במבחנה גירוי בעור מבחן (SIT) באמצעות EpiDerm שחזור האדם עוריות (RHE) דגם

Epiderm הוא מודל שחזור של האפידרמיס האנושי in vitro המופק מתאי אדם נורמליים, שפותח על ידי תאגיד Matt Tech. פרוטוקול בדיקת גירוי העור של EC VM המהוכה עבור Epiderm מחליף את הבדיקות המסורתיות המבוססות על בעלי חיים עבור מוצרים כגון קוסמטיקה, חומרי גלם וחומרים תעשייתיים שבאים במגע עם עור האדם. בדיקה זו מתחילה ביום אפס, עם הגעת ערכת בדיקת גירוי העור ורקמת ה-Epiderm למעבדה, ולאחר מכן מבוצע התנייה מוקדמת (preconditioning) בתווך בדיקה בעקבות אינקובציה למשך לילה.

ביום הראשון, הפני השטח הבלתי-טיפוסיים של רקמת האפידרמיס נחשפים למשך שעה אחת לתרכובת המהווה גירוי משוער, ולאחר מכן מוסר הגרם המגרה באמצעות שלב שטיפה ביום השני. לאחר דגירה של 24 שעות, מוצב המבנית של התרבית (culture insert) במצע טרי, ואת המצע הישן ניתן להשתמש לצורך ניתוח של ציטוקינים וכימוקינים ששוחררו. הרקמה מגיבה לתרכובת הידועה כ-MTT, אשר מומרת על ידי רדוקטאז מיטוכונדרי לצבע סגול כהה עבור מדידה וניתוח.

מתן קריאה לבדיקת חיוניות תאים. היעדר צבע סגול כהה בדגימה מהווה אינדיקציה לירידה בחיוניות. כאשר הקריאה הקולורימטרית עבור תרכובת נבדקת נמוכה מ-50% של הביקורות השליליות, ניתן לסווג את התרכובת הנבדקת כגורם מגרה.

שלום, אני הלנה קאבה מ-Matt Corporation. היום נדגים לכם את ההליך לבדיקת גירוי עור in vitro באמצעות מודל עור אנושי משוחזר מסוג epiderm. הליך זה, בהתאם לדרישות הרגולטוריות, יכול לשמש כתחליף מלא או חלקי לבדיקת גירוי עור מהירה in vivo.

ניתן להשתמש בפרוצדורה חדשה זו in vitro לזיהוי סיכונים ולסימון של כימיקלים וחומרי גלם קוסמטיים. אז בואו נתחיל. Epiderm מופק מתרבית של קרטינוציטים אפידרמליים אנושיים כדי ליצור מודל תלת-ממדי, רב-שכבתי ומובחן מאוד של האפידרמיס האנושי.

הרקמות פעילות מבחינה מיטוטית ומטבולית, מדמות באופן הדוק את מקביליהן in vivo הן מבחינה מבנית והן מבחינה ביוכימית, ועושות זאת עם הדירות מובטחת, בדומה לאפידרמיס אנושי. ה-Epiderm מורכב משכבות בסיסית, ספינוזית וגרנולרית מאורגנות, ומשכבת קרנית (stratum corneum) רב-שכבתית. השכבה האחרונה מכילה שכבות שומן בין-תאיות מסוג lam Miller המסודרות בתבניות דומות לאלו שנמצאות in vivo.

רקמות אלו תורגדו במצע נטול סרום. כל רקמה גדלה בתוך תבנית תרבית תאים (cell culture insert) נפרדת. קיימות תצורות נוספות, כולל פורמט של 96 בארות לסריקה רחבה (high throughput).

ייצור הרקמה אורך כשלושה שבועות; בנקודה ספציפית בתהליך זה, הרקמה מועלה לממשק אויר-נוזל וכל הנוזל מוסר מהמשטח האפיקלי (APIC) של הרקמה. הרקמות מוזנות אך ורק דרך המשטח הבסולטרלי, שנותר במגע עם מצע התרבית הקנייני של Mat Tek. ערכת Epiderm טיפוסית מכילה 24 רקמות, כאשר כל רקמה היא בקוטר של תשעה מילימטרים ובתוך תא הכנסה (insert) לתרבית רקמה משלה, בתוספת מצע בדיקה מספיק לביצוע מבחן גירוי עור זה.

24 ההכנסות (inserts) מונחות בצורה יציבה על ג'ל ורדים AGA המועשר במצע, כאשר רקמה אחת נמצאת בכל באר של פלטת 24 בארות סטנדרטית; המשלוח מתבצע באמצעות שליח למשך לילה בטמפרטורה של 3-4 °C לפני תחילת בדיקת הכימיקלים. באמצעות מערכת הבדיקה EPIDERM, יש להכין ולסטרilize את כל המכשירים והכלים המשמשים במדידה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. חלק מהחומרים, כגון מקלוני צמר גפן, צריכים להגיע באריזה סטרילית או לעבור עיקור באוטוקלייב.

יש להשתמש ב-70% ethanol לעיקור מכשירים כגון פינצטות, ובקרינת UV או גמא לעיקור בקבוקי השטיפה. שני תמיסות קריטיות המשמשות במסה הן DPBS שהוכן מראש ותמיסת 5% SDS. במים מזוקקים, ייעשה שימוש בכ-שני ליטרים של DPBS סטרילי ב-pH שבע במסה, כאשר ערכה אחת מכילה 24 רקמות epiderm.

DPBS סטרילי משמש כביקורת שלילית וכן כתמיסת שטיפה. יש להכין ולהשתמש ב-5% SDS כביקורת חיובית. בדיקת גירוי העור מתחילה עם קבלת ערכת ה-EPIDERM EPI 200 SIT.

יש לוודא את תקינות כל רכיבי הערכה וליצור קשר מיידי עם חברת Mat Tech בכל מקרה של חשש; אם הכל תקין, יש להמשיך לשלב הבא. כדי להתחיל את הבדיקה, יש להביא את מדיום הבדיקה המסופק בערכה לטמפרטורת החדר. אין לחמם מראש בתוך מנדף הזרימה הלמינרית.

הכינו פלטה סטרילית בעלת שישה בארות עבור כל שלושה תלתים (inserts) של רקמת אפידרמיס, וטפטפו 0.9 milliliters של מדיום הבדיקה לכל בארה תחת תנאי סטריליות. פתחו את השקית הפלסטית המכילה את הפלטה בעלת 24 הבארות עם רקמות האפידרמיס תחת זרימת אוויר סטרילית. הסירו את הגזה הסטרילית והשתמשו בפינצטה סטרילית כדי להוציא בזהירות כל תלה המכיל את רקמת האפידרמיס.

הסיר שאריות של אגרוס שנדבקו לדפנות החיצוניות של המבנית על ידי ספיגה עדינה עם גזה סטרילית או נייר סינון. לאחר מכן, העבר את הרקמות לפלטת 24 בארות סטרילית וריקה בתוך חמש הדקות הבאות. בצע בדיקה חזותית של המבניות.

תעדו כל פגמים ברקמה ועודף לחות על פני השטח. אין להשתמש ברקמות פגומות או ברקמות המכוסות לחלוטין בנוזל.

סרטוני רקמה אופטימליים. על פני השטח להיות יבשים וללא התנתקויות, חלקים לא אחידים או עודפי נוזלים על פני השטח. לאחר מכן, בעזרת מקלון צמר סטרילי, ייבשו בזהירות את פני השטח של הרקמות.

נסו שלא לגעת ברקמה באופן ישיר. השפעות נימיות מספיקות כדי להסיר את הלחות מהפני השטח לאחר ייבושם. העבירו שלוש רקמות לשורה העליונה מתוך כל שש.

פלטת בארות מלאה מראש ב-0.9 milliliter של מדיום בדיקה. שחררו בועות אוויר שנלכדו מתחת לרכיבים המוחדרים (inserts). לאחר מכן, הכניסו את שש פלטות הבארות המכילות את הרכיבים המוחדרים לאינקובטור למשך שעה אחת.

דגירה מקדימה בטמפרטורה של 37 °C. בתום תקופת הדגירה המקדימה הראשונה, העבירו את התסבכים (inserts) מהבארים העליונות לבארים התחתונות של הפלטה בעלת שש הבארים. החזירו את הפלטות לאינקובטור להדגירה מקדימה למשך הלילה.

העבירו את יתרת תוצרי הבדיקה למקרר. לאחר דגירה מקדימה למשך לילה, ניתן להוסיף את הכימיקלים הנבדקים להכנסות רקמת האפידרמיס. לפני תחילת בדיקת החשיפה הכימית, יש להביא את כל המכשירים, התמיסות והכימיקלים הנבדקים לטמפרטורת החדר.

בתוך תא העבודה הסטרילי, נגב את כל בקבוקי החומרים שאינם סטריליים עם 70% ethanol לפני הצבתם בתוך התא. יש להניח בתוך התא ובטמפרטורת החדר גם את ה-DPBS הסטרילי לבקרת השלילה, את בקרת החיוביות, 5% SDS ומים מזוקקים. יש להקצות מבחנה גדולה עבור פסולת.

הכינו פלטה בעלת שישה בארות עבור כל כימיקל, על ידי מילוי השורה העליונה בלבד ב-0.9 milliliters של מדיום בדיקה לכל בארה. סמנו כל פלטה במספר הרקמה ובשם הכימיקל.

כחמש דקות לפני החשיפה המתוכננת לחומרים הכימיים, הוציאו מהאינקובטור את פלטות ה-6-בארים המכילות את הרקמות שעברו התנייה מוקדמת. לאחר מכן, בצעו הערכה חזותית של פני השטח של הרקמות.

הסירו כל לחות באמצעות מקלוני צמר sterile ואין ללחוץ על פני הרקמה. לסיום, סמנו את המכסים של פלטת שש הלולים עם הקודים או השמות של חומרי הבדיקה. אין לבחון יותר משישה כימיקלים, כולל ביקורות שליליות וחיוביות, כאשר כל אחת מהן מבוצעת בשלוש חזרות בריצה אחת של הבדיקה.

השתמשו בפרק זמן של דקה אחת ליישום כימיים ולשטיפה בעת טיפול בחומרי בדיקה ידועים. פעלו לפי ההנחיות המופיעות בגיליון בטיחות החומרים (MSDS) עבור דגימות מקודדות או לא ידועות. הישמרו את הנחיות הבטיחות הכימית והשתמשו בארון פטורים.

יש להרכיב כפפות ולהגן על העיניים והפנים. יש להטbil את הרקמות בחומרים הכימיים במרווחי זמן של דקה אחת כדי להקל על שטיפת החומרים הנבדקים לאחר החשיפה; יש להשאיר את הפלטות עם הרקמות המטבלות במנדף הלמינרי עד להטבלת הרקמה האחרונה. במהלך הפרוצדורה יש להשתמש בפיפט עם קצה בולב למניפולציה של הרקמה והתרכובות הנבדקות. ניתן להשתמש בלהבה של מבער בונסן כדי ליצור את הקצה בצורת בולב עבור חומרים כימיים נוזליים.

טפטפו 30 µL של חומר הבדיקה הנוזלי ישירות על הרקמה והפעילו מיד את הטיימר לספירה עולה. הניחו את רשת הניילון על פני הרקמה. כאשר הטיימר יגיע לדקה אחת, הוסיפו את התרכובת הנוזלית השנייה. השתמשו בשלוש רקמות עבור כל כימיקל לבדיקה, וזכרו להוסיף כל תרכובת במרווחי זמן של דקה אחת.

לבדיקת חומרים חצי-מוצקים, השתמשו בפיפטה בעת דחיקה חיובית כדי להטיל 30 µL ישירות על הרקמה. במידת הצורך, פזרו את החומר הכימי באמצעות פיפטה של פסטור כדי להתאימו לגודל הרקמה. זמן קצר לפני יישום החומר המוצק, הרטיבו את פני השטח של הרקמה עם 25 µL של DPBS סטרילי כדי לשפר את המגע של פני השטח של הרקמה עם החומר הכימי הנבדק; מלאו כף יישום חדה של 25 mg בחומר הבדיקה הטחון דק.

יש להניח את הכימיקל המוצק לבדיקה על פני השטח של הרקמה. במידת הצורך, השתמשו בנבולה סטרילית המותקנת על הפטה כדי לרוקן את הכף לחלוטין. נערו בעדינות את המבליטים (inserts) כדי לשפר את פיזור החומר המוצק על פני השטח.

ניתן להשתמש גם בקצה העגול של הפפט כדי להתאים לגודל הרקמה. אין ללחוץ על פני השטח של הרקמה. לבסוף, יש להחשיב DPBS כביקורת שלילית ו-5% SDS כביקורת חיובית ולהחיל אותם על התבניות של הרקמה, גם הם בשלוש חזרות; לאחר מינון הרקמה האחרונה, העבירו את כל הפלטות למשך 35 פלוס או מינוס דקה אחת לאינקובטור לח עם טמפרטורה של 37 degrees Celsius.

במהלך דגירה זו, ודאו שכל החומרים הדרושים לשלבי השטיפה נמצאים במCב. לאחר דגירה של 35 דקות, הוציאו את כל הפלטות מהמדגרה. העבירו אותן למב sterile והמתינו 60 דקות עד להשלמת החשיפה הכימית עבור רקמת המינון הראשון.

בשלב הבא, התחילו בהליך השטיפה. שטפו את הרקמות עם DPBS סטרילי 15 פעמים. כדי להסיר שאריות של חומר הבדיקה, מלאו את תבנית הרקמה באמצעות זרם רציף של DPBS המוגש במרחק של 1.5 סנטימטרים מפני השטח של הרקמה, ולאחר מכן רוקנו אותה.

ודאו שזרם ה-DPBS אינו חלש מדי, אחרת חומר הבדיקה לא יוסר. זכרו לשמור על מרווח זמן של דקה אחת עבור שטיפה של ארבעה רקמות עם רשת ניילון חמש פעמים, ולהסיר את הרשת בזהירות באמצעות פינצטה מחודדת. לאחר מכן המשיכו ב-10 השטיפות הנותרות; לאחר השטיפה ה-15, שטפו בעזרת בקבוק שטיפה כאשר המבנית טבולה לחלוטין שלוש פעמים ב-150 milliliters של DPBS ונערו כדי להסיר את שאריות חומר הבדיקה.

לבסוף, שטפו את הרקמה. הכניסו נוזל DPBS סטרילי פעם אחת מהחלק הפנימי ופעם אחת מהחלק החיצוני. הסירו שאריות DPBS מהרקמה על ידי ניעור עדין של המבנית וספיגה באמצעות נייר ספיגה סטרילי.

בשלב הבא, העבירו את תבניות הרקמה שסננו לתוך פלטת שש תאים חדשה, שהמולאו מראש במצע בדיקה. שוב, זכרו כי יש לבצע את כל השלבים הללו בתוך מרווח של דקה אחת, כדי לשמור על זמן חשיפה של 60 דקות עבור כל דגימה שנחשפה. לאחר שטיפת הרקמה האחרונה, ייבשו בזהירות את פני השטח של כל רקמה באמצעות מקלון סטרילי.

אם עדיין קיימים עקבות של החומר הכימי על פני השטח, נסו להסיר אותם באמצעות מקלון צמר סטרילי לח. לבסוף, הדגירו את הרקמות באינקובטור למשך 24 השעות הבאות. רשמו את שעת תחילת ההדגירה בגיליון תיעוד השיטות.

יש לתעד בנוסף את כל היישומים השונים בגיליון תיעוד השיטה. נספח לפרוטוקול העבודה הסטנדרטי (SOP) המסופק על ידי Mat Tech Corporation להעברת הפלטות בתוך המבתור. העבירו את התבנית לחלק התחתון של פלטת שש הבארים הממולאת מראש ב-0.9 milliliter של מצע גידול.

אסוף את המצע מהשורה העליונה והעבר אותו לתוך פלטת 24 בארות המסומנת מראש, ואז מקם אותה בטמפרטורה של -20 °C. עד לביצוע האנליזה, ניתוח של ציטוקינים ו/או כימוקינים שהשתחררו למצע התרבית הוא שלב רשות. המשך את האינקובציה למשך 18 ± 3 שעות נוספות; עבור בדיקת MTT, סמן שתי פלטות של 24 בארות עם השמות הכימיים או הקודים.

זכרו כי MTT הוא רעיל, לכן הקפידו להשתמש בכפפות מגן בעת העבודה איתו. הכינו את תמיסת ה-MTT על ידי הפשרה של תרכיז ה-MTT ודילולו באמצעות המדלל של ה-MTT.

יש להגן מהאור כיוון ש-MTT רגיש לאור ולהשתמש בו תוך שעתיים עד שלוש שעות. מכיוון ש-MTT מתפרק עם הזמן, העבירו בפיפטה 300 µL של תמיסת MTT לכל באר בלוחית בעלת 24 באערים. כעת הוציאו את לוחות שש הבאערים מהאינקובטור.

ייבשו את תחתית ההכנסות (inserts) בעזרת נייר סופג והעבירו אותן לפלטת 24 בארות שמולאה מראש ב-MTT. הניחו את פלטת 24 הבארות באינקובטור והדגירו למשך שלוש שעות. אין לשכוח לרשום את זמן תחילת הדגירת ה-MTT ב-MDS; יש להקפיד באופן קפדני על זמן דגירה של שלוש שעות כדי למנוע קבלת קריאות MTT שונות. עם סיום דגירת ה-MTT, השתמשו במשאבת שאיבה עם מלכודת לפסולת רעילה כדי לשאוב בעדינות את מצע ה-MTT מכל הבארות.

מלאו שוב את הבארות ב-DPBS ושאבו את הנוזל. חזרו על שטיפה זו פעמיים נוספות וודאו שהרקמות יבשות לאחר השאיבה האחרונה. לאחר השטיפות, העבירו את ההכנסות (inserts) לפלטת 24 בארות חדשה והטבילו אותן על ידי הזרקה עדינה של 2 mL מתמיסת המיצוי לתוך כל הכנסה.

הסגול יעלה מעל השוליים העליונים של המבחנה המותאםת (insert), ובכך יכסה לחלוטין את הרקמות משני הצדדים. אטמו את פלטת 24 הבארים באמצעות סגור תרמי או פאראפילם כדי למנוע דליפה של התמצית ואידוי. רשמו את זמן תחילת המיצוי בגיליון תיעוד השיטות ובצעו מיצוי למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין על פלטת ניעור. לאחר סיום תקופת המיצוי, נקבו את המבחנות המותאמות באמצעות מחט הזרקה או פיפטה בעלת קצה מעוגל, ואפשרו לתמצית לזרום אל הבאר ממנה נלקחה המבחנה המותאמת.

השליכו את המקלטים הננקבים ושאבו את התמיסה בבאר למעלה ולמטה שלוש פעמים עד להומוגניות. ניתן להשתמש גם במנער פלטות המוגדר ל-120 RPMs עבור כל רקמה. העבירו שתי מנות של 200 µL של התמיסה הכחולה לפלטת מיקרו-טיטר בעלת 96 בארות עם תחתית שטוחה.

העבירו את הדגימות הכפולות בהתאם לתכנון הלוחית הקבוע המופיע בגיליון הנתונים הנלווה לפרוטוקול וידאו זה עבור הבלנקים. השתמשו ב-ISO propanol, מדדו את הצפיפות האופטית או ה-OD באמצעות ספקטרופוטומטר ללוחית 96 בארות באורך גל של 570 nanometers ללא שימוש במסנן ייחוס. הזינו את התוצאות לגיליון הנתונים לצורך חישוב אוטומטי של התוצאות.

יש לבצע תיקונים עקב הפרעה של הכימיקל הנבדק כפי שמתואר בפרוטוקול הנלווה, כאשר כימיקל נבדק מסומן כגורם גירוי. אם אחוז חיוניות הרקמה הוא 50% או פחות לאחר ניתוח ספקטרופוטומטרי, ה-OD 570 של רקמות ה-NC הוא הגבוה או שווה ל-1 והנמוך או שווה ל-2.5. והחיוניות הממוצעת של רקמות ה-PC, המבוטאת כאחוז מרקמות הביקורת השלילית, היא פחות מ-20% וסטיית התקן (SD) שחושבה משיעורי חיוניות הרקמה האינדיבידואליים של שלושה חזרות שטופלו באופן זהה היא פחות מ-18%. תרכובות המניבות ערכי חיוניות תאים של פחות מ-50% יכולות להיחשב כגורמי גירוי.

הרגע הדגמנו כיצד לבצע את בדיקת גירוי העור המהומקת למשך 60 דקות ו-42 שעות באמצעות מודל עור אנושי משוחזר, Epiderm. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שחלקו העיקרי של הניסוי מבוצע תחת תנאים סטריליים או אספטיים. אם קיים צורך בשינוי כלשהו בשיטה או אם נדרש הסבר מפורט יותר על אחד משלבי ההליך, אנא אל תהססו ליצור איתנו קשר לקבלת עזרה וייעוץ.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.