Name: כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: למד שיטה לכימות תוחלת החיים הכרונולוגית של שמרים באמצעות מדידת צפיפות אופטית בתדירות גבוהה. השיטה מאפשרת ניתוח כמותי של אבדן התפקוד התאי לאורך זמן בתרביות מזדקנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט 1R21AG031965-01A1. ח&quot;כ הוא רפואי אליסון קרן מלומד חדש הזדקנות.

חלק 1: הכנת תרבויות הזדקנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak זנים של עניין ממניות קפוא על גבי צלחות אגר YEPD (1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, אגר 2%, גלוקוז 2%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 30 ˚ C למשך 48 שעות או עד מושבות יחיד להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות יחיד לחסן לתוך 5 מ&quot;ל של מדיום נוזלי YEPD (1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, גלוקוז 2%) במבחנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות לילה ב 30 ˚ C תוך שמירה על תסיסה מתמדת שימוש או שייקר או תוף הרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מ&quot;ל של מדיום מלאכותי (SC) שלמה (טבלה 1) עם 50 μL של תרבות לילה. בדרך כלל שלוש תרבויות SC מוכנים להתאמץ כדי לספק כל שכפול בשלושה עותקים הביולוגי של ניתוח תוחלת החיים עבור כל זן נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על תרבויות ב 30 ˚ C עם תסיסה מתמדת על תוף מכבש לצורך הניסוי כולו (בדרך כלל 2 או יותר שבועות). </li></ol> חלק 2: לקיחת הכדאיות גיל נקודה לאחר יומיים של התרבות SC התקשורת, התאים צריכים להיות בשלב נייחים הראשונה בגיל נקודת מוכן לקחת. לאחר גיל נקודות צריך לקחת כל 2-3 ימים למשך תקופה מינימלית של שבועיים. עבור כל נקודה גיל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את Bioscreen 100-גם צלחות הכוורת עבור חיסון ידי מילוי כל טוב עם 145 μL של YEPD. הקפד להשאיר לפחות אחד מילא היטב עם YEPD בלבד ולא התאים לניתוח נתונים מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התרבויות הזדקנות מן החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בקצרה את התרבות הראשון מחוסן לתוך הצלחת הכוורת, בעוד נזהרים שלא לשפוך את כל התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 5 μL של התרבות מעורבת פיפטה אותו היטב הראשון של הצלחת הכוורת. הלהבה את קצה הצינור כל בדיקה לפני ואחרי הסרת aliquot 5 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך זה עבור כל תרבות הזדקנות להיות בטוח לציין את המיקום המתאים גם כל תרבות. עמדות גם זהים יש להשתמש עבור כל הבאים לגיל נקודה לאורך הניסוי כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את תרבויות לתוך 30 ˚ C החממה כאשר סיים עם חיסונים. </li></ol> חלק 3: טעינת המכשיר Bioscreen C-MBR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את תא חממה על ידי הרמת המכסה והסר את כיסוי למגש המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת הכוורת מחוסן החדש למגש מדגם (להשתמש בחריץ שמאל אם אתה רק קריאה אחת צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את מכסה למגש מדגם ולהפחית את המכסה לתא האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כדי לוודא את הנוזל העברת החום הוא מעל פני המילוי המינימלי. אם נמוך, להוסיף יותר באמצעות פיפטה 1000 μL עם הנוזל החום העברת סיפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנה Bioscreen &quot;EZExperiment&quot;, להגדיר את הפרמטרים הבאים כדי להשיג עקומות גדילה מתאים cerevisiae Saccharomyces: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר דוגמאות: הזן את מספר בארות עם התקשורת או 200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן: 420-580nm, פס רחב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורה: 30 ˚ C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורך הניסוי: יום 1, 0 שעות, 0 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרווח מדידה: 30 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טלטול: ביום רועד, רציף, גבוהה </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;התחל&quot; כדי להתחיל בקריאה. </li></ol> חלק 4: ניתוח נתונים בדרך כלל, שישה לגיל נקודות נלקחים במשך שבועיים. גיל נקודות נלקחה ב 2 ימים, 4, 6, 9, 11 ו 13. בהתאם לעיצוב ניסיוני זנים למבחן, זה עשוי להיות רצוי לקחת לגיל נקודות פחות או יותר, לעתים קרובות או למשך זמן ארוך יותר מ -2 שבועות. חשוב לטעון את הכוורת צלחת באותו סדר עבור נקודת בגיל כל כך שכל תרבות הזדקנות מתאים לתפקיד גם באותה נקודה בכל גיל, כמו זו יהפכו את ניתוח הנתונים הרבה יותר קל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את קבצי פלט מן המכונה C-MBR Bioscreen. התוכנה &quot;EZExperiment&quot; יהיה פלט הנתונים Bioscreen כקובץ מופרד באמצעות טאבים התואמת Microsoft Excel, כמו גם תוכנות אחרות. העמודה הראשונה מראה באיזו שעה המדידה OD צולמה במהלך הניסוי, עם עמודות עוקבות המייצגים כל היטב את הצלחות Bioscreen הכוורת (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הקריאה הראשונה OD מהעמודה מדי. קריאה זו היא &quot;רעש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמל את הנתונים על ידי הפחתת ערך OD הבאר עם YEPD לבד כל עמודה מכל ערכי OD. זה מסיר את ספיגת רקע על ידי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את הקימורים תוצאה. עקומות יעבור כפונקציה של גיל (איור 2). לדוגמה, על ידי מתכננים את עקומות תולדה מעמודה 1 (גם 1 הצלחת הכוורת) על שש נקודות זמן, יש תזוזה ימינה של עקומות שונות לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את זמן ההכפלה (δ) עבור כל מבוסס היטב על קינטיקה צמיחה של 2 יום לגיל נקודה. המשוואה לחישוב זמן ההכפלה is: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="משוואה" /> שם OD OD 1 ו 2 מייצגים מדידות עוקבות OD ו-t 1 ו t 2 לעת עתה בין המדידות. חישוב הכפלת פעמים בלבד בין ערכי OD של 0.2 עד 0.5. הממוצע של ערכים אלה הוא זמן ההכפלה עבור היטב. חישוב הכפלת פעמים בלבד בין ערכי OD של 0.2 עד 0.5. הממוצע של ערכים אלה הוא זמן ההכפלה עבור היטב. רוב wild-type זני שמרים צריך לתת זמן הכפלת ערך בין 85 עד 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודה גיל, לחשב את זמן המעבר (Δt) את עקומות תוצאה יחסית הראשונית לגיל נקודה (יום 2). דרך קלה לעשות זאת היא לקבוע את ההבדל משך הזמן שנדרש גם כל להגיע OD של 0.3 בין ראשוני לגיל נקודה וכל הבאים לגיל נקודה. השעה מסוים הגיעו גם OD של 0.3 ניתן לחשב מתוך המשוואה רגרסיה ליניארית המתאים ln (OD) כפונקציה של זמן בין שתי נקודות זמן שניצבות OD = 0.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב חלק לשרוד בשלב בגיל זה על מנת ליצור עקומת ההישרדות (איור 3). הגדר הראשוני לגיל נקודה (יום 2) להיות הכדאיות של 100%. עבור כל רצופים גיל נקודת לחשב את אחוז ההישרדות באמצעות המשוואה: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="שנית משוואה" width="245" height="115" /> שם של n הוא אחוז ההישרדות, Δt n הוא שינוי הזמן, δ n הוא זמן ההכפלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת עקומות ההישרדות (איור 3B) הרצוי עבור כל (או לשכפל בארות) גם על ידי מתכננים את השבר (או אחוז) של תאים קיימא כפונקציה של גיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב נפרד ההישרדות (SI) עבור כל טוב. ת&quot;י מוגדר כשטח תחת עקומת ההישרדות יכול להיות מוערך על ידי הנוסחה: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="משוואה 3" width="400" height="79" /> גיל n היכן הוא הגיל נקודות (לדוגמא: 2, 4, 6, 9, 11 ו 13) ו-S n הוא ערך הישרדותי בנקודה בגיל זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת פרמטרים סטטיסטיים של בארות לשכפל מהנתונים SI והישרדות. פרמטרים סטטיסטיים נפוצים עניין כוללים חציון מתכוון, ו שונות עבור כל קבוצה של הביולוגי משכפל. T-test או ניתוח דומה ניתן להשתמש לצורך השוואה pairwise של SI עבור ניסויים שונים וקבוצות שליטה. זה יכול להיות גם רצוי ליצור עקומות הישרדות, כמתואר מ בממוצע ביולוגי משכפל ב 4.8. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג בסיום הניסוי, תצטרך להתוות את עקומת ההישרדות וביצע ניתוח נתונים מספיקים כדי לקבוע את פוטנציאל ההזדקנות הכרונולוגי של זנים שונים, או כמה תנאים. אם מבוצעת כראוי, עקומות גדילה המתקבל המכונה C-MBR Bioscreen צריך להיראות דומים לאלה שמוצג באיור 2 ואת עקומות הישרדות וכתוצאה מכך צריכה להיות דומה לאלה שמוצג באיור 3. באופן כללי, wild-type תאים בתרבית בתנאים שתוארו כאן תהיה תוחלת החיים החציונית כרונולוגי בסדר גודל של 7 ימים. וריאציה משמעותית הישרדות היא נצפתה זנים שונים תחת כמה תנאים, כגון גדילה בתקשורת גלוקוז 0.05%, חציון ההישרדות יכול לעלות על 30 ימים. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> 1. באיור נתונים פלט מן &quot;EZExperiment&quot; Bioscreen התוכנית. טור מציג את הזמן שבו קריאה ספיגת נלקח. עמודות רצופים לייצג את בארות הצלחת הכוורת מחוסן עם תאים שנלקחו מתרבויות ההזדקנות. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> איור 2. עקומות תולדה מן לשכפל ביולוגי אחד במהלך ניסוי. יש שינוי בולט עקומות במשך הזמן התאים בתרבית ההזדקנות לאבד הכדאיות. משך הזמן בין נקודת הזמן הראשונית (יום 2) ונקודת זמן רצופים קובע הכדאיות בגיל מסוים. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> איור 3. א) עקומת ההישרדות שנוצר באמצעות הנתונים תולדה של איור 1. 2 ביום נקודת זמן מוגדר כנקודת את הכדאיות של 100%. B) עקומות הישרדות הסופי של שני הזנים שנבדקו בניסוי זהה. אלה עקומות הישרדות לייצג את viabilities ממוצע של שלושה ביולוגיים משכפל עבור כל זן. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן תוך ביולוגי משכפל. אזור מוצל מתחת לעקומה מייצג את הישרדות הישרדות אינטגרלי (SI) עבור זן 1. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> טבלה 1. מוגדר בינוני סינתטי משמש ללימודי הזדקנות כרונולוגית (זן backgrouBY4743 nd) </td></tr><tr><td> רכיב </td><td> ריכוז (g / L) </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> 20 </td></tr><tr><td> חנקן שמרים הבסיס (-AA/AS) </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> אדנין </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-ארגנין </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-חומצה אספרטית </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-חומצה גלוטמית </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-היסטידין </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-לאוצין </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L-ליזין </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L-מתיונין </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-פנילאלנין </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-סרין </td><td> 0.375 </td></tr><tr><td> L-תראונין </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-טריפטופן </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-tyrosine </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L-valine </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> אורציל </td><td> 0.1 </td></tr></tbody></table> הערה: מתכון זה מהווה auxotrophies ב זן דיפלואידי BY4743. Auxotrophies חומצות אמינו צריך להיות מתוגמל על ידי הוספת הריכוז הסופי 5X למדיום להשלים סינתטי.

<ol><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29(2008).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73(2003).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113(2008).</li>
<li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055(2004).</li>
</ol>

תפוקה גבוהה כרונולוגי תוחלת החיים assay המתוארת כאן היא שיטה יעילה לכימות פוטנציאל התיישנות מספר גדול של זנים עם דיוק דיוק גבוהה. ההתקדמות העיקרית של שיטה זו על פני שיטות קלאסיות לקביעת הישרדות ידי ספירת המושבה להרכיב יחידות (לדוגמא: לראות 3) הוא השימוש במכשיר שייקר / חממה / צלחת קריאה כמו מכונה C-MBR Bioscreen להשיג רזולוציה גבוהה עקומות צמיחה בכל גיל נקודה. לשם השוואה ישירה עם תפוקה נמוכה תוחלת החיים מבחני כרונולוגי, שיטה זו הוכח להשיג דיוק דומה (או יותר), בעוד משמעות...

<table><tbody><tr><td>Bacto Peptone</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base ללא חומצות אמינו וסולפט של אמון</td><td>ריאגנט</td><td>MidSci</td><td>J630-500G</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>ריאגנט</td><td>Spectrum</td><td>AM185</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר Bioscreen C MBR</td><td>כלי</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>פלטת Honeycomb בעלת 100 בארות של Bioscreen</td><td>כלי</td><td>Growth Curves USA</td><td>9502550</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

שמרים ניצני<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; הוכיחה להיות אורגניזם מודל חשוב בתחום של מחקר ההזדקנות<sup&gt; 1</sup&gt;. Replicative ואת תוחלת החיים כרונולוגי שתי פרדיגמות הוקמה בשימוש ללמוד הזדקנות בשמרים. הזדקנות replicative מוגדר כמספר התאים בת תא יחיד אמא שמרים מייצרת לפני הזדקנות, הזדקנות כרונולוגי מוגדר על ידי האורך של התאים זמן יכול לשרוד במצב הלא חלוקת קפאון כמו,<sup&gt; 2</sup&gt;. פיתחנו שיטת תפוקה גבוהה עבור מדידה כמותית של תוחלת החיים כרונולוגי. שיטה זו כרוכה הזדקנות התאים בינוני מוגדר תחת תסיסה בטמפרטורה קבועה. בשלב גיל זה, האוכלוסייה משנה של תאים יוסר התרבות הזדקנות מחוסן לתוך מדיום גידול עשיר. רזולוציה גבוהה עקומת גדילה מתקבל אז לאוכלוסייה קטן זה של תאים בגילאי באמצעות מכונה Bioscreen C-MBR. אלגוריתם מוחל אז כדי לקבוע את חלקם היחסי של תאים קיימא באוכלוסייה משנה כל מבוסס על קינטיקה צמיחה בנקודה בגיל זה. שיטה זו דורשת זמן ומשאבים באופן משמעותי פחות בהשוואה כרונולוגי מבחני אחרות תוחלת החיים תוך שמירה על שחזור ודיוק. אופי תפוקה גבוהה של assay זה אמור לאפשר בקנה מידה גדול מסכי גנטיים כימיים לזהות מכפילי אריכות ימים הרומן לבדיקה נוספת של אורגניזמים מורכבים יותר.

הזדקנות בשמרים כרונולוגית מתייחס לאובדן של כדאיות התא הקשורים זמן בשלב נייח. כאן אנו מתארים את שיטת תפוקה גבוהה עבור כמותית בקביעת תוחלת החיים בשמרים כרונולוגי.

השמר המנצץ Saccharomyces cerevisiae הוכח כאורגניזם מודל חשוב בתחום מחקר ההזדקנות 1. היכולת הרפליקטיבית וה...

תרביות מזדקנות מתוחזקות במבחנות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius בערבול קבוע. באמצעות תוף מסובב, מוקנית מנה של תאים מכל תרבית מזדקנת לתוך באער של פלטת bio screen honeycomb המכילה מצע YEPD. מכשיר ה-bio screen CMBR מדגיר ומנער את פלטת ה-honeycomb למשך 24 שעות תוך כדי מדידת הצפיפות האופטית של כל באער.ניתן להפיק עקומות גדילה בכל 30 דקות מנתוני הפלט של ה-bio screen, שניתן להשתמש בהן כדי לחשב את החיות של כל תרבית מזדקנת. לאחר דגירה של 24 שעות, צפיפות התאים בבארים של פלטת ה-honeycomb עשויה להשתנות בהתאם לחיוּת התרבית המזדקנת המקורית. שלום, אני כריס מורקמי מהמעבדה של ד"ר מאט קפליין וממחלקת הפתולוגיה כאן באוניברסיטת וושינגטון.היום נדגים את הפרוצדורה לכימות תוחלת החיים הכרונולוגית של שמרים באמצעות צמיחה מחדש של תאי גיל. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור כיצד גורמים גנטיים וסביבתיים משפיעים על אריכות הימים של השמרים. אז בואו נתחיל.להכנת תרבימי הזדקנות, ראשית בצעו מריחה של זני השמרים ממאגרים קפואים על צלחות YEPD עם אגר, והדגירו את התאים בטמפרטורה של 30 °C למשך 48 שעות או עד להופעת מושבות בודדות. לאחר הופעת מושבות בודדות, בחרו מושבות בודדות והחדירו אותן ל-5 mL של מצע נוזלי YEPD.גדלו תרביות במבחנות למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius בתוך תוף סיבוב (roller drum) כדי לשמור על ערבוב קבוע. לאחר דגירה של לילה, השתמשו ב-50 µL מכל תרבית כדי להחדיר אותן ל-5 mL של מצע סינתטי מלא (synthetic complete medium). בדרך כלל מכינים שלוש תרביות SC עבור כל זן, כדי להשיג חזרות ביולוגיות שולשיות של ניתוח תוחלת החיים עבור כל זן הנבדק. שמרו על התרביות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם ערבוב קבוע בתוף סיבוב למשך כל הניסוי, הנמשך בדרך כלל שבועיים או יותר לאחר יומיים של גידול התרביות.במצע SC, התאים צריכים להיות בשלב סטציונרי, ואז נקודת הגיל הראשונה מוכנה לדגימה. נקודות גיל עוקבות יש לדגום מדי יומיים עד שלושה ימים למשך שבועיים לפחות. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את מסך הביו (bio screen).השתמשו בלוחיות honeycomb בעלות 100 בארות עבור ההסכמה (inoculation), ומלאו כל בארה ב-145 µL של YEPD. הקפידו להשאיר לפחות בארה אחת מלאה ב-YEPD בלבד ללא תאים, לצורך ניתוח נתונים מאוחר יותר. הוציאו את תרביות ההזדקנות מהאינקובטור.בקצרה, ערבבו בוורטקס (vortex) את התרבית הראשונה שתוחדר לפלטת הדבש (honeycomb plate). היזהרו שלא לשפוך מהתרבית. עטרו את פיית המבחנה בלהבה והוציאו 5 µL מהתרבית, והעבירו אותה בעזרת פיפט לבאר הראשונה של פלטת הדבש.אל תשכחו לעקר בלהבה את פיית מבחנת הבחינה. לאחר הוצאת המדגם של 5 µL, חזרו על הליך ההזרקה עבור כל תרבית המזדקנת. ודאו שאתם רשומים את מיקום הבאר התואם לכל תרבית באופן זהה.יש להשתמש במיקומי בארות קבועים עבור כל נקודת גיל עוקבת לאורך כל הניסוי. החזירו את התרביות לאינקובטור בטמפרטורה של 30 °C. עם סיום ההזרקות, לאחר שהתרביות הוזרקו לתוך פלטת חלת הדבש, טענו את הפלטה למכשיר ה-bio screen CMBR.כדי לבצע זאת, חשפו את תא האינקובטור על ידי הרמת המכסה. לאחר מכן, הסירו את כיסוי מגש הדגימות. הכניסו את פלטת חלת הדבש שזריעה acabado-לאחרונה לתוך מגש הדגימות.השתמשו בחריץ השמאלי. אם אתם קוראים רק פלטה אחת, החזירו את המכסה למגש הדגימות והורידו את המכסה לתא האינקובטור. חשוב לוודא שנוזל העברת החום נמצא מעל רמת המילוי המינימלית.אם לא, הוסיפו נוזל העברה תרמית נוסף באמצעות פפית של 1000 µL. בתוכנת ה-bio screen, בחרו ב-Easy experiment. הגדירו את הפרמטרים הבאים כדי לקבל עקומות גדילה מתאימות עבור croce visi. עבור מספר הדגימות (number of samples), הזינו את מספר הבארים עם המצע או 200, והגדירו את המסנן בטווח של 420 עד 580 nm.הגדירו את הטמפרטורה ל-30 °C. משך הניסוי צריך להיות יום אחד, אפס שעות, אפס שניות. מרווח המדידה צריך להיות 30 דקות.ולבסוף, יש להגדיר את הנעורה לנעורה רציפה (continuous shaking), ללחוץ על high ואז על start כדי להתחיל את הקריאות. הפקו את קבצי הפלט ממכשיר ה-bio screen CMBR. תוכנת ה-easy experiment תפיק את נתוני ה-bio screen כקובץ המופרד בטאבים (tab delimited file), התואם ל-Microsoft Excel ולתוכנות אחרות.העמודה הראשונה, עמודה A, מציגה את הזמן שבו נמדדה ה-OD במהלך הניסוי. העמודות הבאות מייצגות כל באר בלוחות ה-bio screen מסוג honeycomb, שבהם הוחדרו תאים מתרביות ההזדקנות. מחקו את קריאת ה-OD הראשונה מכל עמודה, כיוון שקריאה זו מהווה רעש.נרמלו את הנתונים על ידי החסרת ערך הצפיפות האופטית של הבאר המכילה YEPD בלבד מערכי הצפיפות האופטית בכל עמודה. פעולה זו מסירה את בליעת הרקע של המצע. עקומות הצמיחה.העקומות יזוזו כפונקציה של הגיל; לדוגמה, בשרטוט עקומות הצמיחה (outgrowth curves) מטור 1, באר 1 של פלטת ה-honeycomb לאורך שש נקודות הזמן, נראית הסטה ברורה של העקומות ימינה עם הזמן. משך הזמן שחלף בין נקודת הזמן הראשונית, יום 2, לבין נקודת זמן עוקבת, קובע את החיוניות (viability) באותו גיל ספציפי. חשבו את זמן הכפלה עבור כל באר על בסיס קינטיקת הצמיחה של נקודת הגיל ביום 2.המשוואה המשמשת לחישוב זמן הכפלה נראית כך, כאשר OD one ו-OD two מייצגים מדידות רצופות של צפיפות אופטית, ו-T one ו-T two הם הזמנים בין המדידות. חשבו את זמני הכפלה רק בין ערכי OD של 0.2 ו-0.5. הממוצע של ערכים אלו הוא זמן הכפלה עבור הדגימה.ובכן, רוב זני השמרים מסוג הטיפוס הפראי צריכים להראות ערך זמן הכפלה של בין 85 ל-90 דקות עבור כל נקודת גיל. חשבו את הפרש הזמן delta T בעקומות הצמיחה ביחס לנקודת הגיל ההתחלתית, שהיא היום השני. דרך קלה לעשות זאת היא לקבוע את ההבדל במשך הזמן שנדרש לכל באר כדי להגיע ל-OD של 0.3 בין נקודת הגיל ההתחלתית לבין כל נקודת גיל עוקבת.ניתן לחשב את הזמן שבו באר מסוימת הגיעה ל-OD של 0.3 באמצעות משוואת הרגרסיה הליניארית המתאימה ללוגריתם הטבעי של הצפיפות האופטית. חשב את חלק השורדים בכל נקודת גיל כדי ליצור עקומת הישרדות, כאשר נקודת הגיל הראשונית ביום השני מייצגת 100% חיוניות עבור כל נקודת גיל עוקבת. חשב את אחוז ההישרדות באמצעות המשוואה הבאה.כאשר SN הוא אחוז ההישרדות. Delta TN הוא תזוזת הזמן, ו-Sigma N הוא זמן הכפלה. צרו עקומות הישרדות לפי הצורך עבור כל אחד מהם.בדרך כלל, על ידי שרטוט של חלק התאים החיוניים כפונקציה של הגיל, חשבו את אינטגרל ההישרדות עבור כל באר. SI מוגדר כשטח תחת עקומת ההישרדות וניתן להעריכו באמצעות נוסחה זו, כאשר age N הוא נקודת הגיל ו-SN הוא ערך ההישרדות שלהם באותה נקודת גיל. קבעו את הפרמטרים הסטטיסטיים של בארות שכפול מתוך נתוני ה-SI וההישרדות. פרמטרים סטטיסטיים נפוצים בעלי עניין כוללים ממוצע, חציון ושונות עבור כל סט של שכפולים ביולוגיים. ניתן להשתמש במבחן T או בניתוח דומה להשוואה זוגית של SI בין קבוצות ניסוי ובקרה שונות.ייתכן שיהיה רצוי להפיק עקומות הישרדות המבוססות על ממוצע של שחזורים ביולוגיים. עם סיום הניסוי, תשרטטו את עקומת ההישרדות ותבצעו ניתוח נתונים מספיק כדי לקבוע את פוטנציאל ההזדקנות הכרונולוגית עבור מספר זנים או תנאים שונים. אם הפעולה בוצעו כהלכה, עקומות הצמיחה שהתקבלו ממכשיר ה-bio screen CMBR אמורות להיראות בדומה לעקומה זו. באופן כללי, לתאי wild type שגודלו תחת התנאים המתוארים כאן יהיה אורך חיים כרונולוגי חציוני בסדר גודל של שבעה ימים.נצפית שונות משמעותית בהישרדות בין זנים שונים, ותחת תנאים מסוימים, כגון גידול במצע המכיל 0.05% Glucose, יכולה ההישרדות החציונית לעלות על 30 ימים. acab הרגע הצגנו בפניכם שיטה בעלת תפוקה גבוהה לקביעה כמותית של תוחלת החיים הכרונולוגית של השמר. Croce visier.חשוב לזכור שבעת ביצוע פרוצדורה זו, תחזוקה שוטפת של מכשיר ה-bio screen CMBR חיונית הן להשגת נתונים הניתנים לשחזור והן לדיוק. זהו כל הפרוטוקול. בהצלחה בניסויים שלכם.

quantifying-yeast-chronological-life-span-by-outgrowth-of-aged-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת חיים replicative טווח של תאים אמא שמרים.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

כאן אנו מתארים קבוצה של מוטציה מבחני DNA כי ניתן בשילוב עם המודל הכרונולוגי שמרים תוחלת החיים כדי לחקור את הגנים / מסלולים המווסתים או לתרום יציבות הדנ"א הגנומי במהלך ההזדקנות.

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

אנו מתארים כאן את הפעולה של מכשיר microfluidic המאפשר הדמיה מיקרוסקופית רציפה ורזולוציה גבוהה של תאי שמרי ניצנים בודדים במהלך replicative המלא ו / או תוחלת החיים כרונולוגית.

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

שיעורי מוטציה בתאי cerevisiae Saccharomyces הצעיר נמדדו באמצעות בדיקות תנודות משמשים כדי לחזות תדרי מוטציה בתאי אמא של גילאי replicative שונים. מיון וcytometry זרימה מגנטי משמש לאחר מכן למדידת תדרי מוטציה בפועל וגיל של תאי אם לזהות כל חריגה מתדרי מוטציה חזו.

שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב Saccharomyces cerevisiae

מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן לצפות ישירות לכמת.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את חילוף החומרים בדרכי הנשימה, fermentative על-ידי התאמת הגידול האקספוננציאלי של האפייה למשוואה צמיחה אקספוננציאלית. חישוב הפרמטרים קינטי מאפשר להקרנה של השפעות של חומרים/תרכובות תסיסה או מיטוכונדריאלי נשימה.

שמר האפייה קינטיקה גידול אקספוננציאלי בתרבות אצווה כדי לנתח את חילוף החומרים הנשימה ואת Fermentative

כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

הנה פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות גנטיות באמצעות מסך מדכא מספר עותק מוגבר ב Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות, לשבט ולבדוק מדכאי מוטנטים שמרים קצרי מועד. אנו בודקים את ההשפעה של הגדלת מספר עותק של SIR2 על תוחלת החיים במוטציה null autophagy.

מסך מדכא לאפיון קישורים גנטיים ויסות תוחלת חיים כרונולוגית ב Saccharomyces cerevisiae

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת אורך החיים של נמטודות שמרו על התקשורת עם מזון מוצק-UV הרג חיידקים.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

למד שיטה לכימות תוחלת החיים הכרונולוגית של שמרים באמצעות מדידת צפיפות אופטית בתדירות גבוהה. השיטה מאפשרת ניתוח כמותי של אבדן התפקוד התאי לאורך זמן בתרביות מזדקנות.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

גלה סרטונים נוספים