במבחנה גירוי בעור מבחן (SIT) באמצעות EpiDerm שחזור האדם עוריות (RHE) דגם

אפידרם הוא תא אנושי רגיל שמקורו במודל מבחנה משוחזר של האפידרמיס האנושי שפותח על ידי תאגיד Matt Tech. פרוטוקול בדיקת גירוי עור האפידרם המאומת על ידי EC VM מחליף בדיקות מסורתיות מבוססות בעלי חיים של מוצרים כגון קוסמטיקה, חומרי גלם וחומרים תעשייתיים שיבואו במגע עם עור האדם. בדיקה זו מתחילה ביום האפס כאשר ערכת גירוי העור ורקמת האפידרם מגיעות למעבדה ולאחר מכן מותנות מראש במדיום בדיקה לאחר דגירה של לילה.

ביום הראשון, המשטח הלא טיפוסי של רקמת האפידרם נחשף למשך שעה עם תרכובת מגרה כביכול ואז מסירים את הגירוי בצעד כביסה ביום השני. לאחר דגירה של 24 שעות, הכנסת התרבית מונחת במדיה טרייה וניתן להשתמש במדיה הישנה לניתוח ציטוקינים וכימוקינים ששוחררו. הרקמה מגיבה עם תרכובת המכונה MTT, המומרת על ידי רדוקטאז מיטוכונדריאלי לסגול כהה עבור מעוז ומלח.

מתן קריאה לכדאיות התא. היעדר צבע סגול כהה במדגם הוא אינדיקטור לירידה בכדאיות. וכאשר קריאת מדד הקלור עבור תרכובת בדיקה היא פחות מ-50% מהבקרות השליליות, ניתן לסווג את תרכובת הבדיקה כגורם מגרה.

היי, אני הלנה קאווה מתאגיד מאט. היום נראה לך נוהל לבדיקת גירוי עור במבחנה באמצעות אפידרם מודל עור אנושי משוחזר. הליך זה, בהתאם לדרישות הרגולטוריות, יכול לשמש כתחליף מלא או חלקי של בדיקת גירוי מהיר בעור in vivo.

הליך חדש זה במבחנה יכול לשמש לזיהוי סכנות ותיוג של כימיקלים וחומרי גלם קוסמטיים. אז בואו נתחיל. האפידרם נגזר מתרבית קרטינוציטים אפידרמיס אנושית ליצירת מודל תלת מימדי, רב שכבתי ומובחן מאוד של האפידרמיס האנושי.

הרקמות פעילות מבחינה מיטוטית ומטבולית, מחקות מקרוב את מקבילותיהן in vivo הן מבחינה מבנית והן מבחינה ביוכימית, ועושות זאת עם יכולת שחזור מובטחת כמו אפידרמיס אנושי. האפידרם מורכב משכבות בסיסיות, קוצניות וגרגיריות מאורגנות ושכבה קרנית רב שכבתית. האחרון מכיל שכבות ליפידים בין-תאיות של מילר המסודרות בתבניות אנלוגיות לאלו שנמצאו ב-vivo.

רקמות אלו מתורבתות במדיום נטול סרום. כל רקמה שגדלה בתוספת תרבית תאים בודדת. תצורות אחרות זמינות כולל פורמט תפוקה גבוהה של 96

ייצור הרקמה לוקח כשלושה שבועות להשלים בנקודה מסוימת בתהליך זה, הרקמה מורמת לממשק נוזל האוויר וכל הנוזל מוסר משטח ה-APIC של הרקמה. הרקמות של N מוזנות רק דרך המשטח הבסיסי, שנשאר במגע עם מדיום התרבות הקנייני של mat tech. ערכת אפידרם טיפוסית מכילה 24 רקמות בכל רקמה, בקוטר תשעה מילימטרים בתוספת תרבית רקמה משלה בתוספת מדיום בדיקה מספיק לביצוע בדיקת גירוי עור זו.

24 התוספות יושבות היטב על ג'ל ורדים AGA עם החדרה בינונית, רקמה אחת בכל באר של משלוח סטנדרטי של 24 בארות היא על ידי מוביל לילה בטמפרטורה של שלוש עד ארבע מעלות צלזיוס לפני היציאה לבדיקת כימיקלים. באמצעות מערכת בדיקת האפידרם, הכינו ועקרו את כל המכשירים והכלים המשמשים בבדיקה כמתואר בפרוטוקול הכתוב. חלק מהחומרים כמו צמר גפן צריכים להגיע באריזה סטרילית או לעבור חיטוי.

יש להשתמש באתנול של 70% לעיקור מכשירים כגון מלקחיים וקרינת UV או קרינת גמא לעיקור בקבוקי הכביסה. שני פתרונות קריטיים המשמשים בבדיקה צריכים להיות DPBS מוכן מראש ופתרון SDS של 5%. במים מזוקקים, כשני ליטר של DPBS pH 7 סטרילי ישמשו בבדיקה עם ערכה אחת המכילה 24 רקמות אפידרם.

DPBS סטרילי משמש כבקרה שלילית כמו גם כפתרון כביסה. יש להכין 5% SDS ולהשתמש בו כבקרה חיובית. בדיקת גירוי העור מתחילה עם קבלת ערכת EPIDERM EPI 200 SIT.

הקפד לבדוק את תקינות כל רכיבי הערכה ופנה מיד לתאגיד Mat Tech בכל חשש אם הכל שם, המשך לשלב הבא. כדי להתחיל בבדיקה, תן למדיום הבדיקה המצורף לערכה להגיע לטמפרטורת החדר. אין לחמם מראש במכסה המנוע הלמינר.

הכן צלחת סטרילית אחת של שש בארות לכל שלוש תוספות רקמת אפידרם ופיפטה 0.9 מיליליטר ממדיום הבדיקה לכל באר בתנאים סטריליים. פתח את שקית הניילון המחזיקה את צלחת 24 הבארות המכילה את רקמות האפידרמיס תחת זרימת אוויר סטרילית. הסר את הגזה הסטרילית והשתמש במלקחיים סטריליים כדי להוציא בזהירות כל תוספת המכילה את רקמת האפידרמיס.

הסר את כל הארוס שנותר שנדבק לצדדים החיצוניים של התוספת על ידי ספיגה עדינה על גזה סטרילית או נייר פילטר. ואז הניחו את הטישו בצלחת הריקה הסטרילית 24 באר תוך חמש הדקות הבאות. בדוק חזותית את התוספות.

רשום כל פגמים ברקמות ועודף לחות על פני השטח. אין להשתמש ברקמות או רקמות פגומות. מכוסה לחלוטין בנוזל.

תוספות רקמות אופטימליות. צריך להיות בעל משטח יבש ולהיות נקי מניתוקים, חלקים לא אחידים או עודף נוזלים על פני השטח. לאחר מכן, בעזרת ספוגית קצה כותנה סטרילית, יבש בזהירות את פני הרקמות.

נסו לא לגעת ישירות ברקמה. השפעות נימיות מספיקות בכדי להסיר את הלחות מהמשטח לאחר ייבוש המשטח. העבירו שלוש רקמות לשורה העליונה של כל שש.

צלחת היטב מלאה מראש במדיום בדיקה של 0.9 מיליליטר. שחרר את כל בועות האוויר הכלואות מתחת לתוספות. לאחר מכן הכניסו את שש צלחות הבאר המכילות את התוספות לתוך החממה למשך שעה.

דגירה מוקדמת ב-37 מעלות צלזיוס. בתום תקופת הדגירה הראשונה, העבירו את התוספות מהבארות העליונות לבארות התחתונות של צלחת שש הבארות. הכניסו את הצלחות בחזרה לחממה לדגירה מוקדמת למשך הלילה.

הכניסו את שאר אמצעי הבדיקה למקרר. לאחר הדגירה המוקדמת של הלילה ניתן למרוח את כימיקלים הבדיקה על תוספות רקמת האפידרם. לפני שתתחיל בבדיקת החשיפה הכימית, הנח את כל המכשירים, התמיסות והכימיקלים הדרושים בטמפרטורת החדר.

במכסה המנוע הסטרילי, נגב את כל בקבוקי החומר הלא סטרילי עם אתנול 70% לפני הנחתם בתוך מכסה המנוע. יש למקם את הבקרה השלילית הסטרילית DPBS בקרה חיובית ו-5% SDS ומים מזוקקים גם במכסה המנוע ובטמפרטורת החדר. יש להניח בקבוקון גדול לפסולת.

הכן שש אחד. צלחת באר לכל כימיקל על ידי מילוי השורה העליונה רק ב-0.9 מיליליטר של מדיום בדיקה לבאר. סמן כל צלחת עם מספר רקמה ושם כימי.

כחמש דקות לפני החשיפה המתוכננת לכימיקלים. הסר את שש צלחות הבאר המכילות את רקמות המצב המוקדם מהחממה. ואז להעריך חזותית את פני הרקמות.

הסר כל לחות באמצעות קצות כותנה סטריליים ואל תלחץ על משטח הרקמה. לבסוף, סמן את ששת מכסי צלחת הבאר בקודים או בשמות של חומרי הבדיקה. אין לבדוק יותר משישה כימיקלים, כולל בקרות שליליות וחיוביות כל אחת בשלוש פעמים בבדיקה אחת.

השתמש ביישום כימי ובמרווח כביסה של דקה אחת לטיפול בחומרי בדיקה ידועים. עקוב אחר ההוראות המופיעות בגיליון נתוני בטיחות החומרים או MSDS עבור דוגמאות מקודדות או לא ידועות. פעל לפי הנחיות הבטיחות הכימית והשתמש בארון מאוורר.

ללבוש כפפות ולהגן על רקמות המינון של העיניים והפנים שלך עם כימיקלים במרווחי זמן של דקה אחת כדי להקל על שטיפה של כימיקלים לבדיקה לאחר החשיפה, שמור את הצלחות עם רקמות המינון במכסה המנוע הלמינרי עד למינון הרקמה האחרונה. נורה שעוברת על פני הפיפטה שלך תשמש לאורך כל ההליך כדי לתפעל את הרקמה ולבדוק תרכובות. ניתן להשתמש בבוער מבער בונסן ליצירת קצה בצורת נורה לבדיקת כימיקלים נוזליים.

הוצא 30 מיקרוליטר מחומר הבדיקה הנוזלי ישירות על גבי הרקמה והפעל מיד את הטיימר כך שהוא יספור למעלה. הניחו את רשת הניילון על פני הרקמה כאשר הטיימר מגיע לדקה אחת, הוסיפו את התרכובת הנוזלית השנייה. השתמש בשלוש רקמות לכל כימיקל בדיקה וזכור להוסיף כל תרכובת במרווחי זמן של דקה.

לבדיקת מוצקים למחצה, השתמש בפיפטה תזוזה חיובית כדי להוציא 30 מיקרוליטר ישירות על גבי הרקמה. במידת הצורך, מורחים את הכימיקל עם פיפטת מרעה כך שתתאים לגודל הרקמה. זמן קצר לפני מריחת החומר המוצק, הרטיבו את משטח הרקמה ב-25 מיקרוליטר של DPBS סטרילי כדי לשפר את המגע של משטח הרקמה עם כימיקל הבדיקה מלאו כף יישום חדה של 25 מיליגרם בחומר הבדיקה הטחון העדין.

מרחו את כימיקל הבדיקה המוצק על פני הרקמה. במידת הצורך, השתמש בנורה סטרילית המובילה על פני הפיפטה שלך כדי לרוקן את הכף לחלוטין. נענע בעדינות את התוספות כדי לשפר את התפשטות המוצק על פני השטח.

אתה יכול גם להשתמש בנורה המובילה ליד הפיפטה שלך כדי להתאים לגודל הרקמה. אין ללחוץ על משטח הרקמה. לבסוף, החל DPBS כבקרה שלילית ו-5% SDS כבקרה חיובית על הרקמות גם בשלוש פעמים לאחר מינון הרקמה האחרונה, העביר את כל הצלחות למשך 35 פלוס מינוס דקה אחת לאינקובטור הלח של 37 מעלות צלזיוס.

במהלך הדגירה הזו, הקפידו למקם את כל החומרים הדרושים לשלבי הכביסה במכסה המנוע. לאחר הדגירה של 35 דקות, הוציאו את כל הצלחות מהחממה. הנח אותם במכסה המנוע הסטרילי והמתן עד לפרק זמן של 60 דקות להשלמת החשיפה הכימית לרקמת המנה הראשונה.

לאחר מכן, התחל בהליך הכביסה. שוטפים את הרקמות עם DPBS סטרילי 15 פעמים. כדי להסיר כל חומר בדיקה שנותר, מלא את תוספת הרקמה באמצעות זרם קבוע של DPBS המסופק במרחק של 1.5 סנטימטרים משטח הרקמה ורוקן אותו.

ודא שזרם ה-DPBS אינו חלש מדי או שחומר הבדיקה לא יוסר. זכור לשמור על מרווח זמן של דקה לשטיפת ארבע רקמות עם רשת ניילון, לשטוף חמש פעמים ולהסיר את הרשת בזהירות בעזרת המלקחיים המחודדים והחדים. לאחר מכן המשיכו עם 10 הכביסות הנותרות לאחר ה-15 לחודש, שטפו באמצעות בקבוק הכביסה הטביעו לחלוטין את התוספת שלוש פעמים ו-150 מיליליטר DPBS ונערו כדי להסיר את שארית חומר הבדיקה.

לבסוף, שטפו את הטישו. הכנס פעם אחת מבפנים ופעם אחת מבחוץ עם DPBS סטרילי. הסר את כל עודפי ה-DPBS מהרקמה על ידי ניעור עדין של התוסף וספיגתו על נייר הספיגה הסטרילי.

לאחר מכן, העבירו את תוספות הרקמה המוכתמות לצלחת שש הבארות החדשה שמולאה בעבר במדיום בדיקה. שוב, זכרו שכל השלבים הללו חייבים להיעשות במרווח של דקה אחת כדי לשמור על זמן החשיפה של 60 דקות לכל חשיפה. לאחר שטיפת הרקמה האחרונה, יבש בזהירות את פני השטח של כל רקמה בעזרת ספוגית כותנה סטרילית.

אם עדיין קיימים עקבות של הכימיקל על פני השטח, נסה להסיר אותם באמצעות צמר גפן סטרילי. רקמות דגירה אחרונות בחממה למשך 24 השעות הבאות. רשום את שעת ההתחלה של הדגירה בגיליון התיעוד של השיטות.

רשום גם את כל היישומים השונים בגיליון תיעוד השיטה. נספח לנוהל ההפעלה הסטנדרטי המסופק על ידי Mat Tech Corporation הזזת הלוחות במכסה המנוע. העבירו את התוספת לחלק התחתון של צלחת שש הבארות הממולאת מראש במדיה של 0.9 מיליליטר.

אוספים את המדיה מהשורה העליונה ועורכים בצינור לצלחת 24 בארות מסומנת מראש, אשר מונחת לאחר מכן במינוס 20 מעלות צלזיוס. עד לניתוח, ניתוח ציטוקינים ו/או כימוקינים המשתחררים למצע התרבית הוא שלב אופציונלי. המשיכו עם הדגירה עוד 18 עד פלוס מינוס שלוש שעות עבור תווית בדיקת MTT 2 24 לוחות באר עם השמות או הקודים הכימיים.

זכרו ש-MTT רעיל, אז הקפידו ללבוש כפפות מגן. בעת הטיפול. הכן את תמיסת ה-MTT על ידי הפשרת תרכיז ה-MTT ודילול שלו עם מדלל ה-MTT.

יש להגן מפני אור מכיוון ש-MTT רגיש לאור ויש להשתמש תוך שעתיים-שלוש. מכיוון ש- MTT מתכלה עם הזמן פיפטה 300 מיקרוליטר של מדיום MTT בכל באר של צלחת 24 הבארות. כעת הסר את שש צלחות הבאר מהחממה.

כתם את החלק התחתון של התוספות על נייר סופג והעביר אותם לצלחת 24 בארות ממולאת מראש ב- MTT. מניחים את צלחת 24 הבאר בחממה ודוגרים למשך שלוש שעות. אל תשכח לתעד את שעת ההתחלה של דגירה MTT ב-MDS הקפידו על זמן הדגירה של שלוש שעות כדי להימנע מקבלת קריאות MTT שונות לאחר השלמת הדגירה של MTT, השתמש במשאבת יניקה עם מלכודת פסולת רעילה כדי לשאוב בעדינות את מדיום ה-MTT מכל הבארות.

מלאו את הבארות ב- DPBS ושאפו. שוב, חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות וודא שהטישו יבש לאחר השאיפה האחרונה. לאחר השטיפות, העבירו את התוספות לצלחת חדשה של 24 בארות, טבלו את התוספות על ידי פיפטינג עדין של שני מיליליטר של תמיסת תמצית לכל תוספת.

המפלס יעלה מעל הקצוות העליונים של התוספת, ובכך יכסה לחלוטין את הרקמות משני הצדדים. אטום את צלחת 24 הבארות באמצעות אוטם חום או פרפורם כדי לעכב תמצית ואידוי. רשום את שעת ההתחלה של המיצוי בגיליון התיעוד של השיטות וחלץ למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין על שייקר צלחת לאחר השלמת תקופת החילוץ, נקב את התוספות בעזרת מחט הזרקה או נורה המובילה על פני הפיפטה שלך ואפשר לתמצית לרוץ לבאר שממנה נלקחה התוספת.

השליכו את התוספות המנוקבות ופיפטו את התמיסה בבאר למעלה ולמטה שלוש פעמים עד שהיא הומוגנית. ניתן להשתמש גם בשייקר צלחות המוגדר ל-120 סל"ד לכל רקמה. העבירו שני ליטרים של 200 מיקרוליטר של הפורמה הכחולה והתמיסה לתוך צלחת מיקרו טיטר תחתונה שטוחה של 96 באר.

העבר את הכפילויות בהתאם לעיצוב הלוח הקבוע המופיע בגיליון האלקטרוני הנלווה לפרוטוקול וידאו זה עבור ריקים. השתמש בפרופנול ISO, קרא את הצפיפות האופטית או OD וספקטרופוטומטר צלחת 96 באר באמצעות אורך גל של 570 ננומטר ללא שימוש במסנן ייחוס. הזן את התוצאות בגיליון האלקטרוני לחישוב אוטומטי של התוצאות.

קחו בחשבון תיקונים עקב הפרעות כימיות לבדיקה כמתואר בפרוטוקול הנלווה, כימיקל בדיקה מסומן כמגרה. אם אחוז כדאיות הרקמה שווה או קטן מ-50% לאחר ניתוח פוטומטרי ספקטרו, ה-OD חמש 70 של רקמות ה-NC גדול או שווה ל-1 וקטן או שווה ל-2.5. והכדאיות הממוצעת של רקמות PC המתבטאת כאחוז מרקמות הבקרה השליליות היא פחות מ-20%ו-SD המחושב מאחוז בודד של שונות רקמה של שלושה רפליקנטים שטופלו באופן זהה הוא פחות מ-18%תרכובות המניבות ערכי כדאיות תאים פחות מ-50% יכולות להיחשב כמגרות.

זה עתה הראינו לך כיצד לבצע את בדיקת גירוי העור המאומתת של 60 דקות, 42 שעות עם מודל עור אנושי משוחזר. אפידרם. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי חלק עיקרי מהבדיקה מבוצע בתנאים סטריליים או ספיגה. אם יש צורך בשינוי שיטה כלשהו או אם אתה זקוק להסבר טוב יותר על כל אחד משלבי ההליך, אנא אל תהסס לפנות אלינו לקבלת עזרה וייעוץ.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.