שילוב העצבים ההיקפית השתלת ומטריקס אפנון לתקן את חוט השדרה עכברוש נפגעים

ההכנה להשתלת עצב פריפרי במיקום של פגיעה בחוט השדרה מתחילה בניוון מוקדם של ה-PNG שבעה עד 10 ימים לפני ההשתלה. ענף של העצב השוקתי (tibial nerve) מחולל חריתה מעכבר תורם. חציית חוט השדרה (hemi section) ברמה צווארית חמישית או C5 מבוצעת באמצעות שאיבה.

את ה-PNG מוציאים מהחולדה התורמת, מניחים אותו מול הדופן הרוסטרלית של חלל הפגיעה ומקבעים אותו על ידי תפירת חוט זהב לקרומי המוח (dura mater). לאחר שלושה שבועיות, יוצרים פגיעה ברבע האחורי (dorsal quadrant) ב-C7; ספוג ג'ל הרווי ב-C-H-A-B-C מוצב בחלל למשך 15 דקות כדי לעכל פרוטאוגליקנים של הצלקת הגליאלית. יומיים לאחר מכן, מזריקים C-H-A-B-C בהזרקה מיקרוסקופית בסמיכות לאתר הפגיעה, ומניחים את הקצה הדיסטלי של ה-PNG מול פגיעת הרבע האחורי.

שלום, אני ג'ון הולה. אני המנהל של מרכז המחקר לפגיעות חוט השדרה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל. אני ד"ר ורוניקה טום ממעבדת הולה ואני מרתה מין.

ממעבדת hula. היום נדגים הליך של השתלה של מקטע של עצב פריפריאלי אל תוך חוט שדרים פגוע של חולדה בוגרת. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור רגנרציה של אקסונים והתאוששות תפקודית לאחר פגיעה בחוט השדרה.

בסדר, בואו נתחיל. כדי להתכונן לניתוח מיקרוסקופי, חטאו את תחנת הניתוח והעבירו את כל כלי הניתוח באוטוקלאב. הכינו את המחסום התרמי ואת חלקי ספוג הג'ל הקטנים, שגודלם פחות מ-2 מילימטרים מעוקב, לצורך המוסטזיס מיקרוסקופי.

הכינו מקלוני צמר גפן, פדי גזה ומכשירים כירורגיים. הניחו את החולדה המורדמת על שולחן ההכנה לאחר שווידאתם באמצעות צביטה בבהונות שהבעל חיים מורדם לחלוטין. גזרו שטח רחב של פרווה מאזור השדה הכירורגי המתוכנן ושטפו את אתר הניתוח בהתאם לטכניקת הקרצוף האספטית המתוארת בפרוטוקול הטקסט המצורף.

בשלב הבא, הניחו את החולדה על כיסוי מחסום התרמי, כסו את אפה ופיה עם קונו השאיפה והפחיתו את ה-isof fluorine ל-3% ואת קצב הזרימה ל-0.2 liters per minute. ניתן מינון מתאים של האנטיביוטיקה ampicillin בהזרקה תת-עורית ושל המשכך buprenorphine בהזרקה תוך-שרירית. העצב ההיקפי (PN) נחתך שבעה עד 10 ימים לפני הסרתו כדי לעודד דגנרציה, דבר המקנה סביבה המתאימה יותר לצמיחת אקסונים מאשר הכנה של עצב טרי.

כדי להתחיל את חיתוך העצב הפריפריאלי (pn), הנח את החיה על צדה. החלף לכפפות סטריליות והנח סדין כירורגי סטרילי סביב אתר הניתוח. בצע חתך בקו ישר מראש הפמור (עצם הירך) עד הברך, תוך שמירה על מקביליות ומרחק של כ-3 מילימטרים מהפמור; חתוך דרך השרירים השטחיים של ה-biceps femoris לאורך אותו קו של חתך העור כדי לחשוף את שריר ה-vastus lateralis שמתחתם.

לאחר חשיפת שריר ה-vastus lateralis, השתמש במספריים כדי לבצע חתך קטן בו סמוך לברך והרחב אותו כלפי מעלה לכיוון ראש ה-femur. הפר בעדינות באמצעות רטראקטורים את ה-vastus lateralis עד שניתן יהיה לראות את ענפי העצב הטיביאלי והפריניאלי המאוחדים של העצב הסיאטיק רצים במקביל ל-femur. לאחר מכן, עקוב אחר ענפי עצב אלו לכיוון ראש ה-femur עד לזיהוי הגזע הראשי של העצב הסיאטיק.

במרחק קצר מתחת להתפצלות של עצב ה sciatic, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להפריד בזהירות את רקמת החיבור או את האפינוריום (epineurium) המקיפים את ענף עצב הטיביאליס (tibial nerve). זהו הענף הגדול יותר. לאחר בידוד ענף עצב הטיביאליס, העבירו סביבו ליגטורה של משי 6-0 והדקו אותה.

השתמשו במספרי מיקרו כדי לחתוך את קצה העצב החשוף עד לליגטורה. העבירו את חוט התפר דרך שריר ה-vastus lateralis וקשרו אותו בקשר. פעולה זו תספק סימון לאיתור קל של הקצה החתוך של העצב הטיביאלי.

כאשר העצב נשלף. לאחר מכן, סגרו את שריר ה-vastus lateralis באמצעות תפרים של משי 6-0. לאחר מכן, סגרו את שריר ה-biceps femoris באמצעות תפרים של משי 6-0.

לבסוף, סגרו את העור באמצעות סגורי פצעים מסוג Michelle. הפסיקו את זרימת ה-isof fluorine והסירו את קונו האף לשאיפה. הניחו את בעל החיים בכלוב המתנה על מחסום תרמי.

החזיר את החיה לכלוב המגורים שלה. לאחר שהיא תהיה ערנית ואקטיבית, שבעה עד 10 ימים מאוחר יותר, מקטע ה-PN יהיה מוכן לקצירה. כדי להתחיל בהשתלה, הנח את החיה המורדמת על מחסום התרמי.

לאחר אישור שהבעל החיים נמצא תחת הרדמה מלאה, הסירו את תפסני הפצע והפרידו את חתך העור. ייתכן שלא יהיה צורך בגילוח מוקדם של האזור, שכן העור אמור להיפתח בקלות תוך מניעת זיהום. כדי למנוע את הצורך בחיתוך דרך הפרווה, חתכו את התפר של השריר השטחי כדי לחשוף את ה-vastus laterals, ולאחר מכן חתכו את התפר בשריר זה.

עקבו אחר קו התפר עד לקצה החתוך של העצב הטיביאלי (tibial nerve) והסירו את התפר מהעצב. השתמשו בפינצטה עדינה כדי להפריד את האפינוריום (epineurium) מאורך של 15 מילימטר של העצב הטיביאלי וחתכו דרך קצה זה. הסירו את מקטע העצב ושקיעו אותו בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (Hank's balanced salt solution) סטרילית.

אנו מוכנים כעת לשלב הבא, שבו נגרום לפגיעה בחוט השדרה לצורך השתלה של ה-PN; ההשתלה עשויה להיות אוטולוגית או הטרולוגית. הנח את החולדה המורדמת על המחסום התרמי ותן אנטיביוטיקה ומשככי כאבים כפי שתוֹאר בסעיף הקודם כדי לגרום לפגיעה מסוג HEMI section בחוט השדרה. ראשית, אתר את השקע התעמימי (occipital notch) ואת הבליטה של זקירי הגב ב-T2.

בצעו חתך לכל האורך בין נקודות ציון חיצוניות אלו. חתכו דרך קו האמצע של שריר הטרפז השטחי והפרידו את שרירי העורף העמוקים שמתחתיו. הכניסו מפריד כדי להחזיק את השרירים בנפרד.

יש לחתוך את השרירים הסופראספינליים העמוקים מהזיזים הגביים של חוליות C4, C5 ו-C6. באמצעות מספרי R-jurors, בצעו למינקטומיה חלקית של C5 כדי לחשוף את כל הצד הימני ואת החלק המדיאלי של הצד השמאלי של חוט השדרה. השתמשו בווריד הגבי הבולט כנקודת ייחוס לקו האמצע של חוט השדרה.

בשלב הבא, השתמש בלהב מיקרו-סקלפל כדי לנקב את הקרומיים הקשיחים (dura mater) ולהרחיב את החתך מעל חוט השדרה בגובה C5. בצע חתך קטן ברובד העכביש (subarachnoid) ובקרומיים הרכים (pia mater) שמתחתיו באמצעות מיקרו-קנולה מזכוכית משוכה. התחל לשאוב את הצד הגבי הימני של חוט השדרה תוך הפעלת לחץ עדין ושימוש במיקרו-פינצטה כדי להפריד את הרקמה ולהקל על הסרתה.

המשיכו דרך החלקים הבינוניים והבטניים של חוט השדרה כדי ליצור חלל באורך שני מילימטרים, אשר יהיה שלם מהצד הגבי לבטני ומהקו האמצעי ועד הקרומים המוחים הלטרליים. הניחו ג'ל-ספוג (gel foam) ספוג בסלין לתוך חלל הפגיעה במקטע ה-HEMI. כדי להשיג המוסטזה, הוציאו את מקטע העצב הפריפריאלי שנאסף קודם לכן מתמיסת ה-Hank.

הסר בעדינות את האפניוריום משלושת המילימטרים הפרוקסימליים של מקטע העצב והצמד קצה זה לדופן הרוסטרלית של חלל הפגיעה בחתך ה-HEMI. קבע את המקטע באמצעות 10 תפרים דרך האפניוריום אל העטיפה הקשה (dura mater). לאחר מכן, תפר את העטיפה הקשה לסגירה מעל הקצה המושתל של השטבל, תוך דחיסת השטבל בין שני חתיכות של ממבנה אלסטי של cel.

מקם את השתל לצד בולטות החוליות C6, C7 ו-T1. אין להצמיד את קצה העצב הדיסטלי לחוט השדרה או לרקמת שריר. סגור את השרירים בשכבות באמצעות תפרי 4-0, וסגור את חתך העור באמצעות סוגרי פצעים.

לבסוף, הניחו את החיה בכלוב המתנה על מחסום תרמי והחזירו אותה לכלוב המגורים שלה. ברגע שהיא ערה ופעילה, אקסונים שנוצרו מחדש ומגיעים לקצה הדיסטלי של הש Transplant של ה-PN נכשלים לעיתים קרובות בלהתרחב חזרה אל תוך חוט השדרה. לכן, אנו משתמשים בהזרקות מיקרוסקופיות של chondroitin ACE כדי לפרק את רקמת הצלקת המקיפה את אזור הפגיעה.

נוהל זה מבוצע 21 ימים לאחר השתלת ה-PN. ראשית, ודאו שהבעל חיים מורדם לחלוטין. לאחר מכן, הסירו את תפסני הפצע והעניקו אנטיביוטיקה ומשככי כאב כפי שהודגם בעבר. גזרו את התפרים השטחיים כדי לחשוף את הממברנה האלסטית המקיפה את השתל העצבי, באמצעות פינצטה עדינה ומספרי קפיץ.

שחרר בזהירות את אורך העצב מהממברנות האלסטיות. הרחק את העצב משדה הניתוח. בצע למינקטומיה חלקית בצד ימין של בלט העמוד השדרה ב-C7.

נקבו את הקרומים (meninges) בעזרת להב מיקרו-סקלפל, ובעזרת שאיבה, הכינו חלל פגיעה ריבועי ברוחב מילימטר אחד ברבע הגבי של חוט השדרה ב-C7. הניחו ספוג ג'ל ספוג במי מלח (saline) בתוך חלל הפגיעה כדי להשיג המוסטזיס. לאחר מכן, החליפו את ספוג הג'ל בספוג ספוג ב-chondroitinase.

A BC.טפל באתר הנגע למשך 15 דקות, תוך אספקת ספוג ג'ל טרי הספוג ב-chondroitin כל חמש דקות. כסה את אורכו החיצוני של השתל העצבי בממברנה שולסטית. סגור את השרירים השטחיים באמצעות תפרי 4-0 ואת חתך העור באמצעות סיכות לסגירת פצעים.

הניחו את החיה בכלוב השגחה על מחסום תרמי והחזירו אותה לכלוב המגורים ברגע שהיא עירנית ופעילה. יומיים לאחר מכן, 23 ימים אחרי השתלת ה-PN, מבוצע ניתוח חוזר בחיה לצורך הזרקה מיקרוסקופית של chondroitin NA לתוך חוט השדרה. כפי שנעשה קודם לכן, הסירים את סגירת הפצע מהחיה המורדמת וניתנו אנטיביוטיקה ומשככי כאבים.

גזרו את התפרים השטחיים כדי לחשוף את הממברנה האלסטית המקיפה את השתל העצב. חשפו את אתר השתל ב-C seven מבלי להפריע להשתל. לאחר מכן, השתמשו במזרק Hamilton עם קנולה מזכוכית שמשכה כדי להזריק במיקרו-זריקה 1 µL של chondroitin ace A BC לצד ימין של חבל השדרה, במרחק של כ-1 mm דיסטלית לנקודת ההצמדה של השתל לחבל השדרה.

קלפו בעדינות את ה-EUR משני המילימטרים הדיסטליים של מקטע העצב, והצמידו קצה זה לחלל הנגע ב-C שבע. קבעו את המקטע באמצעות תפרים בגודל 10-0 דרך האפינוריום לדורה מאטר. סגרו את השרירים השטחיים בעזרת תפרים בגודל 4-0 ואת חתך העור באמצעות סגורי פצעים.

הנח את בעל החיים בכלוב השגחה על מחסום תרמי והחזירו לכלוב הבית ברגע שיהיה ער ופעיל. כאשר נוהל זה מיוטב, מקטע העצב ההיקפי ישתלב באופן הדוק עם שם שם השדרה של המארח כדי לאפשר ויזואליזציה של אקסונים שדרתיים המשתקמים אל תוך השתל. מילאנו את השתל בשיטת דיפוזיה ב-biotinylated dextran amine או BDA, באופן עולה ויורד.

אקסונים של חוט השדרה יחדרו בדרך כלל אל השתל, יגדלו בקו ישר יחסית במקביל לאורך השתל וישתרעו עד לקצה הדיסטלי של השתל בקצב של כמילימטר אחד ליום. אקסונים של עצבים פריפריאליים יחדרו אל חוט השדרה הסמוך. אם נעשה שימוש ב-chondroitin NACE להסרת פרוטאוגליקנים מעכבים מרקמת הצלקת המקיפה, הרי שעם ההגעה לקצה הדיסטלי, מעט מאוד אקסונים של עצבים פריפריאליים ישתרעו אל רקמת המארח לאחר טיפול ב-vehicle.

עם זאת, אם הממשק הדיסטלי טופל בחונדרויטין, מספר רב יותר של אקסונים בולטים מהשתל כדי לחדש את העצבוב של חוט השדרה. כפי שמוצג כאן בחתך מייצג אחד מתוך 15 עד 20 חתכים לבעל חיים שבהם נצפתה צמיחה אקסונית, גרף עמודות זה מדגים עלייה משמעותית בצמיחה אקסונית לאחר טיפול ב-conjoin nace A BC. ניתן להשתמש בזיהוי אימונוכימי של סממנים סינפטיים בנוירונים של חוט השדרה בתגובה לגירוי חשמלי של האקסונים בתוך השתל כדי להעריך קישוריות תפקודית בין השתל המושתל לבין חוט השדרה של המארח.

אזור זה של חוט השדרה, המכיל את נקודת ההצמדה הדיסטלית, נצבע בשיטה אימונו-ציטוכימית הן עבור biotinylated dextran amine בירוק והן עבור הסמן הסינפטי synapsin באדום. חצים מצביעים על אזורים שבהם נמצא קולוקליזציה של הסמנים, המעידה על כך שחלק מהסיבים שנוצרו מחדש מהשתבל יצרו מגעים סינפטיים תפקודיים. קישוריות תפקודית בין השתבל לבין נוירוני חוט השדרה הודגמה גם באמצעות בדיקה לביטוי של c-Fos. בעקבות גירוי סינפטי של נוירוני המארח מעבר לממשק הדיסטלי, ניתן לזהות סמן הפעלה טרנס-סינפטי זה על ידי נוירונים רבים חיוביים ל-c-Fos ברקמה שנמצאת בצד ה-ipsilateral לאתר השתבל, ובהגדלה גבוהה יותר, ניתן להבחין בנוירונים מעט מאוד חיוביים ל-c-Fos ברקמה שנמצאת בצד ה-contralateral להשתבל.

הראינו לכם כעת כיצד להכין את אתר הפגיעה בחוט השדרה לקראת השתלה של השתלה של רקמה מעצב היקפי כדי לעודד התחדשות לאחר פגיעה בחוט השדרה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להבטיח אורך עצב מספיק לפני ההשתלה ולהשיג הצמדה הדוקה של השתל לאתר הפגיעה בחוט השדרה. זהו כל התהליך.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.