Name: עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: למדו פרוטוקול לניתוח תכולה גבוהה של נוירוטוקסיות בשותפות תרבית נוירון-אסטרוציט. שיטה זו מאפשרת הערכה רגישה של השפעות רעילות על מערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות בני הזוג. ריק ריאן, ואומש פאטל, ג&#39;ף עד, מתיו הסו, ג&#39;האנגיר מיסטרי ומישל Hatler על התמיכה במהלך הפיתוח של הפרויקטים הללו ופרוטוקולים.

תא הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני זריעת התא, assay תרבות נוירונים / האסטרוציטים בתקשורת צמיחה עד ~ ומחוברות 70-80% (אלא אם כן תא זריעת ישירות ההפשרה או בידוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים צלוחיות תרבות / צלחות דרך בשיטה המתאימה לסוג התא של עניין. אם יש צורך, assay מעיל בארות צלחת עם חלבון פולי-D-ליזין או תאיים מטריקס לשפר את הידבקות התא. Co-התרבויות של האסטרוציטים ונוירונים ניתן seeded בו זמנית או ברצף. עבור seedings רציפים, ציפוי של האסטרוציטים הראשונה שכבה &quot;הבסיס&quot; מומלץ, ואחריו ציפוי בידול העצבית, ובמידת הצורך. התאם את צפיפות התאים בהתאם לסוג התא, תרבות זמן לאחר מכן, פרמטרים של עניין, וכו &#39;בהתאם לגיל, תרבות, מקור התא צפיפות זריעה, תרבויות העיקרי עשויים להשתנות במידה ניכרת בשיעור של שגשוג, הביטוי GFAP או תולדה neurite - חשוב לאפיין לייעל את המערכת הסלולרי שלך כדי לספק את הרלוונטיות ביותר עבור מודל הביולוגי הניסיוני שלך, כמו גם לספק הדמיה פילוח יעיל, ניתוח באמצעות HCS (ראה איור 1). לאחר הוספת תאים לצלחת (תאים עשויים להיות seeded ב 90 μL התקשורת, כדי להקל על הטיפול רעלן כמתואר שלב 3 להלן), מאפשרים צלחת לשבת על משטח ישר בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות, מה שמאפשר הפצה תא אפילו. לאחר תקופה זו, תאים דגירה בתקשורת צמיחה (37 ° C / 5% CO 2) לפחות 24 שעות, ולאחר מכן לעבור בתנאים תרבות בידול (לדוגמה, בסרום נמוך / NGF עבור PC12 תאים), בהתאם. המשך התרבות תאים להגיע עד הרמה הרצויה של מפגש או בידול, שינוי התקשורת במרווחים המתאימה לסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים נייד (תרכובות שליטה, תרכובות מבחן, וכו &#39;) יכול להיות מוצג בכל נקודה במהלך תקופה זו תרבות, בהתאם כמובן בזמן הטיפול של עניין. Acrylamide, מי חמצן ו - K-252a מסופקים תרכובות לשלוט neurotoxic. ריאגנטים מספיק ניתנים לשכפל 12 נקודות בתגובה עקומות מנה (כולל DH 2 O או DMSO שליטה מוגדר בתוך בתגובה את המינון) עבור כל חמש צלחות 96-היטב. תרכובות ניתנים בריכוז 250X (עבור K-252a, בהנחה טיפול מרבי של 1 מיקרומטר) או 10X (עבור acrylamide ואת מי חמצן, בהנחה טיפולים המרבי של 100 mM ו - 10 מ&quot;מ, בהתאמה). הכנה הטיפול המומלץ כולל חצי log (1: √ 10) דילול סדרתי של המתחם 250X ב DMSO, ואחריה דילול של הצפת דילול מתחם ל 10X (תרכובות לשלוט 10X שמקורם DH 2 O יכול להיות מדולל סדרתי ישירות סטרילי DH 2 O או דילול מאגר מתחם). 10 μL של כל טיפול עשוי מכן יתווספו 90 μL של התקשורת בתרבות הנוכחית כבר כל טוב, כי ריכוז 1X האחרון (0.4% או 10% DMSO DH 2 O). נתונים לדוגמה מסופק 24 או 96 שעות של טיפול במתחם ב 37 ° C לפני קיבעון. </li></ol> קיבוע נייד ו מכתים Immunofluorescent: הערה: הזמן הוא מכתים ~ 2.5 שעות שלאחר קיבעון. אל תאפשר בארות להתייבש בין הצעדים מכתים. שאיפה של חומרים כימיים ואת היתר צריכה להתנהל ברמות ספיקה נמוכה כדי לצמצם אובדן התא עקב גזירה נוזל. כל המומלצים &quot;לכל טוב&quot; כרכים מתייחסים אחד טוב של microplate 96-היטב. כל המומלצים &quot;לכל 96-היטב צלחת &#39;כרכים כוללים עודף של 25% על אובדן טיפול הנוזל נפח. כל הצעדים מכתים מבוצעות בטמפרטורת החדר (RT). כל מאגרי פתרונות נוגדנים הם יציבים במשך לפחות 24 שעות RT. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף תקופת תרבות, טרום חם פתרון HCS קיבוע (2X) לטמפרטורת החדר (RT) או 37 מעלות צלזיוס אם רוצים (12 צלחת mL/96-well). במנדף כימי קטר, להוסיף 100 μL / גם ישירות למדיה תרבות ולאפשר לתקן למשך 30 דקות ב RT. הסר מקבע / רעלן המכיל מדיה להיפטר בקנה אחד עם תקנות פסולת מסוכנת (ראה MSDS). אם הליך מיד מכתים, לשטוף היטב פעמיים עם כל μL 200 של הצפת immunofluorescence HCS. לחילופין, אם יש צלחות מוכתמות במועד מאוחר יותר, לשטוף פעמיים עם μL 200 של הצפת לשטוף, אז לעזוב הכרך השני לשטוף בבארות וצלחות החנות סגורה היטב ב-C º 4 עד מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות קבוע אוחסנו ב-C º 4 לפני מכתים, לשטוף פעמיים עם הצפת 200 HCS μL immunofluorescence לפני שתמשיך פרוטוקול מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עובד הפתרון של הארנב נגד βIII טובולין / עכבר נגד GFAP נוגדנים HCS ראשיים (6 צלחת mL/96-well) כדלקמן: הוסף 60 μL של כל נוגדן ראשוני מופשר ל 5.88 מ&quot;ל של הצפת immunofluorescence HCS. מערבבים היטב. הסר חוצץ immunofluorescence הקודם לשטוף. הוסף 50 μL של פתרון נוגדן ראשוני זה היטב דגירה במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדן ראשוניהפתרון. לשטוף שלוש פעמים עם 200 הצפת μL immunofluorescence HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה של נוגדן HCS משני / Hoechst HCS גרעיני כתמים (6 צלחת mL/96-well) כדלקמן: הוסף 30 μL של נוגדן זה משני מופשר 30 μL של מופשר Hoechst HCS גרעיני כתמים על 5.91 מ&quot;ל של הצפת immunofluorescence HCS. מערבבים היטב, פתרון הגנה מן האור. הסר חוצץ הקודם HCS immunofluorescence לשטוף. הוסף 50 μL של נוגדן HCS משני / Hoechst פתרון HCS כתמים גרעיני דגירה במשך שעה 1 ב RT, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר HCS פתרון יסודי נוגדן / Hoechst HCS כתמים גרעיני. שטפו פעמיים עם 200 הצפת μL immunofluorescence HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ הקודם HCS immunofluorescence לשטוף. שטפו פעמיים עם μL 200 של הצפת לשטוף HCS, עוזב הכרך השני לשטוף בבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת חותם התמונה מיד, או לאחסן צלחת ב-C º 4 מוגנת מפני אור עד מוכן הדמיה. </li></ol> תמונה רכישה ניתוח: <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה וניתוח של צלחות מוכתמות ניתן לבצע על מגוון רחב של פלטפורמות HCS זמין, כולל IN Analyzer Cell (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher מדעי) או אופרה (פרקין אלמר). הנחיות מסוימות הדמיה וניתוח ניתנים טבלה 1: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 רכישת תמונה הנחיות </td></tr><tr><td> איתור מגיב </td><td> המטרה עדשה </td><td> טווח עירור סנן [שיא / רוחב פס (ננומטר)] </td><td> טווח פליטה סנן [שיא / רוחב פס (ננומטר)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS גרעיני כתמים </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (535/50 או אם יש צורך) </td></tr><tr><td> HCS נוגדן משניים, FITC-חמור נגד ארנב IgG </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS נוגדן משניים, Cy3-Donkey אנטי עכבר IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 ניתוח תמונה הנחיות </td></tr><tr><td> תא פרמטר </td><td> איתור </td><td> פילוח / מדידה </td><td> רציונל </td></tr><tr><td> מספר סלולרי, מאפייני גרעיני </td><td> Hoechst HCS גרעיני כתמים </td><td> האזור גרעיני (460 פליטה ערוץ ננומטר). ספירת מספר גרעינים. תוכן ה-DNA (בעוצמה גרעינית) או ניתוחים באזור גרעיני גם אפשרי. </td><td> שימוש במספר התא, המאפיינים גרעיני כדי לקבוע הפסד התא, פנוטיפים רעילות וכו &#39;ניתן &quot;לסנן&quot; גרעינים אלו הקשורים טובולין-βIII או ביטוי GFAP להשיג נפרד ספירת תא עצב astrocytic / אפיונים (מומלץ בחום). </td></tr><tr><td> βIII-טובולין, הביטוי Neurite תולדה </td><td> HCS נוגדן משניים, FITC-מצומדות </td><td> אזור cytoplasmic (535 ננומטר פליטת ערוץ). אות FITC ניתן להשתמש כדי להבחין גופי התא של הנוירונים neurites (למשל, באמצעות מינימום / ממוצע הגוף באזורים התא, אורך neurite מינימום / מקסימום רוחב). קביעת פרמטרים כגון אורך neurite מוחלט, שקובע neurite / סלולריים, ועוד </td><td> מדידות Neurite תוצאה עשויה להיות מווסתת במהלך התמיינות נוירונים או כתוצאה מפגיעה כימית, מדינות מחלה וכו &#39;יכול &quot;לסנן&quot; גופי התא של אלה הקשורים ביטוי βIII-טובולין לקבל אפיון עצביים שונים (מומלץ מאוד). </td></tr><tr><td> הביטוי GFAP, שטח Astrocyte </td><td> HCS נוגדן משניים, Cy3-מצומדות </td><td> אזור cytoplasmic (600 פליטה ערוץ ננומטר). אות Cy3 ניתן להשתמש כדי להגדיר פילוח cytoplasmic astrocytic. קביעת פרמטרים כגון עוצמת האות הממוצע cytoplasmic, אזור תא, וכו &#39; </td><td> הביטוי GFAP באזור תא astrocyte יכול להיות מאופנן במהלך הפיתוח astrocyte או כתוצאה מפגיעה כימית, מדינות מחלה וכו &#39;יכול &quot;לסנן&quot; גופי התא של אלה הקשורים ביטוי GFAP לקבל אפיון astrocytic ברורים (מומלץ בחום). </td></tr></tbody></table> . טבלה 1 תמונה רכישה ניתוח הנחיות - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-תרבות) Assay נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="איור 3" /> באיור 1. βIII-טובולין ו GFAP immunofluorescence מעורבת של תרבויות עכברוש עצביים התא. Co-התרבויות של האסטרוציטים עכברוש העיקרי בהיפוקמפוס עם או נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש העיקרי או PC12 תאים עכברוש נוצרו על ידי ציפוי מראש האסטרוציטים במשך כמה ימים בתרבות, ואחריו זריעת עצביים. נוירונים בתרבית ראשונית היו עבור 11 ימים נוספים, תוך PC12s היו בתרבית עבור 2 ימים נוספים בתנאי בידול (בסרום נמוך / NGF). טיפול Cell, קיבעון ו immunostaining בוצעו על פי פרוטוקולים HCS222 assay. תאים הם צילמו על GE בתא Analyzer 1000 (3.3) בשעה 20X (נוירונים העיקרי) או הגדלה 10X (PC12) המטרה ונותחו באמצעות GE תחנת עבודה נייד 1000 Analyzer (3.4) תוצאה Neurite ו Multi ניתוח אלגוריתמים יעד הפאנל למעלה.: תמונות התמזגו של הקרינה Hoechst HCS (אדום) גרעיני כתמים (כחול), βIII-טובולין (ירוק) ו GFAP. ניתוח נפרד של ערוץ βIII-טובולין את הקרינה מאפשר פילוח תולדה neurite (באמצע הפאנל: גופי התא המתוארים (נוירונים כחול העיקרי) או צהוב (PC12), neurites בירוק (נוירונים ראשונית) או תכלת (PC12)). ניתוח של ערוץ GFAP מאפשר פילוח astrocyte (פאנל התחתונה: גרעינים המתוארים כחול, הציטופלסמה בירוק). פילוח GFAP של עכברוש הראשוני בהיפוקמפוס תרבות שיתוף נוירון / astrocyte מדגים את היכולת להבחין בין גרעינים / תא הגופים כי הם GFAP (+) (ירוק מתאר) לבין אלה GFAP (-) (אדום), המאפשר ספירת תאים נפרדים נוירונים האסטרוציטים בסביבה תרבות מעורבת. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="איור 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="figure4 part2" /> איור 2. תגובות מנה של עכברוש הראשוני בהיפוקמפוס נוירון / astrocyte שיתוף תרבויות מדגיש רעילים. האסטרוציטים עכברוש ראשי בהיפוקמפוס (P6) היו מצופה על 96-היטב צלחות בתקשורת צמיחה בתרבית למשך 6 ימים. נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש ראשיים (ישיר להפשיר) היו זורעים אז על גבי טרום מצופה האסטרוציטים ותרבותיים בתקשורת צמיחה במשך 11 ימים. תאים שטופלו דילולים הסידורי של חמצן acrylamide או מימן (ריכוז מרבי = 100mm ו - 10mm, בהתאמה) במשך 24 השעות האחרונות של התרבות. טיפול Cell, קיבעון ו immunostaining בוצעו על פי פרוטוקולים HCS222 assay. תאים הם צילמו על GE בתא Analyzer 1000 (3.3) בשעה 20X (10 שדות / טוב) ונותחו (גרעיני / cytoplasmic / neurite פילוח) באמצעות GE תחנת עבודה נייד 1000 Analyzer (3.4) תוצאה Neurite ו Multi ניתוח אלגוריתמים יעד. הנתונים המוצגים הינם ממוצע ± SEM, n = 3. פרמטרים מרובים (תוצאה neurite, עוצמת GFAP, אזור astrocyte וספירת תאים עצביים או astrocytic) נחקרו על המינון תלוי במגמות.

<ol><li>Radio, N. M., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neurotoxicity+testing+in+vitro%3A+models+for+assessing+chemical+effects+on+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth.</a> Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).</li>
<li>Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphology-+and+kinetics-based+cascade+for+human+neural+cell+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).</li>
<li>Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta%281-42%29+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons%3A+A+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li>
<li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+screening+assay+for+chemical+effects+on+proliferation+and+viability+of+immortalized+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells.</a> Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).</li>
<li>Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chemical+effects+on+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+using+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening.</a> Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).</li>
<li>Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+neurotoxic+potential+by+use+of+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).</li>
<li>Prockop, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allegory+of+a+mountain%3A+an+environmental+introduction+to+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology.</a> J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).</li>
<li>Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+neurotoxicity+test-system%2C+using+human+post-mitotic%2C+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li>
<li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol%2C+trimethyltin+chloride+and+acrylamide%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li>
<li>Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li>
<li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein%3A+GFAP-thirty-one+years+%281969-2000%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000).</a> Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).</li>
<li>Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+regulates+astrocyte+proliferation+and+reactive+gliosis+via+a+JNK%2Fc-Jun+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway.</a> J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).</li>
<li>O'Callaghan, J. P., Sriram, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein+and+related+glial+proteins+as+biomarkers+of+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Saf%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity.</a> Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).</li>
<li>Mead, C., Pentreath, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+toxicity+indicators+in+rat+primary+astrocytes%2C+C6+glioma+and+human+1321N1+astrocytoma+cells%3A+can+gliotoxicity+be+distinguished+from+cytotoxicity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?</a> Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).</li>
<li>Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBalls%2C+M+%22Neurotoxicology+In+Vitro%22">Neurotoxicology In Vitro</a>. , Taylor and Francis. London. 269-283 (1999).</li>
<li>Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+environmental+estrogenic+chemicals+exert+developmental+effects+on+rat+hypothalamic+neurons+and+glias%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias.</a> Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).</li>
<li>Weible, M. W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord%3A+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li>
<li>Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+released+by+rat+type+1+astrocytes+exert+different+effects+on+the+proliferation+of+human+neuroblastoma+cells+%28SH-SY5Y%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Relat+Cancer%22%5BJournal%5D)">Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro.</a> Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).</li>
<li>Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+metabolism+in+brain+metabolic+interaction+between+astrocytes+and+neurons+in+the+defense+against+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species.</a> Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).</li>
<li>Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+effects+of+trimethyltin+and+triethyltin+on+human+fetal+neuron+and+astrocyte+cultures%3A+a+comparative+study+with+rat+neuronal+cultures+and+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines.</a> Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).</li>
</ol>

המחברים הם כל העובדים של Millipore Corporation.

עד כה, בניסויים במבחנה נועד המחקר הסיכון neurotoxicity הערכה באמצעות תרביות מעורבות של נוירונים האסטרוציטים היה מוגבל. זה היטב מקובל כי תאי גלייה הם חלק בלתי נפרד במתן תמיכה מרחבית מטבולית לנוירונים, לשחק תפקיד קריטי ויסות עצבי פונקציות שונות, כולל הגירה בידול עצבית, פעילות סינפטית. האסטרוציטים גליה גם לשחרר ציטוקינים וגורמים מסיסים אחרים המסוגלים סובלנות הן עצבי וגורם לתגובות שליליות לרקמות העצבית, כמו גם קידום של רעלים רבים. הדגמת העומק של נוירונים, גליה אינטראקציות, ב שיתוף תרבות מחקרים, האסטרוציטים הוכחו כדי להגן על הנוירונים מפני רעילות של סטרס חמצוני, ואילו ליקוי astrocytic של פונקציות, כגון החזקת ההגנה נוגדת החמצון ורמות האנרגיה התאית, הוכח השפעה קריטית להישרדות עצביים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השימוש האסטרוציטים ב במערכת בדיקה חוץ גופית neurotoxicity עשוי להוכיח רלוונטיות יותר במבנה מערכת העצבים המרכזית האדם ותפקודו מאשר תאים עצביים לבד. למרות המודעות ההולכת וגדלה של המשמעות הפיזיולוגית של הנוירונים-astrocytic אינטראקציות, זה כבר קודם לכן קשה לבצע ניתוחים כמותיים של אינטראקציות אלה בתאים שלמים. הופעתו של הקרנת תכנים גבוהה מאפשרת את הפיתוח של מבחני חדש רב עוצמה לכתובת זו. במחקר זה, אנו הראו כי ניתוחים כמותיים של פנוטיפים עצב astrocytic מרובים בתוך assay יחיד מתאפשרים הודות HCA. בנוירונים העיקרי לנו לבצע מדידות כמותיות של סמנים neurotoxicity כגון מספר העצבית, לספור neurite ואורך neurite. ב האסטרוציטים, דבקת תגובתי היא סמן ביולוגי ידוע neurotoxicity, מאופיין על ידי שינויים בביטוי GFAP, מספר astrocyte ומורפולוגיה astrocyte. אנחנו הוכיחו כי כל נקודות הקצה אלה עשויים בקלות להעריך באמצעות HCA. מחקרים אלה תומכים מושג HCA של עצבי ספציפי סמנים ביולוגיים יכול לשמש כחלק סוללה של בדיקות in vitro במהירות המסך מספר רב של כימיקלים עבור נקודות קצה neurotoxic. HCS222 ניתוח גבוהה של Millipore תוכן הערכה לתרבות משותפת של נוירונים האסטרוציטים מורכבת באיכות גבוהה ריאגנטים איתור פרוטוקולים בו זמנית פרופיל βIII-טובולין ו - גליה חלבון fibrillary חומצי (GFAP) במגוון רחב של דגמים סלולריים של neurotoxicity. הפערים תוקף ריאגנטים מסופק עם ערכה זו מאפשרת למשתמש לבצע סטנדרטיזציה של מבחני, למזער assay-to-assay השתנות, וכן reproducibly להפיק תמונות עם יחס אות רקע גבוה.

<table><tbody><tr><td>נוגדן ראשוני HCS ארנב נגד-&amp;#946;III-Tubulin, 100X</td><td></td><td>מק"ט CS201672</td><td>מבחנה אחת המכילה 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>נוגדן משני HCS (דונקי נגד ארנב IgG, צמוד FITC), 200X</td><td></td><td>מק"ט CS201649</td><td>מבחנה אחת המכילה 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני HCS עכבר נגד-GFAP, 100X</td><td></td><td>מק"ט CS201671</td><td>מבחנה אחת המכילה 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>נוגדן משני HCS (דונקי נגד עכבר IgG, צמוד Cy3), 200X</td><td></td><td>מק"ט CS200437</td><td>מבחנה אחת המכילה 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>צבע גרעין HCS H&amp;#8211;chst, 200X</td><td></td><td>מק"ט CS200438</td><td>מבחנה אחת המכילה 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>תמיסת קיבוע HCS עם פנול אדום, 2X</td><td></td><td>מק"ט CS200434</td><td>בקבוק אחד המכיל 100 mL&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>בופר אימונופלואורסצנציה HCS, 1X</td><td></td><td>מק"ט CS200435</td><td>בקבוק אחד המכיל 1000 mL&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>בופר שטיפה HCS, 1X</td><td></td><td>מק"ט 2007643</td><td>בקבוק אחד המכיל 500 mL&lt;br/&gt;רכיבים בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>אקרילאמיד (תרכובת בקרה), 10X</td><td></td><td>מק"ט CS201679</td><td>מבחנה אחת המכילה 500 &amp;#x03BC;L של 1M אקרילאמיד ב-dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>מימן פרוקסיד (תרכובת בקרה), 10X</td><td></td><td>מק"ט CS201730</td><td>מבחנה אחת המכילה 500 &amp;#x03BC;L של 100 mM מימן פרוקסיד ב-dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;רכיבים בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>K-252a (תרכובת בקרה), 250X</td><td></td><td>מק"ט CS201741</td><td>מבחנה אחת המכילה 100 &amp;#x03BC;L של 250 &amp;#x03BC;M K-252a ב-DMSO&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>DMSO לדילול סדרתי של תרכובות</td><td></td><td>מק"ט CS200441</td><td>בקבוק אחד המכיל 10 mL&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>בופר לדילול תרכובות</td><td></td><td>מק"ט CS200442</td><td>בקבוק אחד המכיל 25 mL&lt;br/&gt;רכיב בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>סוגרי פלטות</td><td></td><td>מק"ט CS200443</td><td>10 יחידות&lt;br/&gt;רכיבים בערכת Millipore HCS222</td></tr><tr><td>מיקרופלטות עם תחתית שחורה/שקופה שעברו טיפול לתרבית רקמות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת HCS לדימות/ניתוח</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

עצב astrocyte שותף תרבות assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

גבוהה ניתוח תוכן (HCA) מבחני לשלב תאים ריאגנטים זיהוי עם הדמיה אוטומטיות עוצמה לניתוח אלגוריתמים תמונה, המאפשר מדידה של פנוטיפים הסלולר מרובים בתוך assay אחד. במחקר הנוכחי, השתמשנו HCA לפתח assay הרומן neurotoxicity. Neurotoxicity הערכה מהווה חלק חשוב של הערכה בטיחות התרופה, כמו גם להיות מוקד משמעותי של מאמצי הגנת הסביבה. בנוסף, neurotoxicity גם היטב קיבל<em&gt; במבחנה</em&gt; סמן להתפתחות מחלות ניווניות כגון אלצהיימר ופרקינסון. לאחרונה, היישום של HCA להקרנה עצבית דווחה. על ידי סימון תאים עצביים עם טובולין-βIII, מבחני HCA יכול לספק תפוקה גבוהה, לא סובייקטיבית, מדידות כמותית של פרמטרים כגון מספר העצבית, לספור neurite ואורך neurite, כל אשר יכול להצביע על ההשפעות הנוירו. עם זאת, התפקיד של האסטרוציטים נשאר נחקרו במודלים אלה. האסטרוציטים יש תפקיד אינטגרלי בשמירה על איזון מערכת העצבים המרכזית (CNS), והן קשורות עם neuroprotection והן neurodegradation כאשר הם מופעלים בתגובה חומרים רעילים או מצבי מחלה. GFAP הוא חלבון נימה ביניים הביעו בעיקר האסטרוציטים של מערכת העצבים המרכזית. הפעלת Astrocytic (דבקת) מוביל upregulation של GFAP, מלווה בדרך כלל על ידי הפצת היפרטרופיה astrocyte ו. תהליך זה של דבקת תגובתי הוצע כסמן מוקדם של נזק למערכת העצבים. השיטה המסורתית quantitation GFAP היא immunoassay. גישה זו היא מוגבלת על ידי חוסר יכולת לספק מידע על לוקליזציה מורפולוגיה הסלולר, ומספר התא. אנו נקבע כי HCA יכול לשמש כדי להתגבר על המגבלות האלה ואת למדוד בו זמנית מספר רב של תכונות הקשורות דבקת - שינויים בביטוי GFAP, היפרטרופיה astrocyte, ושגשוגם astrocyte - בתוך assay אחד. בשנת שיתוף תרבות מחקרים, האסטרוציטים הוכחו להגן על הנוירונים מפני מספר סוגים של עלבון רעילים כדי להשפיע באופן קריטי להישרדות עצביים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השימוש האסטרוציטים ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחן מערכת neurotoxicity עשוי להוכיח רלוונטיות יותר מבנה מערכת העצבים המרכזית לתפקד האדם מאשר תאים עצביים לבד. בהתאם לכך, פיתחנו assay HCA לתרבות משותפת של נוירונים האסטרוציטים, המורכב פרוטוקולים תוקף, יעד ספציפי ריאגנטים עבור זיהוי פרופיל βIII-טובולין וחלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP). Assay זה מאפשר ניתוח סימולטני של neurotoxicity, תולדה neurite, דבקת, מורפולוגיה עצב astrocytic ופיתוח עצב astrocytic במגוון רחב של דגמים סלולריים, המייצג את רומן, לא סובייקטיבית, תפוקה גבוהה assay להערכה neurotoxicity. Assay מחזיקה פוטנציאל גדול לאיתור משופרת של neurotoxicity פרודוקטיביות משופרת במדעי המוח מחקר גילוי תרופות.

מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

בדיקות של ניתוח תוכן גבוה (HCA) משלבות תאים וחומרי זיהוי עם דימוי אוטומטי ואלגוריתמים עוצמתיים לניתוח תמונות, מה שמאפשר...

<a class="grey_button" href="/video/1498">
עברית
</a>

a-neuronal-astrocyte-co-culture-assay-for-high-content-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פיתחנו רומן רב תא שיתוף תרבות נוירון פלטפורמה עבור microsystem ב CNS מחקר במבחנה אינטראקציה האקסון, גליה. פלטפורמה המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל היה מפוברק באמצעות פיתח מאקרו / מיקרו שיטת ייצור כלאיים.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

בפרוטוקול זה, אנו תיאר שיטה חדשה ללמוד את השפעת ההטרוגניות תא גליה על צמיחת האקסון...

תא גלייה לימוד הטרוגניות השפעה על הצמיחה אקסון בשיטה Coculture חדש

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס תרבית משותפת עקיפה של נוירון-אסטרוציטים באמצעות גישה ממודרת. במערך זה, נוירונים ואסטרוציטים מופרדים מרחבית אך חולקים תווך מותנה. גורמים נוירוטרופיים המשוחררים על ידי אסטרוציטים מקדמים התמיינות נוירונים ויצירת קשרים סינפטיים, דבר המצביע על אינטראקציות נוירון-גליה.

טכניקה עקיפה של תרבית נוירון-אסטרוציטים לחקר אינטראקציות נוירון-גליה

סרטון זה מדגים הקמת תרבית משותפת של נוירון-אסטרוציטים להקלטת פעילות הרשת העצבית. עם ביסוס התרבות המשותפת של נוירונים מוטוריים ואסטרוציטים על לוח MEA (Multi-electrode Array – Multi-Electrode Array – MEA), הפעילות החשמלית הקצבית הסינכרונית של הרשת העצבית נרשמה באופן חוץ-תאי באמצעות MEA.

רישום הפעילות האלקטרופיזיולוגית של הרשת העצבית בתרבית משותפת של נוירון-אסטרוציטים

סרטון זה מדגים את הערכת הפעילות החשמלית העצבית בתרבית משותפת של נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח שמקורם ב-hiPSC ותאי גליומה באמצעות מכשיר מיקרופלואידי עם מערכים מרובי אלקטרודות.

הערכת אינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים ותאי גליומה בתרבית משותפת

פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) נחשבים כלי רב עוצמה עבור סריקה וכימיים ההקרנה ופיתוח של מודלים חדשים במבחנה לבדיקת רעילות, כולל נוירוטוקסיטי. הנה, פרוטוקול מפורט עבור ההבחנה של hiPSCs לתוך נוירונים וגליה מתואר.

Protocol עבור הבחנה של תאים גזעיים Pluripotent Indoced האדם לתוך תרבויות מעורבות של נוירונים וגליה עבור בדיקה נוירוטוקסיות

הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה לneurite מוצלח הערכה ורעילות המוח של תרכובות מולקולה קטנה.

Neurite Outgrowth שיטת והערכה רעילות נוירועם האדם העצבי תא מחולל נוירונים

כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.

מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה

למדו פרוטוקול לניתוח תכולה גבוהה של נוירוטוקסיות בשותפות תרבית נוירון-אסטרוציט. שיטה זו מאפשרת הערכה רגישה של השפעות רעילות על מערכת העצבים.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

גלה סרטונים נוספים