קוליטיס דוגמנות Murine באמצעות נתרן dextran סולפט (DSS)

עכברים מקבלים 3%DSS במים במשך ארבעה ימים. בזמן שמשקל, נוכחות של שלשול ודם בצואה נרשמים מדי יום, ה-TSS מוחלף במים שעברו עיקור באוטוקלבה לאחר היום הרביעי. לאחר שלושה ימים של שתיית מים, העכברים מושמדים והמעי הגס שלהם מוסר.

מדדים ושוקלים את המעי הגס. לאחר מכן, מעצבים את המעי הגס לצורת גליל שוויצרי (Swiss roll) או נקניק ובחונים אותו תחת מיקרוסקופ. מאמר וידאו זה ידגים את הקצירה והעיבוד של מעי גס במודל עכברי של קוליטיס.

נוהל זה משמש לחקר קוליטיס במעבדתו של ד"ר Christopher Williams מהמחלקה לביולוגיה של הסרטן באוניברסיטת Vanderbilt לפני תחילת הטיפול ב-dextrin sulfate sodium. משקלי בסיס נמדדים לאורך מהלך הניסוי. משקלים יומיים נלקחים לאחר ששוקל את העכברים; הכין תמיסת dextrin sulfate sodium salt, או DSS, בריכוז של 3% משקל לנפח במים.

על ה-DSS להיות בעל משקל מולקולרי נמוך כדי שמודל זה יהיה יעיל; הכינו מספיק תמיסת DSS למילוי בקבוק מים עבור כל כלוב עכברים, וסננו את התמיסה באמצעות מסנן צלולוז אצטט של 0.45 micrometer. החליפו את בקבוק מי השתייה בכלוב העכברים בבקבוק המכיל תמיסת 3%DSS. אם המוסד שבו אתם פועלים משתמש במערכת השקיה אוטומטית, התקינו פיות חסימה על פתחי השקיה כדי להבטיח שלעכברים לא תהיה גישה למקור מים אחר.

לאחר ארבעה ימים, שוקלים שוב את העכברים כדי לכמת את ההשלכות הסיסטמיות של הקוליטיס. איבוד משקל הוא נפוץ בפגיעה חמורה, עם זאת, ייתכן שלא יהיה ניכר במשך מספר ימים נוספים באותו היום. ביום הרביעי, מחליפים את תמיסת ה-DSS במים למשך שלושה ימים נוספים כדי לאפשר התאוששות מסוימת של אפיתל המעי הגס.

שלושה ימים לאחר מכן, ביום השביעי, שוקלים שוב את העכברים. לאחר מכן ניתן להוציא את המעי הגס מהעכברים שהורדמו, כפי שמוצג בסעיף הבא. כדי להוציא את המעי הגס, חשוף את הצד הוונטרלי של העכבר המורדם כדי להבטיח גישה ללא הפרעות לבטן.

הרטב את הבטן לחלוטין ב-70% ethanol. אחז את קו האמצע של הבטן בעזרת פינצטה לרקמות והרם אותה. כך ניתן למתוח את העור באמצעות מספריים בעלי קצה דק.

בצעו חתך בבטן כדי לחשוף את תוכן הבטן. הרחיבו את החתך עד לקצה התהליך החרב (xiphoid process) בקו האמצע, ולאחר מכן הרחיבו אותו לאורך ההיבט התחתון של שולי הצלעות משני הצדדים. זהו את המעי העקב (cecum) של המעי הדק ואת המעי הגס (colon).

יש להפריד בזהירות את המעי הגס מהמסרק (mesentery) שמסביבו באמצעות דיסקציה או הפרדה עדינה. לאחר מכן, יש לחתוך את המעי הגס בעומק האגן כדי לשחרר את המעי הגס הדיסטלי מהרקטום.

יש לנקוט זהירות כדי ששום עורק או וריד לא ייחתכו. כמו כן, יש לשים לב כי המעי הגס עלול להיקרע בקלות. לכן, יש להסיר בעדינות את המעי הגס מהמסרק (mesentery).

בצעו חיתוך של המעי הגס בשולי ה-Colona sequel כדי לשחרר את המעי הגס הפרוקסימלי. הסירו את המעי הגס ובצעו אינטובציה ושטיפה של המעי הגס באמצעות מחט הזנה 20 gauge ומזרק 10 milliliter עם PBS קר מאוד, עד ש-EIT נקי לחלוטין מצואה. חשוב לשמור על האוריינטציה הנכונה של המעי הגס על ידי השארת הקצה הדיסטלי של המעי הגס קרוב אליכם.

התחילו במדידת אורך המעי הגס באמצעות קליבר דיגיטלי. אורך המעי הגס הוא אינדיקטור נוסף לחומרת הפגיעה. קוליטיס מגבירה בצקת ומקצרת את אורך המעי הגס הכולל.

בשלב זה, ניתן לעבד את המעי הגס שנאסף כנקניק (sausage) לצורך אנליזה מקרוסקופית, או להכינו כגליל שוויצרי (Swiss roll) לצורך אנליזה היסטולוגית של קוליטיס חריפה. נדגים את הטכניקות הללו בסעיפים הבאים. כדי לעבד את המעי הגס כנקניק לצורך אנליזה מקרוסקופית של המעי הגס כולו, חשוב לשמור על האוריינטציה הנכונה של המעי הגס. לכן, השאר את הקצה הדיסטלי של המעי הגס קרוב אליך.

גזרו שתי פיסות של חוט תפירה שאינו נספג, אחת באורך של כאינץ' אחד והשנייה באורך של שני אינצים. השתמשו בפיסת חוט התפירה באורך שני אינצים כדי לקשור את הקצה הדיסטלי של המעי הגס קרוב ככל האפשר לשוליים, תוך שמירה על אטימה טובה. לאחר מכן, הכניסו מחט הזנה בכיול 20 gauge המכילה 5 mL של 10% buffered formalin phosphate לתוך הקצה הפרוקסימלי של המעי הגס.

קשרו באופן רפוי את קצה חוט התפירה שנותר מיד פרוקסימלית לבב מחט ההזנה. כעת, אחזו את המעי הגס בחוזקה בבב מחט ההזנה והזרימו כמות מספקת של פורמלין תוך וידוא שהמעי הגס מורחב. הדקו את הקשר בחוט התפירה בעת שליפת מחט ההזנה, כך שיישאר המעי הגס המורחב והמוזרק.

בדומה לנקניק, מלאו מבחנה קונית של 15 מיליליטר בפורמלין 10% בבופר פוספט, וסמנו את המבחנה. הניחו את המעי הגס בתוך המבחנה וקבעו אותו למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, שפכו את הפורמלין למכל פסולת מתאים והחליפו אותו ב-70% ethanol למשך 24 שעות נוספות.

ניתן לשמור מעיים הגדיסות ב-70% ethanol ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר. כאשר אתם מוכנים לנתח את המעי הגס, הוציאו אותו מהמבחנה הקונית. חתכו את החוטים בכל קצה באמצעות סקלפל, תוך הקפדה שלא לפגוע במעי הגס.

זכרו שהקצה הדיסטלי מכיל את קטע החוט הארוך ביותר. חתכו את המעי הגס לאורכו, מהקצה הדיסטלי לקצה הפרוקסימלי, כך שיהיה בצורת יריעה ארוכה. כעת ניתן לבחון את המעי הגס תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

חתכו את המעי הגס לאורכו ופרסו אותו כגיליון שטוח. גלגול המעי הגס דורש שני זוגות פינצטות וטכניקה המבוצעת בשתי ידיים. אחזו בשני הקצוות הלטראליים של שולי המעי הגס הדיסטלי באמצעות פינצטות, והמשיכו לגלגל את המעי הגס באופן רצף על ידי סיבוב ושחרור הפינצטות תוך התקדמות לעבר השוליים הפרוקסימליים, ובכך צרו ספירלה בעלת ממד שלישי או "גליל שוויצרי" (Swiss roll).

אם המעי הגס נדבק לנייר הוואטמן (Watman paper), הרטב את הנייר ואת המעי הגס בכמות קטנה של PBS כדי לשמור על הצורה. אחז את הגליל בחוזקה בעזרת פינצטה ובצע חיתוך רוחבי באמצעות מחט בכיל 27.5. קבע את הגליל על ידי כיפוף המחט בעת יציאתה מהגליל.

כעת, העבירו את הגליל לקסטה מסומנת לרקמות והניחו את הקסטה בצנצנת המכילה 10% buffered formalin phosphate. השאירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לצורך קיבוע הרקמה. לאחר 24 שעות, שפכו את הפורמלין והחליפו אותו ב-70% ethanol למשך ארבע שעות נוספות.

ניתן לאחסן מעי גס ב-70% ethanol לזמן בלתי מוגבל בטמפרטורת החדר. מודל זה מאפשר לחוקר להוציא, לקבע ולנתח מעי גס, ובכך מאפשר ניתוח של חומרת הקוליטיס. לצורך ניתוח מאקרוסקופי של המעי הגס כולו, ניתן לעבד את המעי הגס כנקניק המוחדר בפורמלין ומרחב באופן מלא.

הנקניק הפתוח צריך להישכב בצורה שטוחה. אם שיטת הנקניק בוצעה כהלכה, המעי הגס המקובע יהיה מורחב וניתן יהיה לתמרן ולצפות בקלות בכל שטח הרירית תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לצורך אנליזה היסטולוגית, ניתן לעבד את המעי הגס בשיטת Swiss roll.

את הגליל מקבעים באמצעות מחט ומניחים בקסט רקמות לצורך קיבוע. כאשר הגליל נחתך ומוצמד, הוא אמור להוות פרוסה מייצגת של המעי הגס כולו אם גולגל כראוי; ניתן לצבוע חתכים של ה"Swiss roll" בהמטין ו-ASIN על מנת לקבוע את היקף הפגיעה במעי הגס. יש לזכור כי הקצה הדיסטלי של המעי הגס נמצא במרכז הגליל על גבי הזכוכית.

בדוגמה זו, דלקת ונזק לקריפטות ניכרים במעי הגס שטופל ב-DSS בהשוואה לבקרת מעי גס שטופל במים. הרגע הצגנו כיצד לאסוף ולעבד מעיים גסים ממודל עכברי של קוליטיס חריפה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להיות מאורגנים היטב לפני ההקרבה.

עבור העכברים, לדוגמה, יש לסמן את כל המבחנות והקסטות עבור כל עכבר, ולהכין את כל הכלים והריאגנטים כך שיהיו זמינים. בנוסף, יש לנהל רישומים מפורטים של משקל העכברים ואורך המעי הגס. לבסוף, ודאו שהקציתם מספיק זמן לתהליך העיבוד.

בדרך כלל הפרוצדורה אורכת כ-15 דקות לעכבר עבור מי שאינו מנוסה, ובין שש לשמונה דקות עבור מי שבעל ניסיון רב יותר בטכניקה זו.