Name: הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: למדו הדמיה חיה של נדידת תאים גליה לתוך דיסק העין של דרוזופילה באמצעות תיוג GFP. פרוטוקול זה מאפשר מחקר דינמי של התפתחות מערכת העצבים בזבוב הפירות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פטריק Cafferty נתמך על ידי מענק דוקטורט מן האגודה לטרשת נפוצה בקנדה.

חלק 1: טרום הניסוי הגדרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבוע מראש, חבר זבובים ליצור זחל המבטאים GFP בשליטת היזם גליה ספציפי. לצורך ניסוי אנו דמיינו GFP מתוייגים עם רצף לוקליזציה גרעיני לידי ביטוי ותאי גלייה באמצעות קוטביות הפוכה (repo) מקדם (3, 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תלושי לכסות לפחות יום אחד מראש על ידי השריית 18 מ&quot;מ עגול תלושי לכסות במשך 10 דקות ב -1% פולי-L-ליזין פתרון אוויר יבש למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני הניסוי, לנקות תא Chamlide תרבות מגנטי על ידי השריית הרכיבים לילה אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי, להכין מדיום על ידי הוספת תרבות בסרום שור עוברית, פניצילין, סטרפטומיצין פתרון, אינסולין 10 מ&quot;ל של מדיום חרקים שניידר באמצעות הטכניקה aseptic. ריכוזי עובדים הם: 1X העובר שור בסרום; 100U/ml פניצילין, סטרפטומיצין 0.1mg/ml; ו 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אינסולין בינוני חרק של שניידר (שונה מ - (5)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר קאמרית תרבות לייבוש באוויר במנדף תרבית תאים. לשטוף אתנול שיורית מהאולם תרבות ע&quot;י שטיפה בינוני תרבות מוכנים. </li></ol> חלק 2: Dissection של המתחם תסיסנית העין למוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר הזחל שלישי instar נדודים מהצד של הבקבוקון זבוב מקום טיפת בינוני תרבות מקורר על צלחת פטרי על קרח למשך מספר דקות. Chilling הזחל מומלץ להאט התכווצויות הגוף peristaltic על מנת להקל על דיסקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזחל צונן בטיפת בינוני תרבות על צלחת מצופה Sylgard תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש זוג מלקחיים דומון בסדר בתקיפות לתפוס את הזחל כשליש הדרך מהקצה האחורי. המתן עד הזחל מוציא ווים פיו מסוף הקדמי. אחוז הפה קרסים עם זוג השני של מלקחיים על הרחבה מלאה. כדי לנתח את הזחל, לאט למשוך את שני זוגות מלקחיים בכיוונים מנוגדים. מתחם עין המוח, יחד עם בלוטות הרוק, גופים שומן, רקמת דמותי, ימשוך מהגוף הזחל. אל תמשוך הפה ווים מהר מדי אחרת הם יקרעו את מורכבות העין למוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך בלוטות הרוק, גופים שומן, דיסקים דמותי באמצעות אולטרה דק במספריים גוזז. שתי האונות של המוח העין דיסקים יצורף חוט העצב הגחון ווים הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 18 מ&quot;מ לכסות להחליק על גבי זכוכית נושאת. השאירו קצה אחד של להחליק את מכסה תלוי מעבר לקצה של השקופית כדי מאוחר יותר להרים את מכסה להחליק. הוסף טיפה של תרבות בינוני על גבי תלוש 18 מ&quot;מ מכסה. מעבירים את מורכבות העין אל המוח בינוני התרבות ידי אחיזה ווים הפה עם מלקחיים. אין להבין את מורכבות העין למוח ישירות עם מלקחיים או רקמת ייפגעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה בסדר, לקצץ את הפה ווים מתסביך העין למוח וזורקים. הסרת הווים הפה חשוב הדמיה לחיות כמו ווים הפה ימשיך החוזה במדיום תרבות גרימת רקמת לעבור במהלך במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש הגירה גליה בתוך הדיסק עין דמותי, בזהירות לחתוך את גבעול אופטיים, הרקמה הדקה שמחברת את המוח ואת הדיסק העין להרחיק או להשליך את המוח (ראה איור 1 א). כדי להמחיש גליה בתוך גבעול אופטיים, להשאיר את המוח, גבעול אופטיים, ואת הדיסק עין דמותי שלם (ראה איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את coverslip באמצעות מלקחיים לצייר עיגול מתחת סביב הרקמה של עניין עם סמן קבע. מעגל זה יהיה סיוע באיתור רקמה במיקרוסקופ בחלק 4. </li></ol> חלק 3: הרכבה הדיסק עין דמותי בתא תרבות מגנטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לתפוס את הקצה של coverslip תלוי. מעבירים את coverslip לצלחת התחתון של החדר המגנטי Chamlide מבלי להפריע את הרקמה בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את סיליקון O-Ring על הגוף העיקרי של החדר Chamlide. התקן את הגוף העיקרי על גבי צלחת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף בינוני תרבות לחדר. אל תוסיף את המדיום תרבות מהר מדי או רקמות של עניין יפריעו. לא לגמרי למלא את התא כדי לאפשר חילוף הגזים בחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום לכסות בעדינות בלתי נראה על גבי תא Chamlide. </li></ol> חלק 4: ויזואליזציה של תאים נודדים גליה דיסק העין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חדר תרבות על הבמה של מיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי. אתר את המדגם באמצעות עיגול על coverslip כהתייחסות על בהגדלה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על מדגם באמצעות עדשה 40X. אפשר הרקמה להתיישב על coverslip. צלמו תמונות של הדיסק עין או גבעול אופטיים בכל 10-15min במשך 3-4 שעות. רקמות עשויה להתעוות ולהעביר את המיקוד. מיקוד ידני את הרקמה לפני לכידת תמונה שיקלו ההוא הבעיה. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג: בביצוע נכון, פרוטוקול שלנו אפשרה לנו לאסוף סדרה של תמונות של ה-GFP-tagged ותאי גלייה כי היגרו גבעול אופטיים לתוך הדיסק עין דמותי (איור 1 BD). בעוד הדמיה לחיות לתקופה 60 דקות היה די כדי לצפות לשינויים בעמדות של גרעינים גליה בתוך דיסק עין הבר סוג דמותי, גרעינים גלייה מוטציה של הגן הכרחי נדידת תאים גליה נכשלה לחלוטין כדי לצאת גבעול אופטיים (חיצים איור 1 FH). יש לנו תרבות העין למוח מתחמי לתקופות עוד 240 דקות לפני התבוננות התדרדרות רקמת תרבותי. בעקבות נקודת זמן 240 דקות אנו מתחילים להתבונן בתאי ה-GFP חיובי בינוני התרבות הסובבת תרבותי העין למוח מתחמי (חץ איור 2 ג). ב-GFP בנוסף יהיה לצבור נקודות מפוזר בכל הרקמות מציע פירוט של רקמות שלמות. <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> איור 1: הדמיה חיה של גרעינים GFP-tagged גליה בסוג בר בפיתוח מערכות ראייה מוטציה. A, E) תמונות שצולמו באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה של סוג בר תרבותי מוטציה העין דמותי דיסקים (ED). בסוג בטבע, ותאי גלייה נולדים ולהעביר מן גבעול אופטי (OS) לתוך דיסק העין. המוח הוסר כדי להקל על השטחת הדמיה של הדיסק עין דמותי. BD) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הדיסק עין בר תרבותי סוג דמותי ב (א) על 0, 30, 60 נקודות זמן דקה מגלה GFP-tagged גליה גרעינים נודדים בתוך הדיסק העין. FH) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של המתחם העין למוח מוטנטי (ה) על 0, 30, 60 נקודות זמן דקה מדגים השתהות של גרעינים-GFP tagged גליה בתוך גבעול הראייה (חץ). המוח (BR) הושארה המצורפת גבעול הראייה לאפשר הדמיה של גליה בתוך גבעול. <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> איור 2: הדמיה חיה של ה-GFP-tagged ממברנות גלייה דיסק עין הבר סוג דמותי. יש לנו תרבות בהצלחה את העין למוח מתחמי עבור 240 דקות תקופות. בתרבית רקמה יותר מ 240 דקות מתחיל להישבר. בינוני התרבות הסובבת את הדיסק עין דמותי (ED), גבעול אופטי (OS) האונה במוח (BR) ב 0 (א) ו - 150 דקות (ב), לעומת 300 דקות זמן נקודה (C), ללא תשלום ה-GFP חיובי תאים, שמסומן על ידי החץ.

<ol><li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li>
<li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+migration+in+the+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li>
<li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

בפרוטוקול זה אנו מתארים תצפית של נדידת תאים גליה לתוך הדיסק עין דמותי חיים באמצעות מיקרוסקופ. בדוגמה שלנו סוג בר (איור 1 לספירה), השתמשנו סמן GFP גרעיני לצפות תנועת התא גליה דיסק העין במשך שעה אחת. בשנת מוטציה של הגן מועמד נדרש נדידת תאים גליה כיום תחת מחקר במעבדה שלנו, צפינו השתהות של גרעיני תאים גליה בתוך גבעול הראייה בתקופה של שעה (איור 1 EH). האסטרטגיה שלנו ניתן להתאים לדמיין פירוט של התנהגות הסלולר מוסדר על ידי הגנים שלנו של עניין. לדוגמה, קרום ממוקד מולקולת ה-GFP, כ...

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>מצע Schneider&amp;rsquo;s לחרקים</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Insulin מבלוטת הלבלב של בקר</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>תא מגנטי Chamlide</td><td>כלי</td><td>Live cell Instrument</td><td>CM-R-10</td><td>תא מסוג צלחית 35 mm לכיסוי זכוכית (coverslip) של 18 mm</td></tr><tr><td>מספרי חיתוך דקים במיוחד</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת Dumont #5</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מערכת דימוי פלואורסצנטית בעלת המסננים והעירור הדרושים עבור GFP.</td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

ותאי גלייה של חוליות והן חסרי חוליות האורגניזמים חייבים לנדוד לאזורים היעד הסופי כדי ensheath ותמיכה נוירונים הקשורים. למרות ההתקדמות האחרונות נעשה כדי לתאר את ההגירה של תאים חיים גליה באגף גלמי פיתוח (1), מחקרים של<em&gt; תסיסנית</em&gt; נדידת תאים גליה יש מעורבים בדרך כלל בדיקה של רקמת קבוע. ניתוח מיקרוסקופי של תאים חיים ניעתי מציעה את היכולת לבחון את התנהגות הסלולר לאורך כל תהליך הנדידה, לרבות קביעת שיעור ושינויים בכיוון של צמיחה. יחד עם שימוש בכלים גנטיים, הדמיה חיה יכול לשמש כדי לקבוע תפקידים מדויקת יותר עבור גנים ספציפיים בתהליך של פיתוח. עבודות קודמות על ידי Silies<em&gt; Et al.</em&gt; (2) תיאר את ההגירה של גליה שמקורם גבעול הראייה, מבנה שמחבר את עין בפיתוח המוח, לתוך דיסק העין דמותי ברקמות קבוע. כאן אנו מתאר פרוטוקול לבחינת הגירה של תאים חיים אל גליה<em&gt; תסיסנית</em&gt; עין דמותי דיסק. אנו מנצלים את קו תסיסנית המבטא GFP ב גליה פיתוח לעקוב אחר התקדמות תא גלייה בסוג פראי בחיות מוטציה.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

תאי גליה של אורגניזמים בעלי חולבקים וחסרי חולבקים חייבים לנדוד לאזורי מטרה סופיים על מנת לעטוף ולתמוך בנוירונים הקשורים אליהם. בעוד ש...

אנו מנתחים את הזחלים על ידי תפיסת הקצוות האחורי והקדמי, ולאחר מכן משיכת הפינצטה בכיוונים מנוגדים. רקמה עודפת מוסרת באמצעות מספריים דקים במיוחד. פעולה זו תחשוף את שני ההמיספרים של הדיסקים האימגינליים של מוח ועין הזחל.החוט העצבי הבטני ווסי הפיה. קומפלקס העין והמוח של הזחל מועבר לתא תרבית. אנו מפרידים את אונו המוח מהגבעול האופטי כדי להדמיות נדידת תאי גליה בתוך דיסק דמיוני של עין מסוג פראי.כדי לצפות בתאי גליאה שנעצרו בתוך הגבעול האופטי של מוטנט, אנו נשאיר את האונה המוחית מחוברת לגבעול האופטי. שלום, אני פטריק קאפרטי מהמעבדה של ונסה אל במחלקה לזואולוגיה באוניברסיטת הבריטיש קולומביה. שלום, אני רין.החל מהיום, נראה לכם פרוצדורה להדמיה של תאי גליאה נודדים בעין של דרוזופילה (drosophila) בהתפתחות. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפתחות תאי הגליאה. אז בואו נתחיל.שבוע לפני תחילת הניסוי, מזביגים זבובים כדי להפיק זחלים המבטאים GFP תחת שליטתו של מקדם ספציפי לגליות. ניסוי זה כולל ויזואליזציה של GFP המסומן ברצף למיקום גרעיני (nuclear localization sequence) המבטא בתאי גליה. באמצעות המקדם בעל הקוטביות ההפוכה, הכינו כיסויים עגולים בקוטר 18 מילימטר לפחות יום אחד מראש, על ידי השרייתם למשך 10 דקות בתמיסת 1% poly L lysine, ולאחר מכן ייבושם באוויר למשך הלילה ביום שלפני הניסוי.נקה תא תרבית מגנטי בעל שרשרת על ידי השריה של רכיביו למשך לילה ב-70% ethanol ביום הניסוי. השתמש בטכניקות אספטיות להכנת מצע התרבית. הוסף fetal bovine serum, תמיסת penicillin ו-streptomycin, ו-insulin ל-10 milliliters של Schneider's insect medium.יש לאפשר לתא תרבית מגנטי נקי עם שרשראות להתייבש באוויר בתוך מ cốcסיה של תרביות תאים, לפני שמיכולים שאריות אתנול על ידי שטיפה עם מדיום תרבית שהוכן. לאחר ביצוע הכנות אלו, ניתן להתחיל בניתוח של קומפלקס העין והמוח של ה-drosophila. כדי להתחיל בתהליך זה, יש לבחור פשפש בשלב הזחלים הנודדים (third instar wandering larvae) מצד של בקבוקר זבובים ולהניחו בטיפה של מדיום תרבית מקורר על צלחת פטרי על קרח למשך מספר דקות לצורך קירור.מומלץ להמתין להאטה של התכווצויות הגוף הפריסטלטיות של הזחלים כדי להקל על הנתיחה. לאחר מכן, מקמו את הזחלים המקוררים בטיפה של מצע תרבית על צלחת מצופה בשעווה תחת מיקרוסקופ נתיחה; השתמשו בצבת דומון (Dumont) עדינה כדי לאחוז בחוזקה בזחלים. במרחק של כשליש מקצה הגב, המתינו עד שהזחלים יוציאו את וווי הפה מהקצה הקדמי, וכאשר וווי הפה פתוחים במלואם, אחזו בהם באמצעות זוג צבתות שני.כדי לנצח את הזחלים, משכו באיטיות את שני זוגות הפינצטות לכיוונים מנוגדים. קומפלקס העין-מוח, יחד עם בלוטות הרוק, גופי השומן והרקמות האימגינליות, יישלפו מגוף הזחל. אין למשוך את ווים הפה במהירות רבה מדי, שכן הם עלולים להיקרע מקומפלקס ה-iBrain.הסיר את בלוטות הרוק, את גופי השומן ואת הדיסקים האימגינליים. באמצעות מספרי חיתוך דקים במיוחד, שני המיספרות של המוח ודיסקי העין יישארו מחוברים לחוט העצבים הוונטרלי ולקרסי הפה. לאחר מכן, הנח כיסוי זכוכית של 18 מילימטר על גבי שלחית זכוכית, כך שאחד מקצוות כיסוי הזכוכית יבלוט מעבר לקצה השלחית. כדי לאפשר הרמה של כיסוי הזכוכית מאוחר יותר, הוסף טיפה של מצע תרבית על גבי כיסוי הזכוכית.אחזו בוויי הפה בעזרת פינצטה והעבירו את קומפלקס המוח (iBrain complex) אל תוך תוצרי התרבית שעל לבידה המכסה (cover slip). לאחר שהועבר קומפלקס העין והמוח ללבידה המכסה, השתמשו במספרי ניתוח עדינים כדי לגזור את וויי הפה מקומפלקס העין והמוח.הסרת וויי הפה (mouth hooks) חשובה לצורך דימוי חי, שכן וויי הפה ימשיכו להתכווץ בתוך תוצר התרבית ויגרמו לרקמה לזוז במהלך המיקרוסקופיה. כדי להדגים GL בתוך הגבעול האופטי (optic stalk), השאירו את הגבעול האופטי של המוח ואת הדיסק האימגינלי של העין שלמים. כדי להדגים נדידה גליאלית בתוך הדיסק האימגינלי של העין, חתכו בזהירות את הגבעול האופטי, הרקמה הדקה המחברת בין המוח לדיסק העין, והסיטו או השליכו את המוח.לבסוף, הרימו את זכוכית הכיסוי באמצעות פינצטה ושרטטו עיגול מתחתיה מסביב לרקמה הרצויה בעזרת מרקר קבוע. עיגול זה יסייע באיתור הרקמה לצורך מיקרוסקופיה מאוחר יותר. כעת, הדיסק הדמיוני של העין (eye imaginal disc) מוכן להעברה לתא תרבית מגנטי.כדי להרכיב את הדיסק האימג'ינלי של העין בתא תרבית מגנטי, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את הקצה התלוי של לביבת הזכוכית (cover slip) והעבירו את לביבת הזכוכית ללוח התחתון של תא המגנט מסוג chain line, מבלי להפריע לרקמה בתרבית. לאחר מכן, הניחו את טבעת הסיליקון (o-ring) על גוף התא הראשי של ה-chain line. התקינו את גוף התא על גבי הלוח התחתון באיטיות.הוסיפו מצע גידול לתא. אין להוסיף את מצע הגידול במהירות רבה מדי כדי למנוע הפרעה לרקמה ולאפשר חילוף גזים תחת הכיסוי. אין למלא את התא לחלוטין; הניחו בעדינות את הכיסוי השקוף מעל תא קו השרישרת.כדי לדמיין תאי גליה נודדים, הניחו את תא התרבית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקאלי או מיקרוסקופ פלואורסצנציה. אתרו את הדגימה בעזרת העיגול שעל זכוכית הכיסוי כנקודת ייחוס בהגדלה נמוכה. התמקדו בדגימה באמצעות עדשה של 40 פעמים.אפשרו לרקמה להתייצב וצלמו את דיסקיות העין או את הגבעול האופטי בכל 10 עד 15 דקות לאורך של שלוש עד ארבע שעות, במידה שפרוטוקול זה בוצע נכון. פרוטוקול זה יניב סדרה של תמונות של תאי גליה המסומנים ב-GFP הנודדים מהגבעול האופטי אל תוך הדיסקית האימגינלית של העין. בעוד שדימות חיה למשך 60 דקות הספיקה כדי להבחין בשינויים במיקומם של גרעיני הגליה בדיסקיות עין אימגינליות מסוג בר (wild type), גרעיני הגליה בדיסקיות עין אימגינליות של מוטנט לגן ההכרחי לנדידת תאי גליה נכשלו לחלוטין ביציאה מהגבעול האופטי.גידלנו קומפלקסים של עין-מוח למשך פרקי זמן של עד 240 דקות לפני שצפינו בהידרדרות של הרקמה המגודלת. לאחר נקודת הזמן של 240 דקות, התחלנו להבחין בתאים חיוביים ל-GFP במצע הגידול שסביב קומפלקסי העין-מוח המגודלים. בנוסף, GFP יצטבר בנקודות מפוזרות ברחבי הרקמות, מה שמרמז על פגיעה בשלמות הרקמה.הראינו לכם כעת כיצד לתרבת דיסקים דמיוניים (imaginal discs) כדי לחקור נדידה של תאי גליה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

live-imaging-glial-cell-migration-drosophila-eye-imaginal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים רומן אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP) כתב כי באה לידי ביטוי במיוחד...

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של מוח דרוזופילה טרנסגני להדמיה חד-תאית של תאי גליה. המוח מבטא חלבונים ממוקדי ממברנה המאוחים עם שילובים שונים של אפיטופים אנטיגניים תחת שליטת מערכת רקומבינאז ספציפית לגליה. המוחות המבודדים והקבועים מוכתמים בנוגדנים ראשוניים ספציפיים לאפיטופים האנטיגניים, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. תיוג זה מאפשר הדמיה בו-זמנית של תת-אוכלוסיות שונות של תאי גליה על פני אזורי מוח שונים.

צביעה אימונופלואורסצנטית של מוחות דרוזופילה להדמיה חד-תאית של תאי גליה

מקור: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון מדגים טכניקת הדמיה חיה לחקר דפוסי עיניים בגולם Drosophila melanogaster. סמנים מתויגים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מאפשרים הדמיה של ארגון התאים והתמיינות במהלך היווצרות מבנה העין המתפתח.

הדמיה חיה של עין הגולם של דרוזופילה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

אנו מתארים פרוטוקול למדידת מגעים בין תאים בשכבות אפיתל סמוכות בדיסקים דמיוניים חיים של כנפי דרוזופילה באמצעות גישה מבוססת בנייה מחדש של GFP.

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

למדו הדמיה חיה של נדידת תאים גליה לתוך דיסק העין של דרוזופילה באמצעות תיוג GFP. פרוטוקול זה מאפשר מחקר דינמי של התפתחות מערכת העצבים בזבוב הפירות.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

גלה סרטונים נוספים