שימוש ג'ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לזהות את תנאי האלקטרופורציה האופטימליים להחדרה של חומרי גמיות לתאי קו ראשוניים של פיברובלסטים עובריים של עכבר, או mfs. כדוגמה, תאי MF וחומצת הגרעין הנבחרת נטענים לתוך פלטת אלקטרופורציה בעלת 96 בארות המחוברת למערכת ה-gene Pulser MX cell, המאפשרת לבחון מספר תנאי אלקטרופורציה בהרצה אחת. לצורך ניסויי אופטימיזציה, התאים מורבים לאחר האלקטרופורציה, ונבדקים לצורך הערכת יעילות הטרנספקציה.

באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפי-פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה, ניתן לבחור את תנאי האלקטרופורציה היעילים ביותר עבור טרנספקציות עתידיות. שלום, אני אדם מקוי, מדען בכיר במחלקת ביטוי גנים במעבדות BioRad. היום נציג בפניכם פרוצדורה לזיהוי קל של תנאי האלקטרופורציה האופטימליים לטרנספקציה של שורות תאים ראשוניות.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור ביטוי גנים בתאים אלו. היום אשתמש בשלושה מספרים שונים של מעברים של mes או פיברובלסטים עובריים של עכבר. אני משתמש בתרביות עם מספרי מעברים שונים משתי סיבות.

ראשית, אראה כמה בריאות התאים חשובה; עם שורות תאים ראשוניים, אפילו ימים בודדים נוספים בתרבית יכולים להשפיע על יעילות הטרנספקציה. שנית, אני רוצה להראות שתהליך זיהוי התנאים האופטימליים הוא זהה, למרות שיעילות הטרנספקציה יורדת בתאים מבוגרים יותר. הניסוי שלכם כנראה לא יכלול תאים בגילאים שונים.

ניתן להוסיף את אותו הליך לתכנון הניסוי שלכם. אם ברצונכם להשוות ביטוי גנים בין תאי בקרה לתאים שעברו טיפול, תוכלו תחילה למצוא את התנאים המיטביים ולאחר מכן לבצע את הניסוי באמצעות התנאים שזיהיתם. לחלופין, תוכלו לבצע את האופטימיזציה ואת הניסוי במקביל.

כפי שאדגים היום, אשתמש בפלסמיד המקודד ל-GFP כדי לבחון את יעילות הטרנספקציה באמצעות ציטומטריה של זרימה. עם זאת, הליך האלקטרופורציה יהיה זהה גם אם תבצעו פעולה אחרת, כגון הכנסת irna ובחינת ביטוי גנים באמצעות real-time PCR. אז בואו נתחיל.

הפיברובלסטים העובריים של העכבר, או MEFs, המשמשים בפרוטוקול זה, הם תאים הדבקים. לכן, השלב הראשון בעבודה עם תאים אלה הוא להסירם מתחתית הבקבוק באמצעות פרוטוקולי תרבית רקמה סטנדרטיים הכוללים טריפסינציה. לאחר שהתאים התנתקו מהבקבוק, נטרלו את הטריפסין באמצעות מצע הכולל סרום ואספו את התאים למבחנות קוניות של 50 מיליליטר.

לאחר האיסוף, סובבו את התאים בצנטריפוגה עד לקבלת משקע. יש לשטוף את התאים על ידי ריסוספנזיה (Resuspension) בנפח ידוע של PBS. לאחר הריסוספנזיה המלאה, ספרו את התאים, תוך ידיעה שיהיה דרוש ריכוז של 1 מיליון תאים למיליליטר עבור ניסויי אלקטרופורציה.

חשב את מספר התאים המתאים על סמך ספירת התאים והעבר אותם למבחנה נקייה. סבב במערך צנטריפוגה כדי לשקע את התאים. לאחר מכן, הסר בזהירות את העלייה.

יש להשעות מחדש את התאים בבuffer אלקטרופורציה לריכוז של 1 מיליון תאים למיליליטר ולהוסיף 20 micrograms למיליליטר של הפלסמיד. הפלטות מחולקות ל-96 בארות עם עמודות המסומנות ב-1 עד 12 ושורות מ-A עד H; כל קבוצה של ארבע בארות, או סט בארות, חולקת זוג פלטות אלקטרודות כך שהתאים בבארות אלו חווים את אותו הפולס. לדוגמה, תאים בבארות 1A, 1B, 1C ו-1D מחוברים חשמלית בסט בארות בודד וכולם יקבלו את אותו הפולס.

סט הבא של ארבעה בארות, 2A, 2B, 2C ו-2D, יקבלו את הפולס השני עם תחילת הפרוטוקול. למרות שהפרמטרים עשויים להיות זהים, פלטת האלקטרופורציה בעלת 96 הבארות מוגדרת כך שהחצי העליון והחצי התחתון של הפלטה מחולקים. לכן, בארות 1E, 1F, 1G ו-1H בתחתית הפלטה קיבלו כולן פולס אחד. אך פולס זה נבדל מהפולס שקיבלו בארות 1A, 1B, 1C ו-1D בחלק העליון.

בניסוי זה, ייעשה שימוש בחצי מהפלטה בלבד. שלושת הבארות הראשונות בכל קבוצת בארות מכילות תאים בגילאים שונים. התאים בשורה העליונה, שורה A, עברו חמישה מעברים.

התאים בשורה B עברו תשעה מעברים והתאים בשורה C עברו 13 מעברים. שורה D מכילה רק בופר אלקטרופורציה לפני ביצוע האלקטרופורציה. מומלץ לבדוק את הפרוטוקול כדי לוודא שההגדרות נכונות.

פרוטוקול זה יספק שישה פולסים של דעיכה מעריכית, ולאחריהם שישה פולסים של גלי ריבוע. פולסי הדעיכה המעריכית עולים מ-200 volts ל-450 volts וכולם משתמשים ב-350 micro farads בלבד. זאת בשל ההתנגדות הנמוכה של באפר electroporation או פולס הגנים שבו נעשה שימוש.

פולסי גל הריבוע משתנים הן במתח והן במשך הפולס. יש להתאים את הגדרת הקיבול של המכשיר למוליכות של תערובת האלקטרופורציה. אם משתמשים בבופר בעל התנגדות גבוהה יותר לאלקטרופורציה, כגון DMEM, ניתן להשתמש באותו טווח מתחים, אך עם קיבול גבוה יותר, כגון 950 micro farads עבור פולסי דעיכה מעריכית.

אם הקיבול האופטימלי של התמיסה המגנה (buffer) שבה אתם משתמשים אינו ידוע, יהיה עליכם לשנות גם את הקיבול בתנאי האלקטרופורציה שאתם בוחנים. השלב הבא הוא טעינת 150 microliters של תערובת תאי-פלסמיד לכל באר המשמשת לניסוי זה. הבאר הרביעית בכל קבוצת בארים המשמשת לניסוי תמולא בתמיסת מגנה לאלקטרופורציה.

לאחר טעינת הפלטה, הכניסו אותה לתא הפלטות של ה-MXL וסגרו את המכסה. לאחר מכן, לחצו על pulse כדי לבצע אלקטרופורזה לתאים. המכשיר מספק את הפולסים החשמליים באופן רצפי לכל באר, בהתאם לתנאים המפורטים בפרוטוקול שנבחר.

תהליך האלקטרופורציה של כל התאים אורך מספר שניות. עם השלמת הפולס, הוצא את הפלטה מתא הפלטות. העבר את התאים מכל באר לכלי תרבית המכיל מצע גידול שחומם מראש.

תאים אלו גודלים ב-DMEM המועשר ב-10%FBS. דגימות ביקורת שלא עברו אלקטרופורציה נלקחות מתערובת התאים והפלסמיד שנותרה ונוספות לצלחות תרבית המכילות את מצע התרבית שחומם מראש, בהרכב זהה לזה ששימש את התאים שעברו אלקטרופורציה. לבסוף, יש לערבב בתנועות סיבוביות.

לאחר מכן, הקישו על הפלטה כדי להפיץ את התאים לפני השמה באינקובטור למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide, וזאת לפני ניתוח יעילות הטרנספקציה וזיהוי תנאי האלקטרופורציה המיטביים עבור הניסוי שלכם. לאחר זיהוי תנאי האלקטרופורציה האופטימליים, קיימת בחירה בין שתי שיטות אלקטרופורציה עבור ניסויים עתידיים: החוקר יכול להמשיך להעביר תאים לפלטות בעלות 96 בארות, או להעביר תאים לקובטות, דגימה אחת בכל פעם.

קיווטות יכולות להכיל רק דגימה אחת בכל פעם ודורשות נפח הגדול פי ארבעה מהנפח הנדרש לבאר אחת בלוחות של 96 בארות, אך קיווטות בודדות הן זולות יותר וקלות לשימוש כאשר נדרש מספר קטן של דגימות. מערכת ה-gene pulse או ה-MX cell תוכננה כך שניתן להשתמש באותן הגדרות אלקטרופורציה הן בלוחות והן בקיווטות הפעם. במקום תא הלוחות, השתמשו ב-mxl shock pod עבור קיווטות.

נתקו את תא הפלטה מאחורי המכשיר וחברו את ה-shock pod. מכיוון שה-shock pod מספק רק את הפולס שתוכנת עבור באר set, A, B, C, D one, ייתכן שיהיה צורך לבחור תוכנית אחרת. כדי לבחור תוכנית שנשמרה בעבר, לחצו על home.

לאחר מכן, בחרו באפשרות השלישית, user protocols. אם אתם כבר נמצאים בתיקיית המשתמש הנכונה, לחצו על enter כדי לבחור ב-user protocols וגללו למטה. כדי לסמן את התוכנית הנכונה, לחצו על enter כדי לבחור באותה תוכנית.

המכשיר מוכן כעת. לאחר בחירת התוכנית, הגדירו את הקובטות. תערובת הפלסמיד וה-MEFs מוכנה באופן דומה לזה שהוצג קודם לכן.

טען כל ואט בנפח של 0.4 סנטימטר באותו נפח שבו נעשה שימוש עבור סט בארות שלם בלוחיות בעלות 96 בארות. מכיוון שסט בארות מורכב מארבע בארות ונעשה שימוש ב-150 microliters של באפר או תערובת תאים לכל בארה, השתמש ב-600 microliters של תערובת תאי הפלסמיד לכל ואט.

לאחר מכן, הניחו את המבחנה בתא של מכשיר השוק-פוד (shock pod), ולחצו על כפתור הפולס (pulse) כדי להעביר את השוק החשמלי לתאים. לאחר האלקטרופורציה, המשיכו כבשיטת הפלטה: ערבבו את התאים, ולאחר מכן העבירו מנות (aliquots) לפלטות תרבית תאים המלאות במדיום שחומם מראש, כולל קבוצת ביקורת של בארות שלא עברו אלקטרופורציה. סובבו את הפלטה בעדינות והקישו עליה.

לאחר מכן, השאירו את התאים להתאושש במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide לפני ניתוח יעילות הטרנספקציה. נתחו את יעילות הטרנספקציה באופן איכותי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מסוג epi ובאופן כמותי באמצעות ציטומטריית זרימה; תאים שעברו אלקטרופורציה בהצלחה ומבטאים כעת את הגן GFP יופיעו בירוק תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מסוג epi, כאשר כאן מוצגת תוצאה מוצלחת טיפוסית. צפייה בתאים במיקרוסקופיית ניגודיות פאזה מאפשרת ויזואליזציה הן של תאים שעברו טרנספקציה והן של תאים שלא עברו טרנספקציה.

מוצגים כאן התאים שנחשפו לפולס אלקטרופורציה במתח הנמוך ביותר, 200 volts. התאים הם במידה רבה קונפלואנטיים בשל צפיפות התאים הגבוהה. אותו שדה ראייה תחת פלואורסצנציית epi מראה שמספר תאים מביעים את סמן ה-GFP, אך אלו מהווים רק אחוז קטן מהתאים שנראו בתמונה הקודמת ב-250 volts.

מספר התאים החיים הכולל הנצפים תחת ניגוד מופע (phase contrast) פוחת מעט תחת פלואורסצנציית epi. ניתן לראות כי מספר התאים המבטאים GFP עלה במתח הגבוה ביותר שיושם, 375 volts. עם זאת, נראים פחות תאים חיים, אך אחוז גבוה מהתאים שנותרו מבטאים GFP.

התנאי המיטב תלוי בתכנון הניסויי. בניסויים מסוימים, מספר התאים שעברו טרנספקציה הגבוה ביותר עשוי להיות המטרה המיטבית. בניסויים אחרים, אחוז הטרנספקציה הגבוה ביותר עשוי להיות המועדף.

אנו מעוניינים באחוז התאים החיוביים ל-GFP תחת כל תנאי וכיצד האחוזים משתנים עם גיל התאים. ציטומטריית זרימה יכולה לספק מידע כמותי על תוצאות הטרנספקציה תחת כל אחד מתנאי האלקטרופורציה השונים. מוצגים כאן אחוזי התאים החיוביים ל-GFP במעבר.

חמישה תאים. תחת כל אחד מ-12 תנאי האלקטרופורציה, אחוז הטרנספקציה המקסימלי היה כ-80% תחת דעיכה מעריכית במתח הגבוה ביותר. תנאי פולס שישה ו-70 תחת תנאי פולס גל ריבועי החזק ביותר שנבדק, תנאי 12, כאשר התאים הועברו תשעה פעמים לפני האלקטרופורציה.

הדפוס הכללי של אחוזי הטרנספקציה כמעט זהה, אך עם ירידה קלה מאוד באחוזי הטרנספקציה המוצגים. להלן אחוזי תאי ה-GFP בתאי מעבר 13, המראים ירידה ניכרת באחוזי הטרנספקציה ביחס לתאים הצעירים יותר. אחוזי הטרנספקציה הגבוהים ביותר היו בערך מחצית ממה שהושג עם התאים הצעירים, דבר המדגים את החשיבות של שימוש בתאים בריאים זמן קצר ככל האפשר לאחר הבידוד.

הראיתי לכם כעת כיצד להשתמש במערכת האלקטרופורציה MXL כדי לזהות את התנאים האופטימליים לאלקטרופורציה של MAPK או של קווי תאים ראשוניים אחרים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בתאים בריאים זמן קצר ככל האפשר לאחר הבידוד ולהשתמש בתנאי אלקטרופורציה התואמים לתמיסת האלקטרופורציה. זהו כל הפרוצדורה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.