פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

פרוטוקול היברידיזציה פלואורסצנטית במקום (Fluorescence in situ hybridization) בגרעינים של תאי זרע אנושיים שולב באופן נרחב בתחום האבחון הקליני. אחד היישומים של מתודולוגיה זו הוא סריקת פלואידיות של תאי זרע. כחלק מהייעוץ להפריה הניתן לגברים בעקרות, שכיחותן של חריגות מספריות גבוהה יותר בקרב אנשים אלו מאשר באוכלוסייה הכללית, ולעתים קרובות הם מראים פרמטרים זרעיים חריגים.

דבר זה מייצג סיכון מוגבר להעברת אנומליות אלו לכל צאצא. היום נדגים את פרוטוקול ההיברידיזציה של פלואורסצנציה במקום (fluorescence in situ hybridization) בגרעיני זרה דקונדנסים (decondensed) לצורך ניתוח של כרומוזומים 13, 18, 21, x ו-Y. לאחר איסוף הדגימה, יש להשאירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עד להתרחשות הפיכור (liquefaction). כדי להתחיל בפרוטוקול, יש להעביר את הדגימה למבחנה לצנטריפוגה.

התמיסות שבהן נשתמש בחלק הראשון של הניסוי הן תמיסות היפרטוניות שחוממו מראש ל-37 °C ומתנול וחומצה אצטית ביחס של שלושה לאחד. אלו חייבות להיות מוכנות באופן טרי. לאחר מכן, הדגימה מוכנה לצנטריפוגציה ב-1000 ×g למשך חמש דקות.

כעת, הסירו בעדינות את הנוזל העליון והוסיפו את התמיסה ההיפרטונית טיפה אחר טיפה, עד להגעה לנפח של כ-10 milliliters. מבחנה זו חייבת להישאר בטמפרטורה של 37 degrees C למשך 30 דקות, ולאחר מכן יש לסבב את הדגימה שוב בצנטריפוגה. הסבב בצנטריפוגה גורם לזרעי ה-spermatozoa להצטבר בתחתית המבחנה, מה שמאפשר לנו להחליף את התמיסה ההיפוטונית במתנול.

יש לחזור על סבב הצנטריפוגציה עם חומצה אצטית ולהחליף את תמיסת המטנול-חומצה אצטית מספר הפעמים הדרוש עד לקבלת משקע לבן. כאשר הדבר קורה, יש להוסיף עוד מטנול-חומצה אצטית. יש להתאים את הנפח הסופי בהתאם לפיזור התאים הרצוי לשלבי ההמשך.

השלב הסופי הוא הכנת הפריסות על ידי טפטוף של הדגימה המקובעת על עלויות Reed המאוחסנות במתנול בטמפרטורה של 20°C- . מומלץ לסמן את האזור בעלויות המכיל את פריסת הזרע לצורך מיקום חוזר בעתיד. ניתן לעשות זאת בקלות באמצעות עיפרון יהלום בצדו השני של העלויות. לאחר שאישור הפיזור התאי האופטימלי בוצע, יש לאחסן את העלויות בטמפרטורה של 20°C- למשך 24 שעות לפחות.

לפני ההמשך בפרוטוקול. בחלק זה של הניסוי, נשתמש בתמיסת נתרק סיטראט מלוחה, בסדרת אתנול, ו-DRE fatal and fide. לאחר הפשרת השקופיות, יש לשטוף ולייבש את הדגימות המקובעות על ידי טבילה בשני צנבקי קופלן עוקבים המכילים 2x SSC.

פעולה זו תיארך שלוש דקות עבור כל שלב במיסוץ. לאחר מכן, יש להטביל את השקופיות למשך שתי דקות בכל אחד מצנצני מיסוץ האתנול, לפי סדר ריכוז עולה. בשלב זה, כדי להמשיך לשלבים הבאים, יש לייבש את השקופיות.

בשל העובדה שה-DNA בגרעין תאי הזרע דחוס מאוד, יש צורך לפתוח את הכרומטין (דקונדנסציה) לפני דנטורציה שלו. ניתן לבצע זאת באמצעות תמיסת DTT בטמפרטורה של 37 °C. זהו חומר הפועל על ידי שבירת גשרי הגופרית של הפרוטמינים המגלגלים את ה-DNA בגרעין תאי הזרע. יש להתאים את זמן דגירת השקופית ב-DTT בהתאם לתגובתיות של דגימת הזרע לחומר זה.

בדרך כלל מדובר בכשמונה דקות, אם כי הזמן עשוי להשתנות בין 2 ל-15 דקות. לאחר מכן, יש להעביר מיד את השקופיות ל-2x SSC למשך שלוש דקות, ושוב למשך שלוש דקות נוספות, ולאחר מכן למשך שתי דקות בכל אחת מצנכנות ה-ethanol coplan. עבור ההיברידיזציה של הגשש, חיוני לעבוד עם גדילי DNA בודדים. הדבר דורש שלב דנטורציה לפני הוספת הגששים, הכולל תקופת אינקובציה של חמש דקות בתמיסת formamide בטמפרטורה של 73 °C. לסיום הטיפול בשקופיות, נדרשת העברה סופית לתמיסת ethanol, תוך טבילה של השקופיות למשך דקה אחת בכל צנכנת coplan.

השקופיות מוכנות כעת להיברידציה במסגרת בדיקות ה-FISH המבוצעות לצורך אבחון קליני. הכרומוזומים המנותחים שכיח ביותר הם כרומוזומי המין והכרומוזומים 13, 18 ו-21. לצורך ניתוח כרומוזומים אלו, נשתמש בערכה של גשמי DNA רב-צבעים מבית vices.

ערכה זו מכילה מבחנה אחת עם שילוב פרובים לאזור הלוויין אלפא (alpha satellite) של כרומוזומים X, Y ו-18, המסומנים בירוק ובאקווה בהתאמה, ומבחנה נוספת עם שילוב פרובים לכרומוזומים 13 ו-21, המסומנים בירוק ובכתום בהתאמה. הנפח של תערובת הפרובים שתוסף ישתנה בהתאם לגודל השטח שברצונכם להכליא; כנקודת ייחוס עבור זכוכית כיסוי של 15 על 15, נפח של 5 µL הוא מספיק.

שתי תערובות הגששים עוברות דנטורציה מוקדמת בבופר היברידיזציה לנוחות השימוש, כך שניתן להוסיף אותן ישירות לשקופיות שעברו דה-ווקסינג, עיבוי ודנטורציה. קיימים גם גששים מסחריים אחרים למגוון רחב של כרומוזומים ו-Loci שניתן להשתמש בהם בניסויים אלו. עם זאת, בדרך כלל גששים אלו דורשים טיפול דנטורציה מוקדם לפני הוספת התערובת לדגימת המטרה.

במצבים אלה, די להישמע להוראות היצרן. יש לכסות את האזור המיועד באמצעות זריקת כיסוי ולאטום אותו בעזרת דבק גומי. לאחר מכן, הזריקות מוכנות להכנסה לתא ההכלאה (hybridization chamber), שחומם מראש ל-37 °C, ולהדגרה בטמפרטורה זו למשך שש עד 24 שעות.

בחלק האחרון של הפרוטוקול, נשתמש בשני תמיסות שטיפה המורכבות מריכוזים שונים של תמיסת נתרן ציטראט מלוחית ומהדטרגנט NP 40. לאחר זמן האינקובציה, ניתן להוציא את השקופיות מתא ההיברידיזציה כדי להסיר את דבק הגומי. לאחר מכן, הסירו בזהירות את כיסוי השקופית.

כפי שמוצג, השקופיות מושרות למשך שתי דקות בתמיסת השטיפה הראשונה, שחוממה מראש ל-73 °C. לאחר מכן הן מועברות לתמיסת השטיפה השנייה בטמפרטורת החדר לדקה נוספת. שני שטיפות אלה יעזרו לנו להסיר אותות היברידיזציה שאינם ספציפיים. לאחר שתי שטיפות אלו, עלינו להמתין לייבוש השקופיות כדי להשלים את השלב האחרון של הפרוטוקול.

בשלב זה, מוסיפים מוצר לצביעה נגדית כדי להקל על הדמיית גרעין התאים. אחד המוצרים הנפוצים ביותר המשמשים למטרה זו הוא dpi. יש להתאים את הנפח המוסף לגודל האזור שעבר היברידיזציה, כאשר נקודת הייחוס היא זכוכית כיסוי של 18 על 18.

נפח של 8 µL של DPI הוא מספיק. ניתן לאטום את זכוכית המכסה באמצעות לק לציפורניים, וכעת הדגימות מוכנות להדמיה. לחלופין, ניתן לאחסן אותן בטמפרטורה של 20°C- עד למועד ניתוחן.

המיקרוסקופ שבו נשתמש לצורך הוויזואליזציה הוא Olympus BX 60 epi fluorescent המצויד במסנן רב-פסים (triple band filter) עבור dpi, Texas Red ו-FITC, ובמסנני פס בודד (single band filters) עבור aqua, FITC ו-Texas Red. באמצעות מסנן הרב-פסים, הדגימה שהגבירה עם x, Y ו-18 תציג אותות עבור שלושת הכרומוזומים הללו. בשימוש במסנן הפס הבודד עבור aqua, נוכל לראות רק אותות פלואורסצנטיים עבור כרומוזום 18. עלינו לצפות לאות אחד מאלה בכל תאי זרע תקין.

עם זאת, כאשר משתמשים במסנן פס בודד עבור FITC בלבד, חלק מהזרעונים מראים אות פלואורסצנטי ירוק המתאים לכרומוזום X. הזרעונים שחסר בהם האות הירוק אמורים להפגין אות אדום עבור כרומוזום Y, שניתן להדמיאן באופן ספציפי באמצעות המסנן עבור Texas red. הדמיית ההיברידיזציה של 1321 באמצעות מסנן פס משולש מאפשרת לנו להבחין באותות עבור שני כרומוזומים אלו.

האות הירוק תואם לכרומוזום 13 וניתן להדמי שלו באופן ספציפי באמצעות מסנן פס בודד עבור FITC. מסנן הפס הבודד עבור Texas Red מאפשר לנו להדמי באופן ספציפי את האותים עבור כרומוזום 21. כל תאי זרע תקינים צריכים להציג אות אחד עבור כל אחד משני הגששים הללו.

לסיכום, אלו הם השלבים העיקריים של הפרוטוקול. שוב, יש לבצע את תהליך הקיבוע במדויק כדי לקבל שלוחות באיכות טובה, תוך הוספה של חומצה אצטית בשיטת טיפה אחר טיפה. כדי למנוע היווצרות של אגרגטים של תאי זרע בתהליך הדקונדנסציה, יש להתאים את זמן האינקובציה בתמיסת DTT בהתאם לרגישות דגימת הזרע למוצר זה.

חשיפה מרובה מדי של תאי הזרע ל-DTT תביא לאותים מפוזרים בסוף הפרוטוקול, בעוד שחשיפה לא מספקת תגרום להיעדר היברידיזציה של הגשש ולמחסור בחלק מהאותים. בעוד שהדנטורציה של דגימת הזרע היא הכרחית, יש להתאים את דנטורציית הגשש להנחיות היצרן. חשוב לשמור על בקרה קפדנית על הזמן והטמפרטורה של שני השטיפות שלאחר ההיברידיזציה.

טמפרטורה גבוהה יותר או זמן שטיפה ממושך מדי עלולים להוביל להיעלמות של חלק מהאותות, בעוד שהפכים לא יסכינו אותות לא ספציפיים. לבסוף, השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי (epi fluorescent microscope) המצויד במסננים ספציפיים מתאימים הוא חיוני לוויזואליזציה טובה ולפרשנות של האותות. וזהו.

תודה שצפיתם בה, ובהצלחה בניסוייכם.