Name: בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר זרמינל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: למד לבודד תאי גזירה עובריים מעוברי עכבר בגיל 10.5-11.5 ימים לאחר ההזדווגות. שיטה זו מאפשרת חקר התמיינות תאי גזירה ויישומים במחקרי פוריות וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר לעזור יסולא בפז של: ד&quot;ר ניל הראשונה Kourtney וילקינסון עבור עריכת כתב היד, ד&quot;ר לוסי Senter, ד&quot;ר Brigit Willeford ומייק Basett לסיוע בטיפול הדרכה חיה במתקן ALAC MSU העכבר מוכר; ד&quot;ר דוויין וייז עבור עזרתו עם מיקרוסקופיה לכידת תמונה: סזאר מונרוי, חנה Swoope, ובובי Huddleston על עזרתם עם ייצור וידאו MSU. מחקר זה מומן על ידי משרד המחקר המוסדיים ואת המחלקה למדעי הביולוגיה על מיסיסיפי סטייט.

חלק 1: laparotomy עכבר בהריון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש נקע בצוואר הרחם, להרדים עכבר בהריון C57BL6J נקבה ב 10.5-11.5 DPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את הבטן עם סבון מיקרוביאלית, ולאחר מכן, לגלח אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גילוח, לשטוף את הבטן עם מלוחים פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לייבש את הבטן עם גזה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את העכבר עם שדה סטרילית חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך הגחון באמצעות מלקחיים ומספריים לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות ולהסיר את הרחם כולו מתוך חלל הבטן. עוברי עכבר יוצג בתוך הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרחם לתוך צלחת פטרי מלא D-PBS, ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל סטרילי מלקחיים, להסיר את השלייה ורקמות נוספות העוברית של העובר כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים לתוך צלחת פטרי טרי מלא D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אורך של עוברי עכברים. מצאנו כי בגדלים שונים בהתאם לגיל העובר. לדוגמה 8.5 DPC נמדד בקצב ממוצע של 6 מ"מ, נמדד 10.5 DPC בקצב ממוצע של 11mm, ו - 12.5 DPC נמדד ממוצע של 16 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להסיר את זנבותיהם להפקת DNA. </li></ol> חלק 2: Dissection רידג' האשכים תחת stereomicroscope ואת מקור אור שוט Fostec <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים נייר סינון בצלחת פטרי. ואז, במקום העובר העכבר על גבי נייר הסינון לייבש את העובר ואת לשתק לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך רוחבי של העובר העכבר מעל המקור של חבל הטבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת stereomicroscope, באמצעות מלקחיים בסדר סטרילי מחט סטרילית מתגרה בסדר, להסיר את המעיים והכבד כל כך את מערכת השתן גלוי. הכליות ממוקמות רוחבית בחלל הבטן, ואת שלפוחית ​​השתן ממוקמת המדיאלי ואת הזנב בהשוואה הכליות. העובר יכול להיות מזוהה כזכר כי רכסי האשכים נמצאים משני צדי השלפוחית. אצל האשה, הרכסים האשכים מחוברים בחוזקה עד הסוף לרוחב הזנב של הכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולפים את רכס האשכים על ידי הזזה מחט מאחורי זה. רכס האשכים מוסר על ידי חיתוך משם הרקמות התומכות בה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רכסי האשכים כדי בצלחת פטרי חדש מלא טרי D-PBS. מיקרוסקופית, רכס האשכים הגברי צריך להיות חשוף, גדולים בצורת אליפסה. לעומת זאת, רכס האשכים הנשי צריך להיות הבחינו, יש צורה מאורכת ולהיות קטן ביחס הרכס האשכים הגברי. </li></ol> חלק 3: עיכול רידג' האשכים תחת stereomicroscope: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection כלית בינים: אשך נפרדת מן כלית בינים לבין רכס באמצעות מחט דק וחד. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב להסיר את כלית בינים מן הרכס האשכים כי זה רקמות סומטיות כי יהיה לגדול יותר בתהליך הגזירה PGC. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול רידג' האשכים: איסוף רכסים האשכים נקי ירידה 0.5ul של טרי D-PBS. הוסף 20 מ"ל של פתרון collagenase / Dispase (ריכוז סופי ב 1mg/ml). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים צריך להיות מעובד בנפרד. כל העובר צריך לבד נפרד שכותרתו שלה צלחת פטרי. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האשכים רידג' ממינסינג: חותכים את רכס האשכים לחתיכות קטנות באמצעות מחט סטרילית מלקחיים בסדר סטרילי מס '4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה: צלחות פטרי מועברים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן הדגירה יכול להשתנות בין רקמות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipetting: לאחר 15 דקות, הרקמה יכולה להיות מנותקת על ידי pipetting. שימוש pipettes משך נימי זכוכית בקטרים ​​בין 40 -100 מ"מ לשבור את השברים על ידי pipetting למעלה ולמטה. זה יהיה בצורת גושים קטנים. העברת גושי כדי 0.5ml של ירידה מראש D-PBS חימם עבור לשטוף סופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, העברת גושי לצינורות Eppendorf. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל מעל לחשוף את רקמות collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תעשו ההשעיה תא בודד. זה חשוב להקמת המושבה. אם זו השעיה תא בודד, PGCs נוטים לבדל ולנדוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך זה לא צריך להיות יותר מ 20 דקות, או תאים שלך תאבד את הכדאיות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל"ד 2000 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר centrifuging, להסיר את supernatant ו resuspend את הכדור בתוך 0.5 מ"ל של לדפוק את שיושלם מדיה (Pre-התחמם ב 37 מעלות צלזיוס). </li></ol> חלק 4: התרבות תאים שן ז'רמינל "אתה צריך לבצע את הצעדים הבאים מהר כדי לשמר את הכדאיות של PGCs עבור בידוד הגזירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני התהליך הזה אתה צריך להכין מומת mitotically-MEF CF1 מזין שכבת בעקבות פרוטוקול מ ג'אנג ג'יי et al 2008. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 20 מנות עבור pregna onent נקבה העכבר (6-8 עוברים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEFs מאבדים את היכולת להיות שכבה מזין (לקדם את הצמיחה ולמנוע בידול) אחרי 5-6 קטעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין להשתמש MEFs יותר מ -48 שעות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני PGCs ציפוי, המדיום MEF יש להסיר לאט מהשכבה מזין MEF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להוסיף 0.5 מ"ל / היטב מראש חימם בינוני בנוקאאוט שיושלם על שכבת מזין MEF. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEF התקשורת מכיל בסרום שור העובר כי גורם הבידול של PGCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני נוק יש להשלים עם גורמי גדילה ספציפיים מצלצלים מיד לפני השימוש, כדי להבטיח את פעילותו של הגורם לגדול. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הפצה סימטרי, PGCs צלחת מעל שכבת מזין MEF. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החלקים האלה הם קרובים מדי, הם נוטים לצבור ולעשות במושבות צפופות לצרף גרוע או להתחיל מבדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות התרבות חייבת להיות תווית עם שם עובריים קו ז'רמינל התא, מספר קטע, ותאריך. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות, להעביר את הכלים לתוך תרבות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התאים כל 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות, להסיר 250 מ"ל של מדיה העליון של התרבות להימנע מטריד מצורף של המושבה. ואז, להוסיף 250 מ"ל של טרי עקום החוצה התקשורת השלים (מחומם מראש על 37 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלב 7, לחכות עוד 48 שעות, ולאחר מכן, להסיר לחלוטין את כל התקשורת ולהחליפו בתוספת התקשורת עקום החוצה טרי (מחומם מראש על 37 ° C). האם זה כל 2 ימים 8-10 ימים עד ליצור מושבות PGC. </li></ol> חלק 5: תאים עובריים ז'רמינל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 ימים של בידוד PGC, מושבות תאים עובריים נבטי נוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורות תאים עובריים נבטי נשמרים חי על ידי קטעים ידנית כל 8-10 ימים. הם ממשיכים להוות מורפולוגיה מובחן ולהביע סמנים pluripotency כגון alkalyne phosphatase, אוקטובר-4, SSEA-1, ו - SOX-2 </li></ol> הערות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנאים סטריליים / aseptic חיוניים בחדר התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הגזירה ותרבות, PGCs מעובדים ממשלה מחלקה מטהר ביו בטיחות השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incubations נמצאים humidified 37 ° C ו 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל התקשורת ואת ריאגנטים מסוננים לפני השימוש במסנן 0.2 אממ, המאוחסן ב 4 ° C, מראש התחמם ב 37 מעלות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלבים לנתיחה, עוברים כל ורקמות חייב להישמר על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלוחיות כל מגיב הם לחטא עם אתנול לפני הצבת בארון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכפפות, חלוק, וכובעים אחות הם חובה. </li></ul> מסקנה סיפקנו וידאו המראה כיצד לבודד, להפיק, ואת התרבות תאים עובריים נבטי מ רכסים האשכים של 10.5-11.5 עוברים DPC העכבר. הבידוד לשחזור התרבות לטווח ארוך של שורות תאים עובריים נבטי מספק בסיס חיוני למחקר של ההתפתחות העוברית המוקדמת, נבטי דפוסים גנטיים epigenetic, היווצרות בלוטת המין, ההשפעות הסביבתיות של האיברים הסמוכים במהלך תהליך התפתחותי של gametogenesis של עוברי זכר ונקבה, וקביעת מסלולים שמוביל לסרטן פוריות. <img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1">

<ol><li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeFelici%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A laboratory Handbook</a>. 1, Second Edition, 73-85 (1998).</li>
<li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li>
<li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabosky%2C+PA+%22Molecular+embryology%3A+methods+and+protocols%22">Molecular embryology: methods and protocols</a>. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).</li>
<li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li>
<li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+MEFs+to+Matrigel+I%3A+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

מחקר זה נערך לאחר בדיקה וטיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) אישור פרוטוקול העכבר שלנו # 08030 (תפקיד החמצן מגיב Species-ROS בפיתוח קו נבט היווצרות הגידול: החזקת וגידול פרוטוקול) בשעה מיסיסיפי סטייט.

מלקחיים מס &#39;14 ו -15, 35 מ&quot;מ אזמל, מספריים לנתיחה, שדות כירורגית, סבון מיקרוביאלית, תמיסת מלח 0.9%, גזה, קצף מיכל קרח, סכין גילוח, 35 מ&quot;מ אזמל, מלקחיים קנס מס&#39; 4 ו - 5, מחט מתגרה בסדר לטפל, לסנן גיליונות נייר, ומשכה pipettes זכוכית.<br /<br /&gt; ציוד: stereomicroscope לנתח, אור מקור שוט Fostec, מיקרוסקופ הפוכה, micropipette 10 ו 200ul, צנטריפוגות, הקבינט ביו בטיחות.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

היכולת של תאים עובריים נבטי (למשל) כדי להתמיין לתאי נבטי קדמוני (PGCs) ומאוחר יותר לתוך הגמטות במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 בימים שלאחר coitum (DPC) עוברי עכברים. פיתוח רכסים האשכים מעוברים העכבר (C57BL6J) היו מנותקים על ידי הפרעה מכנית עם collagenase, אז מצופה שכבה העובר עכבר מזין פיברובלסטים (MEF-CF1) כי היה בעבר מומת mitotically בנוכחות התקשורת בנוקאאוט עם mitomycin C שיושלם עם מעכבי לוקמיה פקטור (LIF), פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (bFGF), וכן גורם לתאי גזע (SCF). שימוש בשיטות אלה אופטימיזציה עבור זיהוי ובידוד PCG, והקמת התנאים תרבות היתרי תרבויות ארוך טווח של תאים EG במשך יותר מ 40 ימים. הקווים עובריים נבטי הראו פנוטיפ הביטוי עובריים של סמנים בשימוש משותף של המדינה pluripotent. בידוד הגזירה של תאים נבטי בתרבות לספק כלי להבין את התפתחותם במבחנה מציעים את ההזדמנות כדי לפקח על נזק מצטבר ברמות גנטיים epigenetic לאחר חשיפה סטרס חמצוני.

היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

היכולת של תאי נבט עובריים (EG) להתמיין לתאי נבט ראשוניים (PGCs) ומאוחר יותר לגמטות במהלך השלבים המוקדמים של ההתפתחות...

שלום, שמי האר מורנו מהמעבדה לגנטיקה של רבייה ותאי גזע של אוניברסיטת מדינת מיסיסיפי. שלום, שמי קלרה סנט. גם אני מהמעבדה לגנטיקה של רבייה ותאי גזע של אוניברסיטת מדינת מיסיסיפי. תאי נבט ראשוניים, או PGC, הם התאים הקדמונים של הזרע והביציות באשכים ובשחלה, בהתאמה.בעוברים של עכברים, תאי PGC נודדים מהמעי האחורי ועוברים דרך הרכס הגניטלי בין הימים 8.5 ל-9.5. תאי PGC מאוחרים מגיעים לרכס הגניטלי בין הימים 10.5 ל-11.5.TAs פוסטום ומתחילים להוות את הנתיב הגונדלי בנקבת ה-D. ה-pg cs נודדים לקצה הקולטרלי של הכליה כדי להתחיל להוות את הנתיב הגונדלי הנקבי. בניגוד לכך, בזכר, ה-PGCs נודדים לשני צדי השלפוחית.כדי להתחיל בתהליך. תאי הנבט הזכריים של alridge הם מודל מחקר מצוין לבדיקת נתיבי התפתחות של תאים בנוכחות עקה חמצונית כגורם לעקרות ולסרטן. בואו נתחיל.כיום נראה לכם כיצד לאסוף ולבודד תאי PV Cs מרכמות של רכסים גונדליים (gonadal ridges) בשלבי התפתחות מעוברים של עכבר בני 10.5 עד 11.5 ימים לאחר ההפריה. הרכסים הגונדליים של עוברי העכבר מופרדים על ידי הרס מכני לצורך השתלה על שכבת הזנה של פיברובלסטים מעובר עכבר. לאחר 10 ימי תרבית בתנאים אופטימליים, מושבות נבטיות עובריות יפגינו פנוטיפים עובריים. כמו כן, לאחר מעברים (passages), ניתן לזהות אותן על ידי ביטוי של סממנים פלוריפוטנטיים.החומרים הבאים דרושים לשלב זה של נתיחה סטרילית. ערכה המכילה שדות סטריליים, פינצטות, מספריים, להבי תער, סבונים אנטימיקרוביאליים, תמיסות סלין, צלחות פטרי מלאות ב-PBS Pep על קרח וגזה; נקבת עכבר C57BL/6 בהריון ביום 10.5 עד 11 לאחר ההפריה, המהורגת על ידי דיסלוקציה צווארית. נקה את הבטן בעזרת סבון אנטימיקרוביאלי, ולאחר מכן גלח אותה.שטפו את הבטן באמצעות תמיסות סלין. ייבשו אותה בעזרת גזה סטרילית. כסו את העכבר בשדה סטרילי חדש.בצעו חתך בבטן (ventral incision) באמצעות פינצטה ומספריים. זהו והוציאו את הרחם כולו מחלל הבטן. העוברים יהיו גלויים בתוך הרחם.בזהירות רבה. העבירו דרך הרצועות שעדיין מחוברות לקרן הרחם. השלימו את הנתיחה על ידי ביצוע חיתוך רוחבי לאורך הנרתיק.העבירו את הרחם לצלוחית פטרי אטומה עם GPVS ושמרו אותה על קרח. הפרידו את הרקמות העובריות החיצוניות מהעוברים. השתמשו בסקאלפל ובפינצטה סטריליים.העבירו את עוברי הפה לצלוחית פטרי נקייה מלאה ב-DPBS. מדדו את אורך עוברי הפה. מצאנו כי הגדלים השתנו בהתאם לגיל העובר.לדוגמה, 8.5 ימים לאחר ההפריה (post coum) נמדד אורך ממוצע של שש מילימטרים, 10.5 ימים לאחר ההפריה נמדד אורך ממוצע של 11 מילימטרים ו-12.5 ימים לאחר ההפריה נמדד אורך ממוצע של 16 מילימטרים. יש להסיר את הזנבות שלהם לצורך הפקת DNA. החומרים הבאים דרושים לנתיחה: מיקרוסקופ סטריאו, מבת ביולוגית (biosafety cabinet), PDS וסכין מנתח (scalpel) סטרילית.פינצטה עדינה סטרילית, מחט הפרדה (teasing needle) עדינה סטרילית עם ידית, פטריות (Petri dish) ודפי נייר סינון. הנח נייר סינון בתוך פטריה, ולאחר מכן הנח את עובר הפה על גבי נייר הסינון כדי לייבש את העובר ולקבע אותו לצורך הדיסקציה. באמצעות סכין מנתחים (scalpel) סטרילית, בצע חיתוך רוחבי של עובר הפה מעל נקודת המוצא של חבל הששייה תחת מיקרוסקופ סטריאו.השתמשו בפינצטה עדינה סטרילית ובמחט הפרדה עדינה סטרילית. הסירו את המעיים ואת הכבד כך שמערכת השתן תהיה גלויה. השלפוחית ממוקמת במישור המדיאלי.ניתן לזהות את העובר כזכר מכיוון שגשרי הגונד (gonadal bridges) ממוקמים משני צדי השלפוחית. בעזרת פינצטה עדינה סטרילית ומחט דקה סטרילית, הסירו את רכס הגונד הזכרי הימני על ידי חיתוך הרקמה התומכת בו. בצעו את אותו ההליך כדי להסיר את רכס הגונד הזכרי השמאלי.העבירו את שני רכבי המין הזכריים למנת Petri קטנה המכילה DPDS טרי, תוך שימוש במיקרוסקופ. ניתן לראות את רכב הגונד הזכרי מחובר למסו-נפרוס (mesonephros). רכבי הגונד הזכריים צריכים להיראות כפסים גדולים ובצורת אליפסה תחת מיקרוסקופ סטריאו.הסר את המעיים באמצעות פינצטה עדינה סטרילית ומחט פיסול עדינה סטרילית. הכליות ממוקמות לטרלית בחלל הבטן, והשלפוחית ממוקמת למדיאלית וקודאלית יותר בהשוואה לכליה. הרכס הגונאדי של הנקבה שונה מהרכס הגונאדי של הזכר בשל המורפולוגיה והמיקום האנטומי שלו.רכבי הגונד (gonadal ridges) הנקביים מחוברים בחוזקה לקצה הצדדי הזנבי של הכליה. בעזרת פינצטה עדינה סטרילית ומחט עדינה סטרילית, הסירו את רכב הגונד הנקבי השמאלי על ידי חיתוך הרקמות המחברות אותו לכליה.חזור על אותו הליך כדי להסיר את הרכס הגונדלי הנקבי הימני. העבר באופן מיקרוסקופי את שני הרכסים הגניטליים הנקביים לצלוחית פטרי קטנה המכילה PDS טרי. ניתן לראות את הרכס הגונדלי הזכרי המחובר ל-Neso Nera.יש לזהות את הרכסים הגונדליים הנקביים, אשר אמורים להיות בעלי צורה מוארכת וקטנים יותר בהשוואה לרכסים הגונדליים הזכריים, באמצעות מחטים סטריליות, דקות וחדות. הפר את הרכסים הגונדליים הנקביים מהמזונריום וממרקמות סומטיות אחרות באמצעות מחטים סטריליות, דקות וחדות. הפר את הרכסים הגונדליים הזכריים מהמזונריום וממרקמות סומטיות אחרות.חשוב להוציא את ה-meso Neros מרכס הגונד (gonad ridge) מכיוון שזהו רקמה סומטית שתגדל יתר על המידה בתהליך גזירת ה-PGC. אסוף את רכס הגונד בטיפה של 0.5 µL של DPVS טרי עם תמיסות collagenase. תחת מיקרוסקופ סטריאו, חתוך את רקמות הגונד לחתיכות קטנות באמצעות מחטים סטריליות, דקות וחדות.מעבירים את פטריות הפטרי למדגרה בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, ניתן לבצע דיסוציאציה לרקמה על ידי פיפטינג באמצעות פיפטות קפילריות מזכוכית משוברת בעלות קטרי שונים שבין 40 ל-100 מיקרון. יש לפרק את חלקי הרקמה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.פעולה זו תיצור גושים קטנים. גושים קטנים אלו נשטפים ב-0.5 µL של DPDX לאחר השטיפה. אלו מועברים ל-Eend cubes ב-2000 RPM למשך חמש דקות.בטמפרטורת החדר לאחר הצנטריפוגה, מסירים את הנוזל העליון (supernatant) ומרספים את המשקע ב-0.5 milliliters של מצע גידול knockout מושלם, שחומם ל-37 °C במשך 24 שעות. לפני תהליך זה, יש להכין שכבת תאי מאכילה (feeder layer) של פיברובלסטים מעוביים של עובר עכבר שעברו אינאקטיבציה ב-MEF CCF1 מיד לפני זריעת ה-PGC. יש להסיר את מצע הגידול משכבת המאכילה שהוכנה.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטרים של מצע knockout מועשר שחומם מראש ל-37 °C על שכבת המזין meth. תחת מיקרוסקופ סטריאו ובפיזור סימטרי, טפטפו כמויות קטנות של PT GC מעל שכבות המזין meth. אם חלקים אלו קרובים זה לזה, הם נוטים להצטבר וליצור מושבות דחוסות שאינן נצמדות היטב או מתחילות בתהליך של בידול תרבימי.יש לסמן את הצלחות עם שם קו תאי הנבט העוברי, מספר המעבר והתאריך. העבירו בזהירות את צלחות התרבית לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2. 10 ימים לאחר הבידוד, ניתן לזהות מושבות של תאי נבט עובריים על סמך המורפולוגיה האופיינית שלהן. כמו כן, לאחר המעבר הראשון, ניתן לזהותם על ידי ביטוי של סממנים פלוטנטיים כגון alkaline phosphatase, Oct4, SSEA-1 ו-SSEA-4.היום נדגים כיצד לאסוף ולתרבל תאי נבט עובריים מתאי נבט ראשוניים (PGCs) מעכברים ביומיים 10.5 ו-11.5 לאחר ההפריה. אפיון של תאי נבט עובריים כסלולי מוצא של הגמטוגנזה הוא חיוני למחקרים הקשורים לתהליך יצירת הגמטות, לפוריות ולסרטן.תודה שצפיתם בסרטון שלנו. בהצלחה בניסוי שלכם.

isolation-and-derivation-of-mouse-embryonic-germinal-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד וטיפוח תאי קליפת המוח הראשוניים מהטלנספלון הדורסולטרלי של עוברי עכברים.

בידוד וגידול תאים מעובר עכבר טלנספלונים דורסולטרליים

בשנים האחרונות להיווצרות של תאי הנבט המשתמשים בשיטות תרבות במבחנה הודגמה תוך שימוש בסוגים שונים של תאי גזע סומטיים. מאמר זה יציג חזותי התמיינות של תאי גזע שמקורם יילוד עכבר לתאים דמויי ביצית מוקדמות.

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

פיתחנו פרוטוקול ליצירת אגרגטים של תאי גזע עובריים של עכברים המציגים ארגון עצמי, שבירת סימטריה והתארכות במקביל להתפתחות צירית. טכניקה זו מאפשרת לחקור תהליכי התפתחות ציריים ויצירת סוגי תאים שאחרת קשה לבצע בתרבית חד-שכבתית.

דור של אגרגטים של תאי עכבר גזע עובריים שצג שבירת סימטריה, קיטוב והתנהגות קולקטיבית מתהווה<em&gt; במבחנה</em

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של קבוצה מינימלית של גורמי שעתוק. טכנולוגיה זו עשויה להיות מתורגמת למערכת האנושית כדי לספק פלטפורמות למחקר עתידי של המטופואיזה, מחלות המטולוגיות והשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

מאמר זה נועד להדגים את השימוש בתאי גזע עובריים הפלואידיים פרתנוגנטיים כתחליף לזרע לבניית עוברים משובטים למחצה.

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

למד לבודד תאי גזירה עובריים מעוברי עכבר בגיל 10.5-11.5 ימים לאחר ההזדווגות. שיטה זו מאפשרת חקר התמיינות תאי גזירה ויישומים במחקרי פוריות וסרטן.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז'רמינל

גלה סרטונים נוספים