Name: העברת גרעין לתוך ביציות עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: למד את טכניקת העברת הגרעין לתוך ביציות עכבר לשם תכנות מחדש של גרעינים מובדלים למצב עוברוני. שיטה זו מסייעת לחוקרים בתחומי הביולוגיה התפתחותית ורפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DE רוצה להודות לד&quot;ר הסתר Akutsu לשיתוף NT הטריקים שלו, ד&quot;ר סטפן סאליבן גארט Birkhoff על קריאה ביקורתית של הפרוטוקול.

הכנות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> תיאור מפורט של superovulation ותרבות העובר microdrop ניתן למצוא במקום אחר 2. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת פטרי עם microdrops של המדיום תרבות העובר (למשל KSOM, Chemicon). מכסים עם שמן מינרלי (שמן מינרלי קבוצות יש לבדוק תאימות עם תרבות העובר). לאזן ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בתוספת 5% CO 2. (ב-Thermo Electron 3110 מים בחממה במעיל או שווה ערך) </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת עבור בידוד של ביציות: טיפות המקום hepes שנאגרו CZB &amp; hyaluronidase (0.1% w / v, Sigma) במחצית אחת צלחת ו HCZB במחצית השנייה. מכסים עם שמן מינרלי. שמור את המנה החמה על הבמה סוער של מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המיקרוסקופ: מקום פיפטה החזקת בקוטר חיצוני של כ 50 מ &#39;μ (מעט קטן יותר מאשר קוטר של הביצית) ולאחר הפתיחה של כ 20 מ&#39; μ בעריסה one פיפטה. Pipettes אחזקות קל לעשות עם הציוד הדרוש, מחט חולץ (סאטר מכשירים) ו microforge (Narishige), אך הם עשויים גם להיות שנרכשו Humagen. טען 3-5 l כספית μ לזנב של micropipette (קוטר פנימי 8 מ μ). הימנע נשפך כספית. להכין צלחת עם כמה טיפות קטנות של 11% כל אחד w / v PVP (polyvinylpyrrolidone) ב HCZB ו 5 μ g / ml cytochalasin ב &#39;HCZB. השתמש מכסה של צלחת פטרי ולא את המנה עצמה המכסה יש שפה קצר כי לא יתערב עם התנועה של החזקת ואת pipettes enucleation. יישר את פיפטה מחזיקה את פיפטה enucleation לירידה HCZB. לשאוב HZCB מעט לתוך קצה פיפטה מחזיקה. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת התאים התורם תלוי בעיקר בסוג התא הניסוי החוקר מתכוון לבצע. באופן כללי, התאים התורם צריך להיות מטופלים עם אנזים פרוטאוליטי כגון טריפסין ושמר על קרח כדי להפחית את הדביקות עד ההעברה. </li><li class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> הומני להרדים עכברים 14-15 שעות לאחר מתן של hCG. קציר oviducts ולנתח אותם ב-HCZB hyaluronidase טיפות חמות. לאחר כ. 5 דקות, ביציות יהיו חופשיים בעיקר מתאי קומולוס. הם צריכים ואז לשטוף מספר פעמים HCZB, שטף אז נוספת מראש equilibrated טיפות KSOM, והמשיך בחממה עד enucleation. </li></ol> Enucleation מניפולציות נעשות עם micromanipulators הידראולי, (Narishige) על מיקרוסקופ הפוכה, כגון ניקון TE200. Micromanipulator piezo (Primetech) משמש לקידוח pellucida zona. שקצהו שטוח enucleation ו pipettes העברת ניתן לרכוש Humagen. נקו לשמן את פיפטה enucleation את טיפות PVP ידי גירוש טיפות כספית מיקרוסקופיים ידי aspirating וגירוש PVP. כדי למנוע את הדביקות של המחט, ההליך אותו יש לעשות בין כל קבוצה של ביציות, כי הם enucleated או הועברו. מקום קבוצה קטנה של ביציות לתוך הירידה ב-HCZB cytochalasin. גודל הקבוצה צריך להיות מותאם לרמת הניסיון של החוקר. ביציות לא צריך להיות כל הזמן על הבמה יותר מ 20-30 דקות. הזזת מכשירים HCZB-B cytochalasin טיפות. פיפטה מחזיקה את פיפטה enucleation צריך להביא לכדי היערכות עם קו המשווה של הביצית. זה יהיה אפשרי אם פיפטה מחזיק בעל קוטר חיצוני כי הוא מעט קטן יותר הביצית עצמה. סיבוב הביצית עד ציר metaphase השבירה אחרת ניתן לראות. אם מתחיל לא יכול לראות את ציר, הצלחת metaphase ניתן לזהות באמצעות לצבוע DNA Hoechst תאורה UV, עם זאת, כי אינה תואמת ההתפתחות העוברית יעיל. מקם את ציר metaphase ב 03:00 והחזק אותו היטב עם פיפטה מחזיקה. החל פולסים piezo לחדור pellucida zona. גע צלחת metaphase עם פיפטה enucleation. לאחר התנגדות של ציר metaphase יכול להיות &quot;הרגיש&quot;, לשאוב ציר ולמשוך את המחט. הציטופלסמה היא נוזל הביצית, ציר metaphase אולם מהלכים כמו גוש כאשר נגע עם פיפטה. נסו להפחית את כמות הציטופלסמה כי יוסר עם ציר. אחרי קבוצה של ביציות כבר enucleated, לשטוף אותם באמצעות מדיום תרבות העובר ולהכניס אותם לתוך החממה עד ההעברה. כמה ביציות enucleated לא צריך להיות מועבר אך צריך להיות מופעל לשמש מלאה עבור enucleation. ביציות אלו שבר בתוך כמה שעות, המציין enucleation מוצלח. העברת גרעיני המקום התאים לתוך פתרון PVP (11% ב PVP HCZB). אם לעצור שיבוטים רבים בשלב 1-התא, ריכוז PVP צריך להיות הוריד ל 5% או פחות. מערבבים היטב תאים שנינותשעות PVP. איסוף תאים עם טפטפת בקוטר פנימי מעט קטן יותר מאשר קוטר של התא. הממברנה של התא צריך לשבור על השאיפה. במקרים מסוימים, גירוש חוזרות השאיפה כמו גם את היישום של פולסים עדין piezo ניתן להשתמש כדי לשבור את התא התורם. ירידה חדשה של תאים התורם צריך להיעשות עם כל קבוצה של ביציות המועברים, כמו תאים התורם להיות דביק לאחר זמן מה. להזריק את התא התורם שבור זמן קצר לאחר שבירת הממברנה. עבור ההעברה, להתמקד קו המשווה של הביצית עצמה ולא את המטוס המשווני של pellucida zona, ולמקם את ההעברה פיפטה מחזיקה באותו המטוס. החזק את הביצית כולל חלק בציטופלסמה שלה בנחישות. לחדור pellucida zona באמצעות פולסים piezo. תביאו את גרעין התורם אל קצה פיפטה, ואז לדחוף את קצה פיפטה כמעט בצד השני של הביצית enucleated, קרוב פיפטה מחזיקה, מה שהופך תלם עמוק בתוך הביצית. לשאוב כמות קטנה מאוד של הציטופלסמה לתוך הביצית פיפטה, להחיל הדופק יחיד חלש piezo לשבור את קרום הביצית, להוציא את הגרעין התורם, לשלוף את המחט במהירות תוך aspirating על הממברנה cytoplasmic בקצה הימני של התלם. בו זמנית על ידי משיכת המחט aspirating, זה צריך להיות אפשרי כדי לסגור את החור שהותירו NT. זה &quot;הסרת טכניקה חור תפחית את מספר ביציות כי lyse במהלך NT. שטפו את ביציות לשחזר KSOM ולהחזיר אותם בחממה במשך שעות 1-3. הביצית הפעלה הכן חצי צלחת עם טיפות MCZB סידן חופשי את החצי השני עם טיפות של סידן MCZB חינם פלוס 10mm Sr 2 + ו - 5 μ g / ml cytochalasin B לעכב שחול הגוף הקוטב. לאזן למשך 30 דקות. לפי 5% CO 2 באוויר. לשטוף היטב עוברים NT-MCZB סידן חינם ולאחר מכן למקם אותם בקבוצות קטנות בטיפות שונות של MCZB-סידן חופשי. מחזירים את המנה אל האינקובטור והתרבות של 5-6 שעות. כדי לשלוט על פרוטוקול ההפעלה מלאכותיים התנאים תרבות העובר, ללא enucleated ביציות יש להשתמש. הם יפתחו כמו עוברי parthenogenetic. לאחר ההפעלה, לשטוף את עוברי דרך עוברי KSOM מקום בחממה לתרבות לטווח ארוך. Pronuclei צריך להיות גלוי בנקודה זו בזמן, המעיד על העברת מוצלח. תרבות העובר מדיה Cookbook מאסטר מלחים התחילו עם 980 מ&quot;ל ultrapure H 2 O בבקבוק 1 ליטר סטרילית הוספת מרכיבים יבשים: NaCl 4760 מ&quot;ג (81 מ&quot;מ) סיגמא S-5886 KCl 360 מ&quot;ג (5mm) סיגמא P-5405 MgSO 4 • 7H 2 O 290 מ&quot;ג (1.18mM) סיגמא M-2773 KH 2 PO 4 160 מ&quot;ג (1.17mM) סיגמא P-5655 EDTA 2NA 40 מ&quot;ג (0.1mm) סיגמא E-6635 (ד) 1000 מ&quot;ג גלוקוז (5.5mm) סיגמא G-6152 הוספת רכיבי נוזלי Na-חומצת חלב (חומצה לקטית) 5.3 מ&quot;ל &amp; nbsp; Sigma 44263 Pen&#39;Strep 10 מ&quot;ל Gibco 15140-122 עבור מלחים MCZB במלאי: סנן לעקר 500 מ&quot;ל מלחי מאסטר (טוב 3-4 חודשים; חנות ב 4 ° C) עבור מלחים HCZB במלאי: התחל עם 500 מ&quot;ל מלחי מאסטר הוסף 50 מ&quot;ג PVA (קר מסיסים; Sigma P-8136) מערבבים במשך 30-60 דקות ועקר המסנן (טוב במשך 3 חודשים; חנות ב 4 ° C) Ca + + חינם MCZB (להפעלת ביציות של 5% CO 2) התחל עם 99 מ&quot;ל מלחי MCZB מניות הוספת מרכיבים יבשים: NaHCO 3 211 מ&quot;ג Sigma S-5761 Na-pyruvate (חומצה pyruvic) 3 מ&quot;ג Sigma P-4562 L-גלוטמין 15mg Sigma-G-8540 שור בסרום אלבומין (BSA) 500 מ&quot;ג Sigma A-3311 מערבולת עד כל הרכיבים מומס, מסנן סטרילי. HCZB (עבור המיקרומניפולציה באווירה הסביבה) התחל עם 99 מ&quot;ל מלחי HCZB מניות הוספת מרכיבים יבשים: Hepes Na-520 מ&quot;ג Sigma H-3784 NaHCO 3 42 מ&quot;ג Sigma S-5761 הוספת רכיבים נוזליים: 128 mM CaCl 2 (18.8g / l) 1 מ&quot;ל Sigma C-7902 התאם ל-pH 7.5 עם 1 N HCl מערבולת עד מומס, מסנן סטרילי.

<ol><li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Mammalian+and+Avian+Transgenesis-+New+Approaches%22">Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches</a>. Pease, S., Lois, C. , Springer. (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%22">Manipulating the mouse embryo</a>. Press, C. S. H. L. , (2003).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394, 369-374 (1998).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

מזל טוב!

אנא בדוק קומפוזיציות מאגרים נוספים בחלק פרוטוקול.

העברת גרעין לתוך ביציות עכבר

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

העברת הגרעין אל תוך הביצית מופרית ניתן לשחזר את הפוטנציאל ההתפתחותי לתא מובחן. זה מוכיח כי התהליכים הבסיסיים, פיתוח הבחנה והזדקנות הם epigenetic ולא תהליכים גנטיים. הפיכות של תהליכים אלה פותחת אופקים מרגש במחקר בסיסי, ובעתיד הרחוק יותר, ברפואה רגנרטיבית. בשנת העכבר, בתאי גזע עובריים ניתן לגזור מעוברים משובטים preimplantation הבמה. אלה בתאי גזע עובריים יש את היכולת להצמיח את כל סוגי התאים של האורגניזם הבוגר. חשוב לציין, התאים האלה זהים מבחינה גנטית לתורם. אם החלים על האדם, זו תאפשר גזירת בתאי גזע מחולה. תאים אלה ניתן יהיה סוג מובחן לתוך התא הפגוע של החולה ולמד במבחנה, או להשתמש בו כדי להחליף תאים פגומים או חסרים. המחקר של העברת גרעיני העכבר נשאר חשוב כפי שהוא יכול להודיע ​​לנו על עקרונות תכנות מחדש של גרעיני. זה סרט המלווה את הפרוטוקול נועדו לסייע למידה העברת גרעיני העכבר, שיטה שפותחה לראשונה בקבוצה של פרופ &#39;Yanagimachi (וואקאיאמה et al. 1998).

הסרט הזה ואת פרוטוקול נועדו לסייע למידה העברת גרעיני.

העברה גרעינית לתוך ביצית לא הופרית יכולה להשיב את הפוטנציאל ההתפתחותי לתא מובחן. דבר זה מדגים כי התהליכים העומדים בבסיס...

אנו מבצעים העברה גרעינית (NU Nuclear transfer) מכיוון שהקבוצה שלנו מתעניינת בתכנות מחדש. זהו תהליך מרתק שבו גרעין מובחן יכול לעבור תכנות מחדש למצב עוברי. אלו הם הריאגנטים case SUM ו-HCCV, וזהו hyaluronidase.ראשית, אני מכין צלחת שתועבר לאינקובטורים כדי להשוות את רמת ה-CO2. אלו הן טיפות, מספר טיפות עבור Turing המכוסות בשמן מינרלי. כך הם מכיילים את אטמוספירת ה-CO2.כעת הכינו טיפה של HCZB. טיפה זו תשמש לשטיפה. היא מונחת על ה-days ומכוסה שוב בשמן מינרלי זה.הגובה הזה יורד עם היאלורונידאז. החלק הזה כאן הוא פשוט טיפות HCCP. אלו משמשות לשטיפה.זהו שלב להסרת תאי ulu מצד ה-O. שלב זה מחומם כך שהוא יתחמם עד שאחזור ואקח את דגימות השמן מהעכברים ואכסה הכל בשמן מינרליים. אלו הן טיפות PVP לניקוי המחט ולביצוע העברה של התאים לתוכה, וזהו HCCB בתוספת Cyla B. וכאן אבצע את המניפולציות.בסדר, זהו צבע המחט. מה שאני עושה כעת הוא שולף מחט. מצוין, כעת יש לי מחט טובה מאוד, דקה מאוד.וכעת זהו מיקרו-forge. עליי לחתוך את המחט במיקום מסוים כדי לקבל פיפטת החזקה בגודל הנכון. אני מחמם את כדור הזכוכית, יורד עם המחט עד שהיא נמסת לתוכו, וכעת היא נשברת.אני דוחף את זה הצידה. אתם רואים שהמחט השבורה היא מושלמת. כעת אני יורד לכאן ומעלה את החום.כעת כדור הזכוכית יהפוך לאדום והוא יימס; דחפו את כדור הזכוכית וזה ייצור קימור. זה מספיק.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים כאן reprogramming epigenetic באמצעות העברה תא סומטי גרעיני (SCNT) יכול לשמש ככלי לייצור מודלים העכבר עם קולטן T מוגדרים מראש תא (TCR) ספציפיות. עכברים אלה transnuclear לבטא את TCR המתאימה מוקד אנדוגניים שלהם תחת שליטה של ​​האמרגן אנדוגני.

עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע&quot;י SCNT

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

סרטון זה מתאר הזרקה פרו-גרעינית של וקטורים לנטי-ויראליים לתוך החלל הפריביטלי של עובר עכבר מופרה. וירוס הלנטיוירוס מכיל את הטרנסגן, אשר משולב בגנום של העובר המופרי, ובסופו של דבר מוליד עכברים טרנסגניים.

הזרקת פריביטלין מבוססת וקטור לנטיויראלי: שיטה להמרת הגן המעניין לביציות עכבר חד-תאיות מופרות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון של ביציות Antral עכבר מבוססות על ארגון nucleolar.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

אנו מתארים שיטה משופרת באופן משמעותי עבור העכבר שכפול באמצעות trichostatin A, ויטמין C, ואלבומין שור יונים. אנו מראים פרוטוקול מפושטת, לשחזור התומך פיתוח יעיל של העוברים משובטים. לכן, בשיטה זו יכול להיות הליך מתוקננת של העכבר שיבוט.

טיפול קומבינטוריים Trichostatin A וויטמין C משפר את היעילות של שיבוט עכברים באמצעות העברה גרעיני תאים סומטיים

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום.

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

פרוטוקול זה ממחיש את הטכניקה עבור ביציות לחילוץ או בשלב מוקדם, עוברים מן oviduct מופרית של עכברים. היכולת לזהות את infindibulum והכנס מחט סוף בוטה לתוך זה הכרחי נכון לבצע את ההליך.

איחזור של ביציות עכבר

למד את טכניקת העברת הגרעין לתוך ביציות עכבר לשם תכנות מחדש של גרעינים מובדלים למצב עוברוני. שיטה זו מסייעת לחוקרים בתחומי הביולוגיה התפתחותית ורפואה רגנרטיבית.

העברת גרעין לתוך ביציות עכבר

גלה סרטונים נוספים