Name: RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-07T16:40:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: למדו לבודד RNA איכותי מעוברי דג זברה ולהמירו ל-cDNA יציב לניתוח ביטוי גנים. השיטה כוללת הומוגניזציה, טיהור בערכת Qiagen וסינתזה לאחסון ארוך טווח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TRIzol+Reagent+Manual%22">TRIzol Reagent Manual</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNEasy+Mini+Handbook%22">RNEasy Mini Handbook</a>. , 4th ed, (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+First-Strand+Synthesis+System+for+RT-PCR%22">SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR</a>. , Version E. (2003).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

השבריריות של מולקולת רנ&quot;א הוא השיקול הקריטי ביותר, כי יש לזכור לאורך כל פרוטוקול זה. ציוד סטרילי כי הוא RNAse ללא יש להשתמש תמיד באזור RNAse חינם של המעבדה. זה עוזר לשמור חלק במעבדה לשמש הליכים RNA בלבד. אזור זה צריך להיות מרוסס לעיתים קרובות עם מוצר RNAse הסרת, כגון RNAse Away. דגימות רנ&quot;א צריך תמיד להיות מטופלים עם כפפות כל הזמן על הקרח כדי למנוע השפלה. פרוטוקול זה ניצלו ריאגנטים וערכות זמינים מסחרית....

<table><tbody><tr><td>גליקוגן (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>עלי המוחץ עם מבחורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>פנול, רווי Tris</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>ערכת DNase נקייה מ-RNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>ערכת RNEasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>מערכת SuperScript&amp;#174; לסנתזה של הגדיל הראשון עבור RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

rna סינתזה ניתוק מן דג הזברה cdna עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

רבים הליכי מעבדה חשוב ומורכב דורשים קלט גבוהה, RNA איכות ללא פגע. מדגם מושפל או נוכחות של זיהומים יכול להוביל לתוצאות הרסניות ביישומים ניסיוני במורד הזרם. לכן, חשיבות עליונה להשתמש בטכניקות מוצק עם אמצעי הגנה רבים ושליטה בדיקות איכות כדי להבטיח מדגם מעולה. בזאת, אנחנו פרט פרוטוקול לבודד RNA סך מעוברים דג הזברה שלם באמצעות denaturant כימיים זמינים מסחרית ניקוי הבאים כדי להסיר עקבות של דנ&quot;א זיהומים באמצעות ערכת בידוד מסחרי RNA. כאשר RNA הוא יציב יחסית ונוטים בקלות מחשוף ידי RNAses, ברוב הפרוטוקולים גן assay ביטוי בשימוש במוצר cDNA כי הוא מסונתז ישירות מתבנית RNA. אנו בפירוט הליך להמיר RNA לתוך המוצר cDNA יציבה יותר בעזרת ערכת זמינים מסחרית. במהלך הליכים אלה ישנם רבים בדיקות בקרת איכות כדי להבטיח כי המדגם הוא לא מושפל או מזוהמים. המוצר הסופי של פרוטוקולים אלה cDNA כי הוא מתאים microarray לניתוח, RT-PCR או אחסון לטווח ארוך.

הבידוד של איכות גבוהה, RNA שלם הוא צעד חיוני בפרוטוקולים מעבדה רבות. הנה, אנחנו מדגימים מיצוי RNA מעוברים דג הזברה כולו סינתזה cDNA עבור יישום עוקבת הפרוצדורות השונות כולל ניתוח ביטוי גנים microarray.

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

פרוצדורות מעבדה חשובות ומורכבות רבות דורשות קלט של RNA שלם ובאיכות גבוהה. דגימה שעברה דגרדציה או נוכחות של זיהומים עלולות להוביל...

כדי להתחיל את בידוד ה-RNA ולהשיג תנובה מספקת, מעבירים 50 עוברים של דגי זברה (zebrafish) למכתש עם מיקרו-פיוז טיוב. ראשית, מחלצים את ה-RNA באמצעות TRIzol reagent וכלורופורם לאחר הומוגניזציה יסודית. לאחר מכן, מנקים ומטהרים את ה-RNA באמצעות ערכת Qiagen RNeasy mini כדי להשיג RNA כולל איכותי שאינו מעובש (non-degraded) עבור יישומים עתידיים ואחסון לטווח ארוך.ה-RNA מסנתז למוצר cDNA יציב יותר. ה-cDNA מטוהר כדי להסיר את גדיל התבנית המקורי של ה-RNA. שלום, שמי סאם פטרסון מהמעבדה של ד"ר ג'ניפר פרימן במחלקה למדעי הבריאות באוניברסיטת פורדו.היום נדגים לכם כיצד להפיק RNA באיכות גבוהה מעוברי דג זברה שלמים ולהפוך אותו למוצר cDNA. בדרך כלל, אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור פרופילי ביטוי גנים. אז בואו נתחיל.בעת עבודה עם RNA, חשוב מאוד לעבוד בסביבה נקייה מ-RNAs. יש לנקוט באמצעי זהירות פשוטים, כגון הקצאת פפטים (pipettes) ייעודיים לשימוש אך ורק בהליכי RNA וריסוס אזור העבודה בחומר להסרת RNAs לפני תחילת מיצוי של total RNA. כדי להתחיל את עבודת המיצוי, עבדו במכסורת כימית וחשפו 50 עוברים של דג זברה (zebrafish) בתוך פרועת מיקרו-צנטריפוגה (microfuge tube) בנפח 1.5 מיליליטר. הסירו כמה שיותר מים והוסיפו מיד 250 µL של trizol reagent, המכיל פנול.השתמש בעלי המאיס (pellet pestle) כדי לרסק ולהומוגניзировать את העוברים במש

rna-isolation-from-embryonic-zebrafish-cdna-synthesis-for-gene

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Microarrays ג'ין הם כלים רבי עוצמה באפיון ביטוי גנים ברמת הגנום כולו. טכנולוגיה זו יישומים במגוון רחב של תחומים לרבות ביולוגי ביולוגיה התפתחותית הרעלים. בסרטון הזה, אנחנו פרט פרוטוקול ניתוח ביטוי גנטי גלובלי באמצעות פלטפורמה מקיפה microarray oligonucleotide על דג הזברה.

Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש...

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ"א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי.

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

פרוטוקול זה מציג גישה לניתוח transcriptome כל מעוברים דג זברה, הזחלים, או תאים ממוינים. אנו כוללים בידוד של RNA, מסלול ניתוח של נתוני RNASeq, המבוססות על לרביעיית-PCR אימות של שינויים בביטוי הגנים.

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

אנו מציגים פרוטוקול לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה הזחל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. על בידוד, RNA מופק מן התאים האלה כדי לנתח את פרופיל ביטוי גנטי. פרוטוקול זה מאפשר האוסף של RNA באיכות גבוהה עבור ביצוע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ו- transcriptomics.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

למדו לבודד RNA איכותי מעוברי דג זברה ולהמירו ל-cDNA יציב לניתוח ביטוי גנים. השיטה כוללת הומוגניזציה, טיהור בערכת Qiagen וסינתזה לאחסון ארוך טווח.

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

גלה סרטונים נוספים