפקודי תאי גליאה בהקשרים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימיון חי של נדידת תאי גליה ב-Drosophila מספק מערכת ניתנת למניפולציה גנטית לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של יעדים לפיתוח תרופתי של הפרעות נוירו-התפתחותיות. הפרוטוקול מאפשר הערכה כמותית של דינמיקה תאית, ובכך תומך בתיקוף יעדים באמצעות סריקה פנוטיפית של פגמי נדידה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזיוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור הפרעות גנטיות לתוצאות תפקודיות במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של נדידה גליאלית כקריאה תפקודית של פעילות גנים בהתפתחות העצבית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על התנהגות תאית ברקמה חיה, ובכך מפחית את ההסתמכות על בדיקות עם נקודת סיום קבועה.
- ערך ניבוי: מייצר נתונים כמותיים על קצב הנדידה והכיווניות, ובכך מסייע במיון תיקי פיתוח בהתבסס על השפעה מכניסטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של דיסקים דמיוניים (imaginal discs) מאושרים של עיני Drosophila כמערכת רלוונטית למחלה לסריקה של מודולטורים גנטיים או פרמקולוגיים של נדידת גליה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימת העבודה בדימיון חי עם גליה המסומנת ב-GFP, המאפשרת קריאות כמותיות הניתנות לשחזור בתנאים ניסיוניים שונים.
- סקילביליות (Scalability): תומכת בשימוש חוזר בפלטפורמה למחקרים אורכיים, ומאפשרת דימיון בשיטת time-lapse לאורך 3–4 שעות כדי ללכוד תהליכי נדידה דינמיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: משתמש בתהליך ביולוגי שמור — נדידת גליות (glial migration) — כדי למדל מנגנונים של התפתחות עצבית הרלוונטיים למערכות של בעלי חולחולות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מקשר בין הפרעות גנטיות לתוצאות פנוטיפיות, ובכך מספק ראיות מוקדמות למעורבות של המטרה (target engagement) ולמודולציה של המסלול.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר קבלת החלטות של המשך/עצירה (go/no-go) על בסיס השאלה האם תרכובות או התערבויות גנטיות מצליחות לתקן פגמי נדידה במערכת חיה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת בדיקת תאים חיים לתיקוף מטרות, הממוקמת לפני זיהוי מובילים (lead identification) כדי להפחית סיכונים במטרות המשפיעות על התפתחות גליאלית ותמיכה נוירונלית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לצפייה בזמן אמת בתגובות גליאליות להפרעות גנטיות או סביבתיות.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות פרוטוקולי תרבית והדמיה סטנדרטיים, ומפיקה פלטים כמותיים כגון מהירות נדידה ודיוק בחיפוש נתיב.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של דפוסי נדידה בין מצבים של סוג בר (wild-type) למוטנטים, ובכך תומכת בתעדוף מטרות מבוסס נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול של מנגנון אינטראקציה גליאלי-נורוני שמור, הישים להפרעות של מערכת העצבים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת הדמיה לשימוש חוזר עבור מחקרים אורך, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של בדיקות בין פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולים של התפתחות עצבית המתווכה על ידי גליאל.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות שלבי דיסקציה, תרבית והדמיה מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי היתמכת זיהוי מוקדם של מטרות שאינן יעילות, ובכך מפחית את הסיכון לכשלים בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי זיהוי מטרות עם השפעות מוכחות על נדידה תאית במערכת חיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, דיסקציה של רקמה חיה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בתשתית של מיקרוסקופיה קונפוקלית או פלואורסצנטית ובכלים גנטיים לביטוי GFP ספציפי לתאי גליה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי התרבית ומרווחי הדמיה כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת המודל לאוכלוסיות גליאליות אחרות או לשלבים התפתחותיים שונים.
- מוגבל על ידי חיוניות הרקמה מעבר ל-240 דקות, כפי שצוין בפרוטוקול, דבר המגביל את חלונות התצפית למחקרי ארוך-טווח.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:57
Introduction
1:28
Pre-experiment Set Up
3:13
Dissection of the Drosophila Eye-Brain Complex
6:22
Mounting the Eye Imaginal Disc in a Magnetic Culture Chamber
7:41
Representative Results: Time-lapse Confocal Images
7:12
Visualization of Migrating Glial Cells in the Eye Imaginal Disc
8:53
Conclusion
