Name: פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: למד פרוטוקול FISH לניתוח זרע אנושי לאבחון אנאפלואידיות בזכרים עקרים. השיטה מאפשרת זיהוי הפרעות כרומוזומליות ומסייעת בהערכת סיכוני רבייה גנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Generalitat דה קטלוניה (2005-SGR00437). המחברים מודים ל י פ ו בלאנקו וידאל לפיקוח שלהם עידוד, ג&#39;לוקאס לקבלת סיוע טכני שלו.

I. עיבוד המדגם קיבוע התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את מדגם הזרע במכלים סטריליים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עד עיבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות ספין אותו 1000g במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות וזורקים supernatant באמצעות פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון hypotonic (KCl, 0.075M) מחומם מראש על 37 ° C, טיפה אחר טיפה, תוך כדי ערבוב על מערבולת לקבל נפח סופי של 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור באמבטיה המים 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1000g במשך 5 דקות. בזהירות להתעלמות supernatant ידי יציקה, מבלי להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר resuspending גלולה, להוסיף המוכן טרי (מתנול 03:01: חומצה אצטית) מקבע של Carnoy טיפה אחר טיפה תוך כדי ערבוב על מערבולת לקבל נפח הסופי של 8 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור נקודות 6 ו -7 פעמים רבות ככל הדרוש כדי להשיג גלולה לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מתנול מוכן טרי: חומצה אצטית (03:01) טיפה אחר טיפה כדי לכוונן את עוצמת הריכוז הסופי הסלולר הנדרש לקבלת תא טובה מתפשטת (באותם מקרים עם כדורית קטנה, כמה טיפות יספיקו ואילו דגימות עם כמות גבוהה הזרע התאוששה, הנפח הסופי יכול להגיע 1-2 מ&quot;ל). שקופית הבדיקה יכולה להתבצע על ידי הטלת המדגם resuspended לשקופית משומנת ובוחן אותו תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. זה יאפשר לבדוק את פיזור הסלולר שהושג יאפשר תיקון זה, אם יש צורך, על שקופיות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את הרחבות, ירידה מגובה מינימלי של 40 ס&quot;מ שתיים או שלוש טיפות של השעיה תא למרכז שקופיות unfrosted (מאוחסן בעבר ב -20 מעלות צלזיוס מתנול כדי degrease אותם). כדי לאפשר את מיקומו של המדגם לאורך הפרוטוקול, לסמן את האזור המכיל את הזרע הרחבה בצד השני של השקופית באמצעות עיפרון היהלומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השקופיות ב -20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. הערה: תוספת של מתנול: חומצה אצטית (03:01) טיפה אחר טיפה תוך כדי ערבוב היא צעד חשוב מאוד כדי למנוע היווצרות של אגרגטים הזרע. </li></ol> השנייה. Decondensation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופיות המאוחסן -20 ° C חייב להיות מופשר להמשיך עם פרוטוקול (להשאיר אותם בטמפרטורת החדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופית בשתי צנצנות coplin רצופים עם תמיסת מלח נתרן 2x ציטרט (2xSSC) למשך 3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השקופית באמצעות סדרה של אתנול שוטף למשך 2 דקות בתוך צנצנת כל coplin. התחל עם 70% אתנול, פעל על ידי 90% ולסיים עם 100%. לייבש את השקופית להשאיר אותו בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופית בתמיסה dithiothreitol (1,4-dithiothreitol 5mm, טריטון 1% X-100, 2-אמינו-2 (hydroxymethyl) -1,3-propanediol 50mm) בשעה 37 ° C בחממה כדי decondense הכרומטין. מוצר זה פועל על ידי שבירת גשרים דיסולפיד של protamines כי סליל ה-DNA בגרעין תא הזרע. זהו צעד חשוב מאוד כי ה-DNA בגרעין הזרע נדחס מאוד. זמן הדגירה של שקופיות פתרון dithiothreitol (DTT) חייב להיות מותאם על פי התגובה של מדגם למוצר זה. בדרך כלל, הפעם הוא סביב 8 דקות, למרות שזה יכול להשתנות 2-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את השקופית שתי צנצנות ברציפות coplin עם 2xSSC במשך 3 דקות coplin כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך על ידי הצבת את השקופית באמצעות סדרה של אתנול שוטף למשך 2 דקות בתוך צנצנת כל coplin (70%, 90% ו 100% אתנול). תנו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר. הערה: חשיפת יתר DTT תביא לפיזור אותות FISH בסוף ההליך, ואילו חשיפה קצר מדי יגרום לחוסר אותות מסוימים. </li></ol> ג. הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל את ה-DNA של הזרע דוגרים השקופית בצנצנת coplin עם פתרון לפוראמיד (70% Formamide/2xSSC) בשעה 73 ° C במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השקופית באמצעות פתרונות אתנול דקה 1 לכל coplin קנקן (להתחיל עם אתנול 70%, 85% ולסיים עם 100%). השאירו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ישיר l של 5 המקביל מוכן לשימוש תערובת בדיקה לחמוק כיסוי 15x15 (Assay AneuVysion Multi-Probe צבע פאנל: CEP 18/X/Y או LSI 13/21). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שזה מוצג הוידאו, בזהירות במקום להחליק על פתק את המכסה כדי להרכיב את אזור היעד את התערובת בדיקה. חותם זה במלט גומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופית לתוך טרום חימם 37 ° C קאמרית הכלאה (HYBrite ™) ו דגירה אותו 37 מעלות צלזיוס למשך 6-24 שעות. הערה: בעוד denaturation המדגם הזרע היא חובה, את הצורך denaturing בדיקות נקבע על ידי היצרן. תערובות בדיקה השתמשו בפרוטוקול הזה מוכנים לשימוש, במקרה זה, denaturation בדיקה אינה נדרשת. נפח התערובת בדיקה ישתנה בהתאם לגודל האזור הכלאה. </li></ol> IV. רוחצתלאחר הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את השקופית מהאולם הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המלט גומי בזהירות לשלוף את הפתק מכסה מחליק בעדינות הצידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע את האותות הכלאה נוקבים במקום להחליק במשך 2 דקות בתוך צנצנת עם coplin% 0.4xSSC/0.3 NP-40 מראש התחמם ב 73 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות פתרון NP-40 לשטוף 2xSSC/0.1% בטמפרטורת החדר למשך דקה 1. תנו את השקופית להתייבש בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מוצר counterstaining לאזור היעד (8 l עבור להחליק לכסות 18x18). המוצר הנפוץ ביותר הוא 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שזה מוצג הוידאו, לכסות את אזור הכלאה עם תלוש כיסוי (כדי לשמר את ההכלאה להחליק לכסות יכול להיות חתום עם לכה מסמר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות שקופיות הכלאה ב -20 ° C בחושך עד ניתוח הסיכוי שלהם. בתנאים אלה השקופיות ניתן לאחסן עד 12 חודשים ללא משמעותי לאיבוד עוצמת האות פלואורסצנטי. הערה: הטמפרטורה גבוהה או זמן לשטוף מופרז עלול לגרום לחיסול של אותות מסוימים, ואילו השני לא היה לשטוף את הכלאות בדיקה נוקבים. היקף המוצר counterstaining הוסיף ישתנה בהתאם לגודל האזור הכלאה לכסות. </li></ol> V. ויזואליזציה ההכנות ניתן להעריך תחת מיקרוסקופ epifluorescence מצויד במסנן הלהקה משולשת עבור DAPI / טקסס אדום / FITC ו יחיד הלהקה מסננים עבור אקווה, FITC וטקסס האדום. קריטריונים להערכה סטנדרטית חייב להיות במעקב במשך הערכה נכונה של גרעיני זרע 1. הכנת הכלאה עם בדיקות של כרומוזומי X, Y ו 18 צריכים להציג אותות עבור שלושת הכרומוזומים. כל זרע נורמלית חייב להראות איתות כחול (המקביל ל כרומוזום 18), ואת אות ירוק (X נושאות זרע) או איתות אדום (Y נושאות זרע). בהכנת הכלאה עם בדיקות של כרומוזומים 13 ו - 21, אות ירוק כרומוזום 13 ו סימן אדום על כרומוזום 21 יש להבחין בכל זרע נורמלית.

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך דגימות זרע אנושי להשגת FISH ההכנות הזרע. באמצעות פרוטוקול זה ניתן לנתח פגמים בכרומוזומים של גמטות זכריות. ההקרנה זרע aneuploidy יש יישומים גם בהקשר של מחקר בסיסי בייעוץ הרבייה שניתנה זכרים עקרים. למרות האבחנה הקלינית הכרומוזומים ביותר למד נרחב הן X, Y, 13, 18 ו 21, בדיקות מסחריים אחרים עבור מגוון רחב של הכרומוזומים לוקוסים זמינים יכול לשמש גם בניסויים אלו.

<table><tbody><tr><td>1,4-דיתיותריטול (DTT)</td><td>חומרים</td><td>קבוצת Roche</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol</td><td>חומרים</td><td>קבוצת Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>חומרים</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; ערכה של גששים רב-צבעיים ל-DNA&lt;ul style=&quot;padding:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;20x Saline-Sodium Citrate&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;גשש DNA מסוג CEP 18/X/Y&lt;/li&gt;&lt;li&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;li&gt;גשש DNA מסוג LSI 13/21&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>חומרים</td><td>Vysis Inc.</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;ריפוד: 2 פיקסלים;&quot;&gt;&lt;li&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5804R</td><td>כלי</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנה לצנטריפוגה</td><td>חומרים</td><td>Nalge Nunc international</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת קופלין (זכוכית)</td><td>חומרים</td><td>Barloworld Scientific</td><td>Hellendahl (ZCT278)</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת קופלין (פלסטיק)</td><td>חומרים</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>זכוכיות כיסוי (15x15)</td><td>חומרים</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>כיסויות (18x18)</td><td>חומרים</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>עיפרון יהלום</td><td>חומרים</td><td>האמאכר (Hammacher)</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>חומרים</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>חומרים</td><td>קבוצת Roche</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>מקפיא</td><td>כלי</td><td>זנוסי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כפפות</td><td>חומרים</td><td>Sanyo</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>כלי</td><td>Vysis Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שמן אימרסיה</td><td>חומרים</td><td>Olympus Corporation</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td>כלי</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>חומרים</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה</td><td>חומרים</td><td>Labsystems</td><td>Finnpipette (4500000)</td><td></td></tr><tr><td>טיפ להחלפה למיקרופיפטה</td><td>חומרים</td><td>Daslab</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>לק לציפורניים</td><td>חומרים</td><td>Quo-cosmetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה Olympus BX60</td><td>כלי</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>מאובזר בפילטר רב-פסים (triple-band) עבור DAPI/Texas Red/FITC ובפילטרים של פס בודד (single-band) עבור Aqua, FITC ו-Texas Red.</td></tr><tr><td>פיפטת פסטור</td><td>חומרים</td><td>Rubilabor</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ בניגודיות פאזה</td><td>כלי</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטה מפלסטיק (3 מ"ל)</td><td>חומרים</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלוריד (KCl)</td><td>חומרים</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>דבק גומי</td><td>חומרים</td><td>בדיקה מיטבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכיות</td><td>חומרים</td><td>Knittel Glaser</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>קופסאות לשימור שליידונים</td><td>חומרים</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>מכל סטרילי</td><td>חומרים</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>מזרק</td><td>חומרים</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>מדחום</td><td>חומרים</td><td>Comark Instruments, Inc</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים שלוש פעמים</td><td>חומרים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>חומרים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>חומרים</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>זרימה למינרית אנכית &lt;em&gt;מבת זרימה למינארית&lt;/em&gt;</td><td>כלי</td><td>בורדינולה</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>מערבל וורטקס (Vortex mixer)</td><td>כלי</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>מקלחת מים</td><td>כלי</td><td>רייפה&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (fish) פרוטוקול של זרע אדם

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies הם פגמים בכרומוזומים השכיח ביותר בבני אדם. רוב הפרעות אלו נובעות שגיאות meiotic בתהליך gametogenic אצל ההורים. אצל גברים אנושיים, שגיאות אלה יכולים להוביל לייצור של זרע עם הפרעות כרומוזום מספריים המייצגים סיכון מוגבר להעברת אנומליות אלה לצאצאים. מסיבה זו, את הטכניקה של הקרינה הכלאה באתרו (FISH) על גרעין הזרע הפך פרוטוקול שולבו נרחב בהקשר של אבחנה קלינית. בפועל זה מספק אומדן של תדרים של הפרעות כרומוזום מספריים הגמטות של המטופלים המבקשים ייעוץ גנטי הרבייה. עד כה, את הכרומוזומים כללו לרוב בניתוח FISH הזרע הם כרומוזומי X, Y, 13, 18 ו - 21. זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, איך לעבד ולתקן דגימת זרע אנושי, איך decondense ו לפגל הכרומטין זרע, כיצד להמשיך לקבל ההכנות FISH הזרע, וכיצד לחזות את התוצאות במיקרוסקופ. הערות מיוחדות הצעדים המשמעותיים ביותר ניתנים על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר.

זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, כיצד תהליך דגימת זרע כדי להשיג באיכות טובה פלואורסצנטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה על בזרע אנושי. ההכנות שהושגו ניתן להשתמש להקרנה aneuploidy בהקשר של אבחנה קלינית.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

אנאuplודיות (Aneuploidies) הן ההפרעות הכרומוזומליות השכיחות ביותר בבני אדם. מרבית הפרעות אלו נובעות משגיאות במיוזה במהלך תהליך הגמטוגנזה...

פרוטוקול היברידיזציה פלואורסצנטית במקום (Fluorescence in situ hybridization) בגרעינים של תאי זרע אנושיים שולב באופן נרחב בתחום האבחון הקליני. אחד היישומים של מתודולוגיה זו הוא סריקת פלואידיות של תאי זרע. כחלק מהייעוץ להפריה הניתן לגברים בעקרות, שכיחותן של חריגות מספריות גבוהה יותר בקרב אנשים אלו מאשר באוכלוסייה הכללית, ולעתים קרובות הם מראים פרמטרים זרעיים חריגים.דבר זה מייצג סיכון מוגבר להעברת אנומליות אלו לכל צאצא. היום נדגים את פרוטוקול ההיברידיזציה של פלואורסצנציה במקום (fluorescence in situ hybridization) בגרעיני זרה דקונדנסים (decondensed) לצורך ניתוח של כרומוזומים 13, 18, 21, x ו-Y. לאחר איסוף הדגימה, יש להשאירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עד להתרחשות הפיכור (liquefaction). כדי להתחיל בפרוטוקול, יש להעביר את הדגימה למבחנה לצנטריפוגה.התמיסות שבהן נשתמש בחלק הראשון של הניסוי הן תמיסות היפרטוניות שחוממו מראש ל-37 °C ומתנול וחומצה אצטית ביחס של שלושה לאחד. אלו חייבות להיות מוכנות באופן טרי. לאחר מכן, הדגימה מוכנה לצנטריפוגציה ב-1000 ×g למשך חמש דקות.כעת, הסירו בעדינות את הנוזל העליון והוסיפו את התמיסה ההיפרטונית טיפה אחר טיפה, עד להגעה לנפח של כ-10 milliliters. מבחנה זו חייבת להישאר בטמפרטורה של 37 degrees C למשך 30 דקות, ולאחר מכן יש לסבב את הדגימה שוב בצנטריפוגה. הסבב בצנטריפוגה גורם לזרעי ה-spermatozoa להצטבר בתחתית המבחנה, מה שמאפשר לנו להחליף את התמיסה ההיפוטונית במתנול.יש לחזור על סבב הצנטריפוגציה עם חומצה אצטית ולהחליף את תמיסת המטנול-חומצה אצטית מספר הפעמים הדרוש עד לקבלת משקע לבן. כאשר הדבר קורה, יש להוסיף עוד מטנול-חומצה אצטית. יש להתאים את הנפח הסופי בהתאם לפיזור התאים הרצוי לשלבי ההמשך.השלב הסופי הוא הכנת הפריסות על ידי טפטוף של הדגימה המקובעת על עלויות Reed המאוחסנות במתנול בטמפרטורה של 20°C- . מומלץ לסמן את האזור בעלויות המכיל את פריסת הזרע לצורך מיקום חוזר בעתיד. ניתן לעשות זאת בקלות באמצעות עיפרון יהלום בצדו השני של העלויות. לאחר שאישור הפיזור התאי האופטימלי בוצע, יש לאחסן את העלויות בטמפרטורה של 20°C- למשך 24 שעות לפחות.לפני ההמשך בפרוטוקול. בחלק זה של הניסוי, נשתמש בתמיסת נתרק סיטראט מלוחה, בסדרת אתנול, ו-DRE fatal and fide. לאחר הפשרת השקופיות, יש לשטוף ולייבש את הדגימות המקובעות על ידי טבילה בשני צנבקי קופלן עוקבים המכילים 2x SSC.פעולה זו תיארך שלוש דקות עבור כל שלב במיסוץ. לאחר מכן, יש להטביל את השקופיות למשך שתי דקות בכל אחד מצנצני מיסוץ האתנול, לפי סדר ריכוז עולה. בשלב זה, כדי להמשיך לשלבים הבאים, יש לייבש את השקופיות.בשל העובדה שה-DNA בגרעין תאי הזרע דחוס מאוד, יש צורך לפתוח את הכרומטין (דקונדנסציה) לפני דנטורציה שלו. ניתן לבצע זאת באמצעות תמיסת DTT בטמפרטורה של 37 °C. זהו חומר הפועל על ידי שבירת גשרי הגופרית של הפרוטמינים המגלגלים את ה-DNA בגרעין תאי הזרע. יש להתאים את זמן דגירת השקופית ב-DTT בהתאם לתגובתיות של דגימת הזרע לחומר זה.בדרך כלל מדובר בכשמונה דקות, אם כי הזמן עשוי להשתנות בין 2 ל-15 דקות. לאחר מכן, יש להעביר מיד את השקופיות ל-2x SSC למשך שלוש דקות, ושוב למשך שלוש דקות נוספות, ולאחר מכן למשך שתי דקות בכל אחת מצנכנות ה-ethanol coplan. עבור ההיברידיזציה של הגשש, חיוני לעבוד עם גדילי DNA בודדים. הדבר דורש שלב דנטורציה לפני הוספת הגששים, הכולל תקופת אינקובציה של חמש דקות בתמיסת formamide בטמפרטורה של 73 °C. לסיום הטיפול בשקופיות, נדרשת העברה סופית לתמיסת ethanol, תוך טבילה של השקופיות למשך דקה אחת בכל צנכנת coplan.השקופיות מוכנות כעת להיברידציה במסגרת בדיקות ה-FISH המבוצעות לצורך אבחון קליני. הכרומוזומים המנותחים שכיח ביותר הם כרומוזומי המין והכרומוזומים 13, 18 ו-21. לצורך ניתוח כרומוזומים אלו, נשתמש בערכה של גשמי DNA רב-צבעים מבית vices.ערכה זו מכילה מבחנה אחת עם שילוב פרובים לאזור הלוויין אלפא (alpha satellite) של כרומוזומים X, Y ו-18, המסומנים בירוק ובאקווה בהתאמה, ומבחנה נוספת עם שילוב פרובים לכרומוזומים 13 ו-21, המסומנים בירוק ובכתום בהתאמה. הנפח של תערובת הפרובים שתוסף ישתנה בהתאם לגודל השטח שברצונכם להכליא; כנקודת ייחוס עבור זכוכית כיסוי של 15 על 15, נפח של 5 µL הוא מספיק.שתי תערובות הגששים עוברות דנטורציה מוקדמת בבופר היברידיזציה לנוחות השימוש, כך שניתן להוסיף אותן ישירות לשקופיות שעברו דה-ווקסינג, עיבוי ודנטורציה. קיימים גם גששים מסחריים אחרים למגוון רחב של כרומוזומים ו-Loci שניתן להשתמש בהם בניסויים אלו. עם זאת, בדרך כלל גששים אלו דורשים טיפול דנטורציה מוקדם לפני הוספת התערובת לדגימת המטרה.במצבים אלה, די להישמע להוראות היצרן. יש לכסות את האזור המיועד באמצעות זריקת כיסוי ולאטום אותו בעזרת דבק גומי. לאחר מכן, הזריקות מוכנות להכנסה לתא ההכלאה (hybridization chamber), שחומם מראש ל-37 °C, ולהדגרה בטמפרטורה זו למשך שש עד 24 שעות.בחלק האחרון של הפרוטוקול, נשתמש בשני תמיסות שטיפה המורכבות מריכוזים שונים של תמיסת נתרן ציטראט מלוחית ומהדטרגנט NP 40. לאחר זמן האינקובציה, ניתן להוציא את השקופיות מתא ההיברידיזציה כדי להסיר את דבק הגומי. לאחר מכן, הסירו בזהירות את כיסוי השקופית.כפי שמוצג, השקופיות מושרות למשך שתי דקות בתמיסת השטיפה הראשונה, שחוממה מראש ל-73 °C. לאחר מכן הן מועברות לתמיסת השטיפה השנייה בטמפרטורת החדר לדקה נוספת. שני שטיפות אלה יעזרו לנו להסיר אותות היברידיזציה שאינם ספציפיים. לאחר שתי שטיפות אלו, עלינו להמתין לייבוש השקופיות כדי להשלים את השלב האחרון של הפרוטוקול.בשלב זה, מוסיפים מוצר לצביעה נגדית כדי להקל על הדמיית גרעין התאים. אחד המוצרים הנפוצים ביותר המשמשים למטרה זו הוא dpi. יש להתאים את הנפח המוסף לגודל האזור שעבר היברידיזציה, כאשר נקודת הייחוס היא זכוכית כיסוי של 18 על 18.נפח של 8 µL של DPI הוא מספיק. ניתן לאטום את זכוכית המכסה באמצעות לק לציפורניים, וכעת הדגימות מוכנות להדמיה. לחלופין, ניתן לאחסן אותן בטמפרטורה של 20°C- עד למועד ניתוחן.המיקרוסקופ שבו נשתמש לצורך הוויזואליזציה הוא Olympus BX 60 epi fluorescent המצויד במסנן רב-פסים (triple band filter) עבור dpi, Texas Red ו-FITC, ובמסנני פס בודד (single band filters) עבור aqua, FITC ו-Texas Red. באמצעות מסנן הרב-פסים, הדגימה שהגבירה עם x, Y ו-18 תציג אותות עבור שלושת הכרומוזומים הללו. בשימוש במסנן הפס הבודד עבור aqua, נוכל לראות רק אותות פלואורסצנטיים עבור כרומוזום 18. עלינו לצפות לאות אחד מאלה בכל תאי זרע תקין.עם זאת, כאשר משתמשים במסנן פס בודד עבור FITC בלבד, חלק מהזרעונים מראים אות פלואורסצנטי ירוק המתאים לכרומוזום X. הזרעונים שחסר בהם האות הירוק אמורים להפגין אות אדום עבור כרומוזום Y, שניתן להדמיאן באופן ספציפי באמצעות המסנן עבור Texas red. הדמיית ההיברידיזציה של 1321 באמצעות מסנן פס משולש מאפשרת לנו להבחין באותות עבור שני כרומוזומים אלו.האות הירוק תואם לכרומוזום 13 וניתן להדמי שלו באופן ספציפי באמצעות מסנן פס בודד עבור FITC. מסנן הפס הבודד עבור Texas Red מאפשר לנו להדמי באופן ספציפי את האותים עבור כרומוזום 21. כל תאי זרע תקינים צריכים להציג אות אחד עבור כל אחד משני הגששים הללו.לסיכום, אלו הם השלבים העיקריים של הפרוטוקול. שוב, יש לבצע את תהליך הקיבוע במדויק כדי לקבל שלוחות באיכות טובה, תוך הוספה של חומצה אצטית בשיטת טיפה אחר טיפה. כדי למנוע היווצרות של אגרגטים של תאי זרע בתהליך הדקונדנסציה, יש להתאים את זמן האינקובציה בתמיסת DTT בהתאם לרגישות דגימת הזרע למוצר זה.חשיפה מרובה מדי של תאי הזרע ל-DTT תביא לאותים מפוזרים בסוף הפרוטוקול, בעוד שחשיפה לא מספקת תגרום להיעדר היברידיזציה של הגשש ולמחסור בחלק מהאותים. בעוד שהדנטורציה של דגימת הזרע היא הכרחית, יש להתאים את דנטורציית הגשש להנחיות היצרן. חשוב לשמור על בקרה קפדנית על הזמן והטמפרטורה של שני השטיפות שלאחר ההיברידיזציה.טמפרטורה גבוהה יותר או זמן שטיפה ממושך מדי עלולים להוביל להיעלמות של חלק מהאותות, בעוד שהפכים לא יסכינו אותות לא ספציפיים. לבסוף, השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי (epi fluorescent microscope) המצויד במסננים ספציפיים מתאימים הוא חיוני לוויזואליזציה טובה ולפרשנות של האותות. וזהו.תודה שצפיתם בה, ובהצלחה בניסוייכם.

fluorescence-in-situ-hybridization-fish-protocol-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

מאמר זה מתאר את הבחירה של בדיקות מתאים FISH מתא בודד, טכניקות הפצת עבור גרעינים blastomere, וב הכלאה באתרו ניקוד האות, להחיל אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) בסביבה קלינית.

FISH לאבחון גנטי טרום השרשה

בין השלושה סוגי היתושים,...

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחים (דגי 3D החיסוני DNA) 3D.

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

בהתחשב באנטומיה הפשוטה שלהם, אשכי אנופלס מציעים מודל ציטולוגי טוב לחקר זרע. פרוטוקול זה מתאר הכלאה פלואורסצנטית באתרה , טכניקה המשמשת לחקר תהליך ביולוגי זה, כמו גם את הפנוטיפ של זנים טרנסגניים בעלי מוטציות בגנים המעורבים בייצור זרע.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

למד פרוטוקול FISH לניתוח זרע אנושי לאבחון אנאפלואידיות בזכרים עקרים. השיטה מאפשרת זיהוי הפרעות כרומוזומליות ומסייעת בהערכת סיכוני רבייה גנטיים.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

גלה סרטונים נוספים