Name: קוליטיס דוגמנות Murine באמצעות נתרן dextran סולפט (DSS) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: למדו את פרוטוקול DSS ליצירת קוליטיס חריף בעכברים. השיטה כוללת מתן נתרן דקסטרן סולפט במי שתייה, מעקב אחרי משקל ודם בצואה, וכן הכנת רקמת המעי הגס לניתוח היסטולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון הניתנים על ידי NIH (1 DK080221 K08-01) וקרנות ונדרבילט פיתוח מוסדיים.

חלק 1: פציעה, תיקון דגם קוליטיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקל Baseline יש לקבל עבור כל עכבר לפני תחילת הטיפול DSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3% (w / v) נתרן סולפט dextran מלח פתרון במים ולסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר אצטט תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף מי שתייה בכלוב עכבר עם פתרון DSS 3% במשך ארבעה ימים. העכברים לא צריכה להיות גישה לכל מקור מים אחר (טיפים הדרה כלומר דגש על מערכות השקיה אוטומטיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הרביעי, להחליף את פתרון DSS עם מים במשך שלושה ימים נוספים, ומאפשר התאוששות אפיתל המעי הגס. העכברים צריכים להישקל על ארבעה ימים על מנת לכמת את ההשלכות המערכתיות של קוליטיס. ירידה במשקל היא נפוצה עם פגיעה חמורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, לשקול להקריב את העכברים. עכברים יכולים להיות מורדמים באמצעות מנת יתר של שאיפה isoflurane, מוסדית או אחרת, אישר IACUC שיטות. </li></ol> חלק 2: Necropsy והקציר של קולון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצד הגחוני של העכבר והרגליים מאובטח כדי להבטיח גישה בלא הפרעה אל הבטן. רטוב לגמרי את הבטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את קו האמצע של הבטן עם מלקחיים רקמות להאריך כלפי מעלה ובכך האהלה את העור. השתמש קנס שקצהו מספריים כדי לחתוך את הבטן ובכך חושפים את תכולת הבטן. הרחבת חתך עד קצה של תהליך xyphoid על קו האמצע ולאחר מכן להרחיב לאורך הצד הנחות של שולי costal בילטרלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את המעי הדק, cecum, והמעי הגס. בזהירות לנתח / להקניט את המעי הגס מן mesentery שמסביב. Transect המעי הגס עמוק בתוך האגן כדי לשחרר את המעי הגס והרקטום דיסטלי ו. Transect המעי הגס בשוליים colonocecal לשחרר את המעי הגס הפרוקסימלי. יש להקפיד במהלך תהליך זה לא לפגוע כמו ניקוי המעי הגס המעי הגס יהיה בעייתי אם ניקוב מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט האכלה 20 גרם ו - 10 מ"ל מזרק, לצנרר ולשטוף את המעי הגס עם קרים כקרח PBS עד eluate ברורה לחלוטין של צואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה זו, אם ניתוח מאקרוסקופיים באמצעות מיקרוסקופ ביתור הוא הרצוי, נקודתיים יכול להיות קבוע בשם "נקניקיות". אם ניתוח היסטולוגית בלבד הרצוי מאשר להמשיך חלק 4 "ביצוע רולס שוויצרי לניתוח היסטולוגית של קוליטיס חריפה". </li></ol> חלק 3: עיבוד כמו "נקניקיות" לניתוח מקרוסקופית של המעי הגס שלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לשמור על הכיוון הנכון של המעי הגס, ולכן, להשאיר את הקצה הדיסטלי של המעי הגס הקרוב למפעיל. חותכים שתי חתיכות תפר שאינם נספגים (SP116 1.5 משי קלוע מטרי), אחד כ 1 ס"מ אורך, השני 2 אינץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חתיכה של 2 ס"מ תפר לקשור את הקצה הדיסטלי קרוב לשוליים ככל האפשר, תוך שמירה חותם טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מחט האכלה 20 גרם המכילה 5 מ"ל של 10% בופר פוספט פורמלין לתוך סוף הפרוקסימלי של המעי הגס. Loosely לקשור את פיסת הנותרים של תפר הפרוקסימלי מיד הנורה של המחט האכלה. אחוז המעי הגס בתוקף על הנורה של המחט האכלה להזרים פורמלין עד המעי הגס מורחבת. הדקו את הקשר תפר כפי שאתה למשוך את מחט האכלה, ובכך להותיר את חדורים, המעי הגס התרחבו כמו "נקניק". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא צינור חרוטי 15 מ"ל עם 10% שנאגרו פוספט בפורמלין במקום המעי הגס בצינור. תקן 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פורמלין ולהחליף EtOH 70% עבור 24 שעות נוספות. (נקודתיים ניתן לאחסן EtOH 70% ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעי הגס מהצינור חרוטי לחתוך את החוטים בכל קצה עם אזמל, נזהר לא לפגוע המעי הגס. זכרו כי בסופו הדיסטלי יש את פיסת הארוך ביותר של מחרוזת. גזור longitudinally מן דיסטלי סוף הפרוקסימלי של המעי הגס, כך הוא יוצר גיליון ארוך. בשלב זה, המעי הגס ניתן לראות תחת מיקרוסקופ לנתח. </li></ol> חלק 4: ביצוע רולס השוויצרית לניתוח היסטולוגית של קוליטיס חריפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לשמור על הכיוון הנכון של המעי הגס, ולכן, להשאיר את הקצה הדיסטלי של המעי הגס הקרוב למפעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אורך המעי הגס. מדד זה מצביע פעם נוספת חומרת הפציעה. קוליטיס מעלה בצקת ומקצר את אורך המעי הגס הכוללת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קנס שקצהו מספריים, לחרות longitudinally מ דיסטלי סוף הפרוקסימלי של המעי הגס. שימוש במלקחיים היטה בסדר לתפוס או קצה של החתך פתוח רוחבית לעבוד בדרך שלך distally-&gt; proximally, ובכך להציג את המעי הגס כמו סדין שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רולינג המעי הגס דורש זוג מלקחיים טכניקה two ריקות. אחוז אחד לקצה השוליים דיסטלי עם מלקחיים. המשך ברצף לגלגל את המעי הגס על ידי החלפה ושחרור של מלקחיים הליך לשוליים הפרוקסימלי. לפיכך יצירת ספירלה עם מימד שלישי או "Roll השוויצרית".כדי לשמור את הטופס התגלגל, לתפוס את הגליל היטב עם מלקחיים transect זה עם מחט 27G1 / 2. Secure את המחט על ידי כיפוף המחט מיד עם יציאתו את הגליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את להתגלגל קלטת רקמות שכותרתו כראוי ומניחים בצנצנת של 10% בופר פוספט פורמלין בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות על מנת להבטיח קיבוע הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פורמלין ולהחליף EtOH 70% עבור 24 שעות נוספות. (נקודתיים ניתן לאחסן EtOH 70% ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מדגם תוקנה, זה יכול להיות מוטבע פרפין, מחולק רכוב על שקופיות לניתוח היסטולוגית. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג המודל DSS עבור קוליטיס חריפה מאפשרת לחוקר להשיג, לתקן, ולנתח נקודתיים כי מודלים קוליטיס חריפה. כאשר גליל שוויצרי נחתך רכוב, יש טופס פרוסה נציג של המעי הגס כולו אם התגלגל כראוי (איור 1). גליל רכוב יכול להיות מוכתם H &amp; E כדי לקבוע את מידת הנזק המעי הגס, מסוף (בפנים) דיסטלי עד הסוף (בחוץ) פרוקסימלי (איור 2). אימונוהיסטוכימיה ניתן גם לבצע גליל השוויצרי לזהות ולכמת מחלחל דלקתיות. אם שיטת נקניק שבוצעה כהלכה, המעי הגס קבוע יהיה מורחבים על פני הרירית כולה ניתן להשפיע בקלות מתחת למיקרוסקופ הניתוחים (איור 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"></a> באיור 1. כהלכה-להורג "פחזנית". (א) המעי הגס הוא התגלגל מן דיסטלי לסיים הפרוקסימלי, transected עם מחט ומאובטחת על ידי כיפוף סופו של המחט. זה ממוקם אז קלטת רקמה קיבעון. (ב) H &amp; E מוכתם סעיף 5 מיקרומטר של גליל השוויצרי עשוי המעי הגס של עכבר שטופלו DSS (ד = המעי הגס הדיסטלי p = המעי הגס הפרוקסימלי). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig2tmb.jpg" alt="איור 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"></a> איור 2. DSS נקודתיים שטופלו להראות סימנים של דלקת חריפה. נזק דלקת הקריפטה ניכרים DSS המעי הגס שטופלו לעומת בקרת מים מטופלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig3tmb.jpg" alt="איור 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"></a> איור 3. דוגמה "נקניק". נקניק רווי פורמלין והרחיב לחלוטין. הזווית הקלה תהיה משנית להציג עקמומיות הטבעית של המעי הגס. נקניק נפתח צריך לשכב.

<ol><li>Okayasu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Mtgr1+sensitizes+the+colonic+epithelium+to+dextran+sodium+sulfate-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis.</a> Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22Swiss+roll%22%3A+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).</li>
<li>Aharoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+therapeutic+effect+of+glatiramer+acetate+on+several+murine+models+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease.</a> J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).</li>
<li>Hahm, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+transforming+growth+factor+beta+signalling+in+the+intestine+contributes+to+tissue+injury+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 49 (2), 190-198 (2001).</li>
<li>Green, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+modulation+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+adherence+to+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).</li>
<li>Dieleman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+experimental+colitis+induced+by+dextran+sulphate+sodium+%28DSS%29+is+characterized+by+Th1+and+Th2+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines.</a> Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ונדרבילט IACUC.

פרוטוקול זה יכול להיות שונה למודל פגיעה חריפה, פגיעה לתקן או פציעה כרונית תהליכים הגס. פגיעה חריפה שינוי: מודעה DSS טיפול lib עבור 4-6 ימים ואחריו להקריב מיידית פגיעה, שינוי ותיקון: פגיעה עם 4-6 ימים של טיפול DSS וא...

<table><tbody><tr><td>Dextran Sulfate Sodium Salt</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>9011-18-1</td><td>משקל מולקולרי 40,000-50,000</td></tr><tr><td>פורמלין פוספט במאזן pH בריכוז 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>NDC 57319-474-06</td><td></td></tr><tr><td>קסטות TISSUE PATH Macrosette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15182706</td><td></td></tr><tr><td>מזרק BD 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (Ethyl Alcohol)</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>E190</td><td>יש לדלל ל-70% עם מים מזוקקים</td></tr><tr><td>מחט הזנה ישרה 20G</td><td>VWR international</td><td>20068-612</td><td></td></tr><tr><td>מחט PrecisionGlide 27G1/2</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>מספרי ניתוח עם קצה חד/קהה</td><td>VWR international</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת Waugh</td><td>VWR international</td><td>82027-428</td><td></td></tr><tr><td>חוטי תפירה שאינם נספגים</td><td>LOOK Surgical</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>נייר בלוט Whatman</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td>לחתוך לפי הצורך</td></tr><tr><td>מסנן Cellulose Acetate (SFCA) נטול חומרים פעילי שטח של Nalgene</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06731-2</td><td></td></tr><tr><td>קליבר דיגיטלי מסיבי סיבי פחמן</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-007-958</td><td></td></tr></tbody></table>

קוליטיס דוגמנות murine באמצעות נתרן dextran סולפט (dss)

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

קוליטיס יכולה להתרחש מפני זיהומים נגיפי או חיידקי, להעליב איסכמי, או הפרעות אוטואימוניות, קוליטיס כיבית ביותר בעיקר את גרסה הגס של מחלת קרוהן - קוליטיס קרוהן. קוליטיס חריפה עשויה להציג עם הכאב התנפחות הבטן, ספיגה, שלשולים, hematochezia וריר בצואה. אנו מתחילים להבין את יחסי הגומלין המורכבים בין הסביבה, גנטיקה, תפקוד מחסום האפיתל דלקתיות מחלות מעי חיה מודלים של קוליטיס כבר חיוני בקידום ההבנה שלנו של מחלה זו. אחת מודל פופולרי כרוך להשלים את מי השתייה של העכברים עם סולפט dextran משקל מולקולרי נמוך נתרן (DSS), וכתוצאה מכך לנזק אפיתל תגובה דלקתית חזקה במעי הגס שנמשכה כמה ימים<sup&gt; 1</sup&gt;. וריאציות של גישה זו יכולה לשמש מודל פגיעה חמורה, פגיעה חריפה בעקבות התיקון, מחזורים חוזרים ונשנים של DSS וביניהם התאוששות דוגמנות מחלות דלקתיות כרוניות<sup&gt; 2</sup&gt;. לאחר טיפול של ארבעה ימים אחת של DSS 3% במי שתייה, עכברים להראות סימנים של דלקת חריפה כולל ירידה במשקל, צואה דמית, שלשול. עכברים מומתים בסיומו של מהלך הטיפול בכל נקודתיים גזור necropsy מעובדים יכול להיות &quot;שוויצרי התגלגל&quot;<sup&gt; 3</sup&gt; כדי לאפשר ניתוח מיקרוסקופי של המעי הגס כולו או רווי פורמלין כמו &quot;נקניקיות&quot; כדי לאפשר ניתוח מאקרוסקופיים. רקמות מוטבע אז פרפין, מחולק, ומוכתמת לבדיקה היסטולוגית.

Dextran נתרן סולפט (DSS) מנוהל במי השתייה הוא מודל הוקמה Murine פגיעה דלקתית חריפה של קוליטיס. פרוטוקול זה מתאר את שיטת הטיפול DSS והכנת רקמות.

קוליטיס דוגמנות Murine באמצעות נתרן dextran סולפט (DSS)

קוליטיס (דלקת המעי הגס) עלולה להיגרם מזיהומים נגיפיים או חיידקיים, מפגיעה איסכמית, או מהפרעות אוטואימוניות; הבולטות שבהן הן קוליטיס כיבית (Ulcerative Colitis) והוריאנט הקולוני של...

עכברים מקבלים 3%DSS במים במשך ארבעה ימים. בזמן שמשקל, נוכחות של שלשול ודם בצואה נרשמים מדי יום, ה-TSS מוחלף במים שעברו עיקור באוטוקלבה לאחר היום הרביעי. לאחר שלושה ימים של שתיית מים, העכברים מושמדים והמעי הגס שלהם מוסר.מדדים ושוקלים את המעי הגס. לאחר מכן, מעצבים את המעי הגס לצורת גליל שוויצרי (Swiss roll) או נקניק ובחונים אותו תחת מיקרוסקופ. מאמר וידאו זה ידגים את הקצירה והעיבוד של מעי גס במודל עכברי של קוליטיס.נוהל זה משמש לחקר קוליטיס במעבדתו של ד"ר Christopher Williams מהמחלקה לביולוגיה של הסרטן באוניברסיטת Vanderbilt לפני תחילת הטיפול ב-dextrin sulfate sodium. משקלי בסיס נמדדים לאורך מהלך הניסוי. משקלים יומיים נלקחים לאחר ששוקל את העכברים; הכין תמיסת dextrin sulfate sodium salt, או DSS, בריכוז של 3% משקל לנפח במים.על ה-DSS להיות בעל משקל מולקולרי נמוך כדי שמודל זה יהיה יעיל; הכינו מספיק תמיסת DSS למילוי בקבוק מים עבור כל כלוב עכברים, וסננו את התמיסה באמצעות מסנן צלולוז אצטט של 0.45 micrometer. החליפו את בקבוק מי השתייה בכלוב העכברים בבקבוק המכיל תמיסת 3%DSS. אם המוסד שבו אתם פועלים משתמש במערכת השקיה אוטומטית, התקינו פיות חסימה על פתחי השקיה כדי להבטיח שלעכברים לא תהיה גישה למקור מים אחר.לאחר ארבעה ימים, שוקלים שוב את העכברים כדי לכמת את ההשלכות הסיסטמיות של הקוליטיס. איבוד משקל הוא נפוץ בפגיעה חמורה, עם זאת, ייתכן שלא יהיה ניכר במשך מספר ימים נוספים באותו היום. ביום הרביעי, מחליפים את תמיסת ה-DSS במים למשך שלושה ימים נוספים כדי לאפשר התאוששות מסוימת של אפיתל המעי הגס.שלושה ימים לאחר מכן, ביום השביעי, שוקלים שוב את העכברים. לאחר מכן ניתן להוציא את המעי הגס מהעכברים שהורדמו, כפי שמוצג בסעיף הבא. כדי להוציא את המעי הגס, חשוף את הצד הוונטרלי של העכבר המורדם כדי להבטיח גישה ללא הפרעות לבטן.הרטב את הבטן לחלוטין ב-70% ethanol. אחז את קו האמצע של הבטן בעזרת פינצטה לרקמות והרם אותה. כך ניתן למתוח את העור באמצעות מספריים בעלי קצה דק.בצעו חתך בבטן כדי לחשוף את תוכן הבטן. הרחיבו את החתך עד לקצה התהליך החרב (xiphoid process) בקו האמצע, ולאחר מכן הרחיבו אותו לאורך ההיבט התחתון של שולי הצלעות משני הצדדים. זהו את המעי העקב (cecum) של המעי הדק ואת המעי הגס (colon).יש להפריד בזהירות את המעי הגס מהמסרק (mesentery) שמסביבו באמצעות דיסקציה או הפרדה עדינה. לאחר מכן, יש לחתוך את המעי הגס בעומק האגן כדי לשחרר את המעי הגס הדיסטלי מהרקטום.יש לנקוט זהירות כדי ששום עורק או וריד לא ייחתכו. כמו כן, יש לשים לב כי המעי הגס עלול להיקרע בקלות. לכן, יש להסיר בעדינות את המעי הגס מהמסרק (mesentery).בצעו חיתוך של המעי הגס בשולי ה-Colona sequel כדי לשחרר את המעי הגס הפרוקסימלי. הסירו את המעי הגס ובצעו אינטובציה ושטיפה של המעי הגס באמצעות מחט הזנה 20 gauge ומזרק 10 milliliter עם PBS קר מאוד, עד ש-EIT נקי לחלוטין מצואה. חשוב לשמור על האוריינטציה הנכונה של המעי הגס על ידי השארת הקצה הדיסטלי של המעי הגס קרוב אליכם.התחילו במדידת אורך המעי הגס באמצעות קליבר דיגיטלי. אורך המעי הגס הוא אינדיקטור נוסף לחומרת הפגיעה. קוליטיס מגבירה בצקת ומקצרת את אורך המעי הגס הכולל.בשלב זה, ניתן לעבד את המעי הגס שנאסף כנקניק (sausage) לצורך אנליזה מקרוסקופית, או להכינו כגליל שוויצרי (Swiss roll) לצורך אנליזה היסטולוגית של קוליטיס חריפה. נדגים את הטכניקות הללו בסעיפים הבאים. כדי לעבד את המעי הגס כנקניק לצורך אנליזה מקרוסקופית של המעי הגס כולו, חשוב לשמור על האוריינטציה הנכונה של המעי הגס. לכן, השאר את הקצה הדיסטלי של המעי הגס קרוב אליך.גזרו שתי פיסות של חוט תפירה שאינו נספג, אחת באורך של כאינץ' אחד והשנייה באורך של שני אינצים. השתמשו בפיסת חוט התפירה באורך שני אינצים כדי לקשור את הקצה הדיסטלי של המעי הגס קרוב ככל האפשר לשוליים, תוך שמירה על אטימה טובה. לאחר מכן, הכניסו מחט הזנה בכיול 20 gauge המכילה 5 mL של 10% buffered formalin phosphate לתוך הקצה הפרוקסימלי של המעי הגס.קשרו באופן רפוי את קצה חוט התפירה שנותר מיד פרוקסימלית לבב מחט ההזנה. כעת, אחזו את המעי הגס בחוזקה בבב מחט ההזנה והזרימו כמות מספקת של פורמלין תוך וידוא שהמעי הגס מורחב. הדקו את הקשר בחוט התפירה בעת שליפת מחט ההזנה, כך שיישאר המעי הגס המורחב והמוזרק.בדומה לנקניק, מלאו מבחנה קונית של 15 מיליליטר בפורמלין 10% בבופר פוספט, וסמנו את המבחנה. הניחו את המעי הגס בתוך המבחנה וקבעו אותו למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, שפכו את הפורמלין למכל פסולת מתאים והחליפו אותו ב-70% ethanol למשך 24 שעות נוספות.ניתן לשמור מעיים הגדיסות ב-70% ethanol ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר. כאשר אתם מוכנים לנתח את המעי הגס, הוציאו אותו מהמבחנה הקונית. חתכו את החוטים בכל קצה באמצעות סקלפל, תוך הקפדה שלא לפגוע במעי הגס.זכרו שהקצה הדיסטלי מכיל את קטע החוט הארוך ביותר. חתכו את המעי הגס לאורכו, מהקצה הדיסטלי לקצה הפרוקסימלי, כך שיהיה בצורת יריעה ארוכה. כעת ניתן לבחון את המעי הגס תחת מיקרוסקופ דיסקציה.חתכו את המעי הגס לאורכו ופרסו אותו כגיליון שטוח. גלגול המעי הגס דורש שני זוגות פינצטות וטכניקה המבוצעת בשתי ידיים. אחזו בשני הקצוות הלטראליים של שולי המעי הגס הדיסטלי באמצעות פינצטות, והמשיכו לגלגל את המעי הגס באופן רצף על ידי סיבוב ושחרור הפינצטות תוך התקדמות לעבר השוליים הפרוקסימליים, ובכך צרו ספירלה בעלת ממד שלישי או "גליל שוויצרי" (Swiss roll).אם המעי הגס נדבק לנייר הוואטמן (Watman paper), הרטב את הנייר ואת המעי הגס בכמות קטנה של PBS כדי לשמור על הצורה. אחז את הגליל בחוזקה בעזרת פינצטה ובצע חיתוך רוחבי באמצעות מחט בכיל 27.5. קבע את הגליל על ידי כיפוף המחט בעת יציאתה מהגליל.כעת, העבירו את הגליל לקסטה מסומנת לרקמות והניחו את הקסטה בצנצנת המכילה 10% buffered formalin phosphate. השאירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לצורך קיבוע הרקמה. לאחר 24 שעות, שפכו את הפורמלין והחליפו אותו ב-70% ethanol למשך ארבע שעות נוספות.ניתן לאחסן מעי גס ב-70% ethanol לזמן בלתי מוגבל בטמפרטורת החדר. מודל זה מאפשר לחוקר להוציא, לקבע ולנתח מעי גס, ובכך מאפשר ניתוח של חומרת הקוליטיס. לצורך ניתוח מאקרוסקופי של המעי הגס כולו, ניתן לעבד את המעי הגס כנקניק המוחדר בפורמלין ומרחב באופן מלא.הנקניק הפתוח צריך להישכב בצורה שטוחה. אם שיטת הנקניק בוצעה כהלכה, המעי הגס המקובע יהיה מורחב וניתן יהיה לתמרן ולצפות בקלות בכל שטח הרירית תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לצורך אנליזה היסטולוגית, ניתן לעבד את המעי הגס בשיטת Swiss roll.את הגליל מקבעים באמצעות מחט ומניחים בקסט רקמות לצורך קיבוע. כאשר הגליל נחתך ומוצמד, הוא אמור להוות פרוסה מייצגת של המעי הגס כולו אם גולגל כראוי; ניתן לצבוע חתכים של ה"Swiss roll" בהמטין ו-ASIN על מנת לקבוע את היקף הפגיעה במעי הגס. יש לזכור כי הקצה הדיסטלי של המעי הגס נמצא במרכז הגליל על גבי הזכוכית.בדוגמה זו, דלקת ונזק לקריפטות ניכרים במעי הגס שטופל ב-DSS בהשוואה לבקרת מעי גס שטופל במים. הרגע הצגנו כיצד לאסוף ולעבד מעיים גסים ממודל עכברי של קוליטיס חריפה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להיות מאורגנים היטב לפני ההקרבה.עבור העכברים, לדוגמה, יש לסמן את כל המבחנות והקסטות עבור כל עכבר, ולהכין את כל הכלים והריאגנטים כך שיהיו זמינים. בנוסף, יש לנהל רישומים מפורטים של משקל העכברים ואורך המעי הגס. לבסוף, ודאו שהקציתם מספיק זמן לתהליך העיבוד.בדרך כלל הפרוצדורה אורכת כ-15 דקות לעכבר עבור מי שאינו מנוסה, ובין שש לשמונה דקות עבור מי שבעל ניסיון רב יותר בטכניקה זו.

murine-colitis-modeling-using-dextran-sulfate-sodium-dss

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דגמים ניסיוניים של מחלות מעי דלקתיות אפשרו לנו לבחון את התגובות מורכב החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות הקשורים בפתוגנזה. באמצעות הניקוד היסטולוגית, כימות של תומכי ציטוקינים דלקתיים ופעילות myeloperoxidase, אפשר להתחיל להעריך את התגובות הללו לראות מחלות מעי דלקתיות.

חקירת דלקת מעיים במודל DSS-Induced של IBD

אנחנו מדגימים את פרוטוקול שבו ממשל של azoxymethane הסוכן genotoxic (AOM) ואחרי שלושה מחזורים של נתרן פרו דלקתי סוכן dextran סולפט (DSS) במהירות ובעקביות יוצר גידולים במעי גס בעכברים עם דמיון מורפולוגיים ומולקולרי לאלו שנראו בקוליטיס האנושי -קשור לסרטן.

דוגמנות סרטן קוליטיס-Associated עם Azoxymethane (AOM) ונתרן סולפט dextran (DSS)

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת מודל מורין המושרה על ידי כימיקלים של קוליטיס - מחלת מעי דלקתית. העכבר רשאי לצרוך תמיסת דקסטרן נתרן סולפט (DSS) למשך זמן הולם. עם הצריכה, DSS פוגע במחסום הריר ושכבת האפיתל במעי הגס, ומאפשר לחיידקי המעי להיכנס לרקמה הבסיסית - שם הם חשים על ידי תאי החיסון המקומיים כדי לתווך תגובה חיסונית מוגזמת, וכתוצאה מכך דלקת.

טכניקה ליצירת מודל מורין של קוליטיס הנגרמת על ידי דקסטרן סולפט נתרן

סרטון זה מדגים את שיטת צביעת המטוקסילין ואוזין (H&amp;E) להערכת נזק למעי הגס במודל מורין של קוליטיס הנגרמת על ידי DSS - מחלת מעי דלקתית. לאחר בידוד המעי הגס מעכבר שטופל ב- DSS וקבלת חלקים של הרקמה, צביעת H&amp;E של החלקים מסייעת לזהות את הנזק לרקמה בתיווך דלקת.

צביעת המטוקסילין ואוזין להערכת נזק למעי הגס בקוליטיס הנגרמת על ידי DSS

קוליטיס המושרה DNBS / TNBS מציע אלטרנטיבה ושיטה זולה ללמוד pathobiology של מחלות מעי דלקתיות. הפרוטוקול שנדון במאמר זה מתאר את היישום המוצלח של DNBS כדי לגרום לדלקת מעי גסה בעכברים וחולדות ומאפשר לאדם ללמוד ביסודיות את תגובות מעיים בתיווך מארחת.

מודלים DNBS / TNBS קוליטיס: מתן תובנות מחלת מעי דלקתי והשפעות של התזונה שומן

מאתר למעי הגס דיסטלי מספק מודל מאתר הסחה האנושי קוליטיס, קוליטיס בעיקר לימפוציטית קטע המעי הגס נכללו הנחל צואה.

מאתר למעי הגס הדיסטלי, מודל הרומן של הסחה קוליטיס בעכברים C57BL/6

היעדר סטנדרטיזציה לעיבוד רקמות מאתר מפחית את האיכות של ניתוח histopathological מאתר לעומת דגימות אנושי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע בדיקה histopathological מאתר מודלק, uninflamed הגס רקמות כדי להראות את הכדאיות של מערכות רובוטיות בשימוש שגרתי עבור עיבוד והטבעה דגימות אנושי.

באמצעות מערכות רובוטיות כדי לעבד ולהטביע דגימות מאתר חוקן עבור ניתוחים היסטולוגית

הפרוטוקול המוצג מתאר הסרה כירורגית נתיישב של התוספתן (טלאי caecal) בעכבר ואחריו אינדוקציה של מחלת המעי הגס מחלות הקיבה הקשורים סרטן. המודל להסרת התוספתן של murine מאפשר חקירה של התפקיד הביולוגי של התוספתן בפתוגנזה של מחלת העיכול האנושית.

מורנה הנדנדקטומיה מודל של קוליטיס כרונית הקשורים סרטן המעי הגס על ידי לוקליזציה מדויקת של תיקון Caecal

ניקוד שיטתי של דלקת מעיים באמצעות מערכת חופשית בסיוע מחשב הוא כלי רב עוצמה להשוות כמותית שינויים היסטופטולוגיים במודלים קוליטיס המאופיינת על ידי נוכחות של כיבים ושינויים דלקתיים. הערכת ניקוד קוליטיס היסטולוגית מחזקת תצפיות קליניות ומאפשרת פרשנות נתונים.

ניתוח ניקוד שיטתי עבור דלקת מעיים במודל קוליטיס נתרן סולפט הנגרמת על ידי מורין

צ'רלס טיילור וג'ון מרשל להסביר את התועלת של מודלים מתמטיים להערכת האפקטיביות של אסטרטגיה חלופית האוכלוסייה. Insight ניתנת לתוך כמה מודלים חישוביים יכול לספק מידע על הדינמיקה של אוכלוסיית יתושים התפשטות של אלמנטים transposable דרך תת המין A. gambiae. שיקולים אתיים של שחרור יתושים מהונדסים גנטית לתוך בטבע הם דנו.

חיזוי את האפקטיביות של אסטרטגיה החלפת אוכלוסייה באמצעות מודלים מתמטיים

למדו את פרוטוקול DSS ליצירת קוליטיס חריף בעכברים. השיטה כוללת מתן נתרן דקסטרן סולפט במי שתייה, מעקב אחרי משקל ודם בצואה, וכן הכנת רקמת המעי הגס לניתוח היסטולוגי.

קוליטיס דוגמנות Murine באמצעות נתרן dextran סולפט (DSS)

גלה סרטונים נוספים