Name: תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: למד בידוד ותרבות של איבר קורטי בעכברים ואלקטרופורציה של גנים זרים בתרביות אקספלנט. שיטה זו מאפשרת מחקר מולקולרי של תאי שיער ומנגנוני שמיעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות Demêmes דניאל דאגלס Cotanche ועל מאמציהם מלמד אותנו את השיטות לבידוד של האיבר של קורטי. בנוסף, אנו רוצים להודות ישמעאל Stefanov-וגנר להנדסת האלקטרודות electroporator: שרי לין עבור יצירות אמנות תורם לה אנימציה וידאו, ומתיו חנה, ג&#39;ייסון מיקר, ו קנדרה מרשל ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) להפקת וידאו. עבודה זו מומנה על ידי מענקים (R03DC010065-Parker; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-Core MEEI תמיכה עבור שמיעה מחקר) מ NIDCD.

ביום 1. עיקור וציפוי של coverslips זכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש לעקר מיקרוסקופ coverslips זכוכית החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslips מעוקרים לשתי בארות של מנה טרום מעוקרים ארבע היטב תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעיל coverslips עם 01:01 poly-L-ornithine ו laminin בתוספת סרום 20% שור עוברית (FBS) לילה ב 4 ° C. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 μL poly-L-ornithine (פתרון 0.01% המאוחסן ב 4 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 laminin μL (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​מניות פתרון מאוחסנים aliquots ב -20 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 FBS μL (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום לעקר את הכלים לנתיחה לילה 150 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בינוני תרבות סרום המכיל 10% ו 10 מ"ג / מ"ל ​​אמפיצילין. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90 מ"ל של Dulbecco השתנה הנשר בינוני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ"ל FBS (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ"ל סוס בסרום (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 אמפיצילין μL (10 מ"ג / מ"ל פתרון מניות מאוחסנים 4 ° C) </li></ol></li></ol> יום 2. בידוד של האיבר של קורטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכסה המנוע לנתיחה תזרים חיובי. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את האור UV במשך 20 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את כל המשטחים עם 70% אתנול ו לחכות 5 דקות לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף עכבר גור (P4) בבסיס מגנום foramen באמצעות מספריים ההפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לשטוף את הראש בצלחת 10 ס"מ המכיל 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האפידרמיס בעזרת להב סכין המנתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הגולגולת לאורך תפר sagittal באמצעות להב סכין המנתחים ואז לחצות forebrain. לשמור על forebrain הזנב לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את, forebrain המוח הקטן ואת גזע המוח באמצעות דיסקציה קהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את העצמות הטמפורלית (תאנה 2A), לטבול אותם בקצרה אתנול 70%, ולהעבירם צלחת 3 מ"מ המכיל HBSS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את הבולה ואת הרקמה שמסביב מפרשת petrous של העצם הטמפורלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את שבלול בצורת קונכייה (תאנה 2B) ולהפריד אותו מן המערכת הוסטיבולרית באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה של פיתוח, מבוך גרמי לא מסויד לחלוטין והוא גזור בקלות באמצעות מלקחיים. הסר את המבוך הגרמי של שבלול על ידי הפרדה זהירה החל בסוף הבסיס ומרגש apically באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצועה הספירלה ואת איבר צמוד של קורטי הוא מפותל לאורך הספירלה של כישור (איור 2C). הסר בזהירות את האיבר של קורטי על ידי הבטחת רצועה ספירלה בשעה האזור וו הבסיס באמצעות מלקחיים ההתרה זה כאשר אתה מזיז apically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בבסיס, להסיר את הרצועה ספירלה מן האיבר של קורטי באמצעות מלקחיים # 55 דק (איור 2 ד). Micro-הבידוד של האיבר של האפיתל קורטי חושית (אופציונאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האיבר האזור וו קורטי הבסיס באמצעות שני מזרקים אינסולין ½ סמ"ק עם U-100 28G מצורף לצמיתות ½ מחטים כמו מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בפסגת, להסיר את הספירלה לימבוס משורה של תאים שיער הפנימי והמשך basally (תאנה 2E-F). ציפוי האיבר של קורטי explant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון poly-L-ornithine/laminin/FBS מבארות תרבות ולהוסיף 130 μl של המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת האיבר של קורטי גזור כדי coverslip הזכוכית מצופה בתרבות היטב המזרח explant כך cilia של תאים שיער מכוונים למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום בתרבות גם באמצעות פיפטה 200 μL. ודא כי קרום basilar יוצר מגע עם מוצק coverslip הזכוכית מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 130 μL של המדיום תרבות לאיבר של קורטי בעזרת פיפטה 200 מ"ל. החלת שתי טיפות על פני השטח של האיבר של קורטי ואז לאט לאט להוסיף את נפח הנותרים לצד coverslip. ודא כי האיבר של קורטי לא לצוף בתקשורת תרבות, אבל עדיין מודבקת coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בשעה 37 ° C בנוכחות CO 5% 2. </li></ol> יום 3. Electroporation של הגן כתב לתוך איבר תרבותי של קורטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום תרבות מאיבר של התרבות קורטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 130 μL H 2 O דקות 1 ולאחר מכן להסיר בעזרת פיפטה 200 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μL של הכתב DsRed פלסמיד (2mg / מ"ל H 2 O המאוחסן ב -20 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש את האלקטרודות של electroporator באמצעות micromanipulator כך האנודהקטודה nd הם משני צדי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור דופק (27V, 30 מילישניות משך, 10 רכבות הדופק) כדי electroporate הגן כתב לתוך איבר התרבות explant קורטי. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: להפוך את הקוטביות של הדופק כדי להבטיח electroporation של transgene על modiolar וגם רצועה ספירלית צידי explant. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 130 μL של Fugene 6: פתרון ה-DNA (3 חלקים Fugene ל-DNA חלקי 2). פתרון זה אמור להיות מוכן לפני תחילת ההליך electroporation (שלב 20) באמצעות 3 התחתונה מ"ל עגול פוליסטירן המבחנה במנדף זרימה למינרית. כדי להפוך את הפתרון הזה: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.4 μL של Opti-ממ (המאוחסן ב 4 ° C) על המבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.6 μL של מגיב 6 Fugene (המאוחסן ב 4 ° C) על המבחנה. הקפד להוסיף את Fugene ישירות Opti-ממ ולהימנע ממגע ישיר עם צדדים של המבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לרגע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.0 μL כתב DsRed פלסמיד DNA גדילי כפול (המאוחסן ב -20 ° C ב-DNA 100 מיקרוגרם / מ"ל H 2 aliquots O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לרגע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לרגע 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ"ל בינוני תרבות לתרבות היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 10 ימים. </li></ol> נציג תוצאות אנו מציגים שיטה הבידוד של האיבר של קורטי מ - עכבר הלידה. ההליך יכול לשמש עכברים צעיר כמו יום עובריים 16 עד יום הלידה על 6, ובנקודה המבוך הגרמי הופך מסויד מספיק כדי להבהיר לנתיחה מסורבלת. לאחר האיבר של קורטי הוא גזור, זה עשוי להיות מצופה תרבותי או בשלמותה (איור 3) או אפיתל מיקרו מבודד חושית (איור 4). הצגנו עוד טכניקה כדי להביע את הגנים אקסוגניים באיבר תרבותי של קורטי. תרבות organotypic שימושית עבור סוגים רבים אחרים של מחקר, כגון ניתוח של איבר קורטי של ביטוי גנים באמצעות RT-PCR או הכלאה באתרו, איבר קורטי שיתוף התרבות תאים עם הגנגליון ספירלה או בתאי גזע ממקור חיצוני באמצעות מיקרו לבודד 3, או בניתוח חוץ גופית מוות שיער תא והתחדשות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"></a> באיור 1. הצלב סעיף של האיבר P4 Murine של קורטי. (א) חתך מ להפוך את הבסיס של שבלול cryosectioned המתקבל עכבר P4 ממחיש את מבנה כללי של שבלול Murine המתואר בפרוטוקול זה. התקשורת scala גובל רצועה הלולייניות stria vascularis רוחבית, הממברנה של Reissner superiorly, לימבוס ספירלה מדיאלית, ואת קרום basilar inferiorly. תיבת הצביע על האזור התרחב ב (ב) איבר קורטי ממוקם בצד מעולה של קרום basilar וכולל שורה אחת של תאים השיער הפנימיים, שלוש שורות של תאים השיער החיצונית, והתאים שלהם התומכים. קו מקווקו 1 מציין את מיקומו לאורך הממברנה basilar כי יוסר במהלך איבר זה של דיסקציה קורטי. קו מקווקו 2 מציין את מיקומו לאורך הממברנה basilar כי יוסר במהלך ההליך מיקרו הבידוד. גרין מציין תיוג immunohistochemical של calbindin, אשר תוויות תאים interdental של לימבוס ספירלה, תאים שיער שבלול, הגנגליון נוירונים ספירלה, כמו גם תאים של הרצועה ספירלה stria vascularis 7. תיוג DAPI של גרעיני הוא בכחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="איור 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"></a> איור 2. איברים של דיסקציה קורטי. תמונות מתוך וידאו המלווה של האיבר של קורטי להדגיש דיסקציה) של מערכת שיווי המשקל ואת השבלול הממוקם בתוך העצם הטמפורלית מבודדים (אדום), ב ') את המבוך הגרמי של שבלול, ג) את הרצועה ספירלה מצורף האיבר של קורטי לאחר הסרת המבוך הגרמי, ד) הסרת רצועה הלולייניות stria vascularis (אדום) של האיבר של קורטי, E) מיקרו הבידוד של האפיתל חושית מן לימבוס ספירלה (אדום), ו-F) מבודדים ספירלה לימבוס (משמאל) אפיתל סנסורי (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="איור 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"></a> איור 3. איבר תרבותי של קורטי explant. DIC התמונה מראה את איברקורטי של עכבר-P4 Atoh1 nGFP כי היה מבודד, מצופה, ותרבותי במשך חמישה ימים, כמתואר. עכבר זה כבר מהונדסים גנטית כך התאים המבטאים את הגן הפרו שיער תא homolog אטונלי 1 (aka Atoh1 Math1) התערוכה חלבון פלואורסצנטי ירוק כי הוא מקומי לגרעין 8. האיברים של קורטי מעכברים אלה תערוכה תווית ה-GFP גרעיני גרעיני כל תא שיער ולכן מאפשרים ראיה קל של האפיתל חושית באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent. הספירלה לימבוס גדול יחסית ניתן לראות לרוחב האפיתל חושית. תאים mesenchymal אשר מקורם האיבר של קורטי היגרו מן explant. התווית גרעיני כחול הוא DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="איור 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"></a> איור 4. Micro-מבודדים אפיתל תחושתי. תמונה Epifluorescent המתקבל האפיתל חושית כי כבר מבודד איבר P4 Murine של קורטי כמתואר ותרבותיים בין לילה. מיקרו לבודד נקבע אז paraformaldehyde 4% ומעובד immunolabeling 7 א שרירן אשר תוויות בתאי השיער בשבלול. הערה העדר הספירלה לימבוס יחסית גדול מן הדמות 3. התווית גרעיני כחול הוא DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="איור 5" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"></a> איור 5. Electroporation של הגן כתב DsRed לתוך איבר תרבותי של קורטי. איברים שלמים של קורטי מן הגורים P4 Atoh1-nGFP עכבר בודדו, מצופה, ו electroporated אז עם הגן כתב DsRed כמתואר ואחר כך מתחת למיקרוסקופ epifluorescent. תאים של האיבר של קורטי explant כי הביע את חלבון מהונדס כתב DsRed התערוכה תאים פלואורסצנטי אנדוגני אדום התערוכה אפיתל סנסורי פלואורסצנטי ירוק גרעיני. התאים הטרנסגניים ניתן לראות ברחבי לימבוס ספירלה אפיתל תחושתי.

<ol><li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li>
<li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li>
<li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li>
<li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li>
<li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+%28Ids%29+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li>
<li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li>
<li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li>
<li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li>
</ol>

ישנם כמה פרטים כי הם קריטיים להצלחת הליך זה. ככל שהזמן מהבידוד העצם הטמפורלית לאיבר של קורטי הדגירה, כך גובר הסיכוי כי האיברים יצרף coverslip והתוצאה בתרבויות איבר קיימא. לכן, חשוב להגביל את כמות הזמן בין לנתיחה ומיקום האיברים בחממה. הבחירה של אנטיביוטיקה היא קריטית גם, שכן אנטיביוטיקה aminoglycoside רבים ototoxic תגרום מוות של תאים שיער. אמנם עדיף לוותר על השימוש באנטיביוטיקה לגמרי, זה משאיר פתוחה את האפשרות של זיהום. לכן, אנו ממליצים על שימוש 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין ככלל להתגבר על בעיות זיהום פוטנציאליים. ההיבט המטריד ביותר של זה, הליכים אחרים לתרבות העיקרי של האיבר של קורטי, הוא הנטייה של איברים כדי לצוף מעל צלחות במהלך הדגירה. למרות תרבויות איבר צף יכול להישאר קיימא עבור 5-7 ימים, יש חסרונות של איברים culturing צף. למשל, בתרבויות איבר צף להתקפל לעתים קרובות על עצמם לאחר 4-5 ימים טיוח מיקרוסקופיה בעייתי. לאחר מכן, שלמות מבנית של איבר יכול להיות בסכנה בהשוואה לאיברים כי כבר מודבקת coverslip. מצאנו כי בטכניקות הבאות לעזור להבטיח כי האיבר של קורטי לא לצוף בתקשורת תרבות, אבל עדיין מודבקת coverslip. ראשית, זכוכית מעיל coverslips ב 01:01 polyornithine / laminin בתוספת 20% FBS כמתואר. הדגירה לילה קרא בפרוטוקול זה הזמן המינימלי כי הצלחת צריך להיות מצופה. במעבדה שלנו, אנחנו לעתים קרובות מעיל את כל הצלחות שאנו זקוקים למשך שבוע ולשמור אותם על 4 מעלות צלזיוס עד יום לפני השימוש, כאשר אנו להעביר אותם בחממה במשך הדגירה לילה. שנית, לאחר האיברים מועברים coverslips מצופה, המזרח explant כך cilia של תאים שיער הפנים כלפי מעלה. אוריינטציה זו תקל על דבקות של קרום basilar לצלחת התרבות. שלישית, להסיר את התקשורת בתוך הבאר לצרף explant אל צלחת מצופה. פעולה זו תבטיח קשר בין המנה תרבות הממברנה basilar ולשפר את היכולת של explants לדבוק הזכוכית. זה יהיה גם לסייע בשמירה על שלמות מבנית של שורות תאים שיער. לבסוף, בזהירות לטפטף 2 טיפות בינוני תרבות על פני השטח של האיבר של קורטי בעזרת פיפטה 200 קיבולת μL ואז לאט לאט למלא היטב על ידי טפטוף נפח הנותרים (של μL 130 סה&quot;כ) בצד של coverslip. חשוב לעבוד במהירות כדי להבטיח את הקובץ המצורף של האיבר של קורטי אל coverslip המצופה. מ חניכה של לנתיחה כדי הדגירה של explants, זה בדרך כלל לוקח 10 דקות עבור המפעיל מיומנת כדי להשלים את האיבר של ההליך בידוד קורטי. בפרוטוקול זה, אנו גם מציגים שיטה לבידוד מיקרו של האפיתל חושית מן לימבוס ספירלה של האיבר של קורטי. בהליך זה, לימבוס הספירלה הוא גזור מן האפיתל חושית באמצעות 28G ½ מחטים אינסולין ככלים לנתיחה. כתוצאה מכך מיקרו לבודד מורכב שורות של תאים השיער ואת התאים המתאימים תמיכה (איור 3). אפיתל סנסורי מבודד אז יכול להיות מתורבת, כמתואר בפרוטוקול זה. הליך זה מיקרו הבידוד צריך להיות לעומת ההפרדה האנזימטית של epithelia החושי מן הרקמה הסובבת 4. אצל יונקים, כמו גם מינים שאינם יונקים כגון תרנגולות, עיכול thermolysin שיווי המשקל של האיברים תוצאות מבודדים בבידוד של epithelia חושית מתאי מרתף mesenchymal 4. ב עכברוש שבלול, התוצאות thermolysin העיכול בהפרדה הרכס אפיתל יותר, רכס אפיתל פחותים epithelia חושית מלווה מן הקרום המרתף 5. עם זאת, לא ברור אם אפיתל סנסורי שבלול יכול לצרף את הצלחות בלי מצופים בתאים mesenchymal הנלווים. בעוד הן את שיטת בידוד מכני מיקרו עיכול אנזימטי שיטה לגרום להפרדת epithelia החושי מן לימבוס ספירלה, היתרונות של דיסקציה מיקרו לבודד את פני העיכול thermolysin לכלול בפרוטוקול קצר יחסית, ריאגנטים זול, מתח פוטנציאלי פחות explant בשל ההשפעות האנזימטית של העיכול. בנוסף, קרום המרתף נותר ללא שינוי בגישה זו, אשר עשוי לשפר את הקשר של האפיתל חושית הצלחת תרבות. החסרונות של שיטה זו כוללים את הצורך לפתח את הכישורים לנתיחה זה עדין נזק מכני פוטנציאל האפיתל חושית הנובע דיסקציה מיקרו. כדוגמה השירות של הליך זה, אנו גם מציגים דוגמה אחת לשימוש של איבר שלקורטי תרבויות; electroporation של גנים ממקור חיצוני לתוך התרבות explant. ההליך electroporation שתוארו לעיל מבוסס על שיטות קודמות של איבר electroporation קורטי. יש לציין, נג ו גאו (2000) לתאר את electroporation של איברים עכברוש מבודד של קורטי שבו explants מוחזקים מקום electroporation ידי חריץ יצוק של agarose ו מצופה מכן על קולגן שקופיות מצופה 8-LabTek היטב במדיום סרום ללא 2. היתרון של הגישה שלהם היא כי האיברים מכוונים כך משטחים העליון של explants פני הקתודה, אשר אמור תיאורטית לגרום הפצה גם של תאים electroporated ברחבי explant. בידיים שלנו לעומת זאת, השיטה שאנחנו מתארים שיפור על הליך זה, כי האיבר של קורטי נשאר מודבקת coverslip לאורך ההליך ובכך להפחית את המניפולציה של explant לאחר electroporation. בנוסף, אחוז גבוה יותר של איברים של קורטי נשאר קשור coverslips בשיטה זו המוצגים. השיטה שלנו נלקח ג&#39;ונס, et al. (2006) אשר משתמשת תוספת של מגיב 6 Fugene כדי להגביר את היעילות של ביטוי גנים לאחר electroporation. בפרוטוקול Jones et al. (2006), איברים הם electroporated, מודגרות במשך 5 דקות עם 100 μL של מגיב 6 transfection Fugene, ו 6 מצופה. השיטה שלנו שונה בשימוש יחס 3:02 של מגיב 6 Fugene ל-DNA פלסמיד, אשר מצאנו אמפירית לתת ביטוי מהונדס אופטימלי עם רעילות איבר מינימלי. אנחנו לא משתמשים חי Fugene מגיב 6, אשר עלולה לגרום לרעילות של תרבויות. תצורת אלקטרודה בפרוטוקול שלנו, כמו גם ג&#39;ונס et al. (2006), התוצאה היא ביטוי גנים העיקרי או הספירלה או לימבוס אפיתל סנסורי תלוי בעמדה של הקתודה. אמנם ישנם תאים חיובי DsRed בצד הרחוק של התרבות לקתודה, יש ריכוז גבוה של תאים מהונדס קרוב הקתודה. כדי להבטיח ביטוי מלא של transgene בשני צידי האיבר של קורטי explant, הזרם יכול להיות הפוך לרכבת הדופק השני על ידי היפוך פשוט מוביל. פרוטוקול התוצאות המוצגות ביטוי חזק של transgene לאורך האיבר של קורטי (איור 5).

<table><tbody><tr><td>כיסויות זכוכית למיקרוסקופ</td><td>DYNALAB Corporation</td><td>2010</td><td>קוטר 10mm, מעגל #1, עובי 1mm, אונקיה אחת</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים עם 4 טבעות</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td>צלחת תרבית תאים סטרילית 35 X 10 mm עם 4 טבעות פנימיות</td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>תמיסה 0.01%</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354232</td><td>מיוצר בעכבר</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (Fetal Bovine Serum)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-095</td><td>מאושר (Qualified)</td></tr><tr><td>מספריים לניתוח</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td>ישרים, חד-קהה, אורך 5&quot;</td></tr><tr><td>להב סקאלפל #11</td><td>BD Biosciences</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה Dumoxel #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה עדינה Dumostar #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>מדיום Eagle משופר של Dulbecco&amp;rsquo;s (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>10564-011</td><td>גלוקוז גבוה</td></tr><tr><td>סרום סוס</td><td>Invitrogen</td><td>2605088</td><td>מושבת בחום</td></tr><tr><td>מלח נתרק של Ampicillin</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td>מקרין</td></tr><tr><td>מזרק אינסולין במינון נמוך &amp;frac12; cc</td><td>BD Biosciences</td><td>329465</td><td>U-100 28G&amp;#189;</td></tr><tr><td>ריאגנט טרנספקציה Fugene 6</td><td>Roche Group</td><td>11-815-091-001</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה פוליסטירן</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-5A</td><td></td></tr><tr><td>מCב זרימה למינרית</td><td>The Baker Company (Stanford, ME)</td><td>Model SG603a</td><td>SterileGARD III&lt;br/&gt;Advanced Class II&lt;br/&gt;ארון בטיחות ביולוגית</td></tr><tr><td>מדיום Opti-MEM I עם סרום מופחת</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד רפורטר</td><td>Clontech Laboratories</td><td>632539</td><td>pCMV DsRed-Express 2</td></tr><tr><td>אלקטרופורטור</td><td>Bio-Rad</td><td>165&amp;#8211;2662</td><td>BioRad Gene Pulser Xcell</td></tr></tbody></table>

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר murine של קורטי.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

ב כל היונקים, אפיתל סנסורי לאודישן ממוקם לאורך האיבר של קורטי מתפתלת השוכן בתוך שבלול בצורת קונכייה של האוזן הפנימית (איור 1). תאים שיער של שבלול פיתוח, שהם תאים mechanosensory של מערכת השמיעה, מיושרים בשורה אחת של תאים שיער הפנימי שלושה (בבסיס לאמצע פונה) עד ארבעה (בתורו apical) שורות של תאים השיער החיצונית כי תוחלת אורך האיבר של קורטי. תאים שיער transduce קול-Induced תנודות מכניות של הממברנה basilar לאימפולסים עצביים שהמוח יכול לפרש. רוב המקרים של אובדן שמיעה sensorineural נגרמים מוות או תפקוד לקוי של תאים שיער שבלול. כלי חיוני יותר ויותר מחקרים שמיעתי הוא בידוד בתרבות במבחנה של explant האיבר 1,2,9. מבודדים פעם, explants עלול להיות מנוצל במספר דרכים על מנת לספק מידע בנוגע נורמטיבית, חריג, או הפיזיולוגיה טיפולית. התבטאות גנים, תנועתיות stereocilia, התא ביולוגיה מולקולרית, וכן גישות הביולוגי התחדשות התאים השיער הם דוגמאות של יישומים ניסיוני של איבר explants קורטי. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי מעכברים הילוד. הווידאו הנלווה כולל כיוונים בשלבים עבור בידוד של העצם הטמפורלית מן הגורים העכבר, ובידוד הבאות של שבלול, רצועה ספירלית, ועל איבר קורטי. מבודדים פעם, האפיתל חושית יכול להיות מצופה תרבותי במבחנה בשלמותו, או כמו גזור נוספת מיקרו לבודד כי חסרה את הספירלה לימבוס ונוירונים ספירלה גנגליון. באמצעות שיטה זו, explants העיקרי יכול להישמר במשך 7-10 ימים. כדוגמה השירות של הליך זה, האיבר של קורטי explants יהיה electroporated עם הגן כתב אקסוגניים DsRed. שיטה זו מספקת שיפור פני שיטות אחרות שפורסמו משום שהוא מספק כיוונים לשחזור, חד משמעי, ועל בשלבים עבור הבידוד, microdissection, התרבות העיקרית של האיבר של קורטי.

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

בכל היונקים, האפיתליום החושי של השמיעה ממוקם לאורך איבר קורטי (organ of Corti) הספירלי, השוכן בתוך השבלול (cochlea) בעל צורת קונכייה של ה...

שלום, אני מארק פארקר. ברוכים הבאים למעבדת איטון פיבודי בבית החולים למספר עיניים ואוזניים של מסצ'וסטס (Massachusetts Eye and Ear Infirmary) בבוסטון, מסצ'וסטס. היום נציג פרוטוקול לבידוד ותרבית ראשונית של האיבר הימי של kti.פרוטוקול זה הוא בסיסי בעבודתנו כיוון שהוא מאפשר ניתוח in vitro של האיסשמי, האי החיוני לשמיעה. כדי להדגיש את התועלת בגישה זו, נדגים גם את אחד השימושים הרבים של האיברים במעבדתנו: אלקטרופורציה של גנים אקסוגניים לתוך השבבים המגודלים. נתחיל בעבודה.מתקווי הפרוצדורה הם כדלקמן: עכברים רך-ולד יעברו עקירה של הראש, ועצמות הרקה שלהם יוסרו באמצעות דיסקציה לא חודרנית (blunt dissection). לאחר מכן, השבלול יבודד מעצם הרקה באמצעות דיסקציה לא חודרנית. המבוך העצמי של השבלול ייפתח לאחר מכן באמצעות פינצטה, והרצועה הספירלית תוסר מהמודיוס הפנימי של השבלול.לבסוף, הרצועה הספירלית תופרד מאיבר קורטי (organ of Corti) באמצעות פינצטה; ניתן לראות שורות שקופות של תאי שערה המשתרעות לאורך איבר קורטי. חלק מממברנת ה-RISE, שנקרעה במהלך הסרת הרצועה הספירלית, נראה לאורך הצד המודולרי. כדוגמה לתועלת של הליך זה, תרביתו שתלי איבר קורטי למשך 24 שעות, ולאחר מכן יבצעו בהם אלקטרופורציה עם גן דגל פלואורסצנטי אקסוגני.השלבים הראשוניים של פרוצדורה זו כוללים את הכנת פלטות התרבית. הניחו כיסוי זכוכית סטרילי שאוחסן ב-70% ethanol בתוך שתי בארות של צלח תרבית תאים בעל ארבעה טבעות שעבר סטריליזציה מראש. שימוש בשתיים בלבד מתוך ארבע הבארות יגביל את משך הזמן שבו התרביות נמצאות מחוץ למגש האינקובטור.את כיסויי הזריקה עם התמיסה המורכבת מיחס של אחד לאחד של poly l ornithine ולמיננין, בתוספת 20% fetal bovine serum, הניחו בתוך צלחת תרבית שבתוכה צלחת גדולה יותר בקוטר 10 סנטימטרים כדי להקל על העברתה, ולאחר מכן דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, בצעו עיקר חום לכלים לחיתוך דגימות באינקובטור בטמפרטורה של 150 מעלות צלזיוס למשך לילה.סטריליזציה של מapay עם זרימה חיובית תתבצע על ידי הדלקת תאורת UV למשך 20 דקות לפני תחילת הניתוח. סטריליזציה של מרחב העבודה בתוך מapay תתבצע על ידי ריסוס כל המשטחים ב-70% ethanol. הנח את ראשו של גור עכבר שעבר דקפיטציה בתוך צלח Petri המכיל 70% ethanol, ולאחר מכן הסר את האפידרמיס באמצעות להב סקלפל.פתחו את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי באמצעות להב סקאלפל ולאחר מכן חלקו את המוח הקדמי לשניים. שמרו את חלק המוח הקדמי להמשך הניתוח. הסירו את המוח הקדמי, את המוח הקטן ואת גזע המוח באמצעות דיסקציה קהה.שימו לב למיקומו של עצם הרקה בצורת הפרה-מטאל (parametal) בצד הלטרלי התחתון של הגולגולת. העבירו את עצמות ה-TAL לצלוחית של שלושה מילימטרים המכילה תמיסת hanks balanced salt solution סטרילית. את המשך הנתיחה יש לבצע תחת מיקרוסקופ נתיחה.הסיר כל רקמה מקיפה מעצם הרקה. אתר את השבלול (cochlea) בעל צורת הקונכייה והסר אותו ממערכת השמיעה (vestibular system) באמצעות פינצטה. בשלב זה של ההתפתחות, המבוך הגומי אינו מסויד לחלוטין וניתן לניתוח בקלות.הסיר את המבוך העצמי של השבלול על ידי הפרדה זהירה, החל מהקצה הבזאלי לכיוון הקודקוד (אפיקלי). באמצעות פינצטה, הסר בזהירות את הרצועה הספירלית ואת האפיתל החושי הצמוד אליה מה-modius, על ידי קיבוע אזור הזיז בבסיס באמצעות פינצטה ופיתול הדרגתי. תוך כדי התקדמות לכיוון הקודקוד, החל מהבסיס, הסר את הרצועה הספירלית מהאפיתל החושי באמצעות פינצטה עדינה מסוג 55.בחלק מהניסויים שלנו, יש צורך בהסרת הלימבוס הספירלי (spiral limbus) מהאפיתל החושי. בהליך בידוד מיקרוסקופי זה, איבר קורדי (organ of cordi) מבודד מהלימבוס הספירלי באמצעות שתי מזרקות אינסולין בנפח חצי סמ"ק המשמשות כפינצטות. ראשית, אזור הוו (hook region) של איבר קורדי מוסר באמצעות מזרקות האינסולין.בשלב הבא, מפרידים את ה-spiral limbus משורת תאי השער הפנימיים, החל מה-apex והתקדמות לכיוון הבסיס, בין אם מדובר במכל ה-organ of Corti עם ה-spiral limbus המחובר אליו. ניתן לתרבת את האפיתליום החושי המבודד ברמה מיקרוסקופית או את ה-spiral limbus המבודד ברמה מיקרוסקופית באופן הבא: מסירים את תמיסת הציפוי מבארים התרבית ומחליפים אותה ב-130 microliters של מצע תרבית המכיל 10% serum transfer; מעבירים את ה-organ of Corti שהופרד אל מעל הזכוכית המצופה בבאר התרבית. מצאנו כי הטכניקות הבאות מסייעות להבטיח שה-organ of Corti לא יצוף במצע התרבית אלא יישאר מקובע למסך הזכוכית.ראשית, יש לצפות את כיסיי הזכוכית כפי שתיאור. שנית, יש להסיר את המצע כדי להצמיד את ה-explan אל הכלי המצופה. פעולה זו תבטיח מגע בין כלי התרבית לבין ה-X explan.שלישית, כוון את הנתח כך שהריסונים של תאי השערה יפנו כלפי מעלה. התמצאות זו תקל על הידבקות הנתח לצCלחת התרבית. לסיום, הוסף 130 µL של מצע תרבית עם סרום באמצעות פיפטה של 200 µL, על ידי טפטוף זהיר של שתי טיפות על פני השטח של הרקמה, ולאחר מכן הוספה איטית של שאר הנפח לצד הבאר. העבר בזהירות את הנתח לאנקובטור והדגר אותו בטמפרטורה של 37 °C בנוכחות 5% carbon dioxide.ניתן לתחזק תרביות אלו למשך שבעה עד 10 ימים. קיימים יישומים רבים לאיבר המבודד מהליבה של T. דוגמאות לכך כוללות ניתוח של ביטוי גנים באמצעות R-T-P-C-R או הכלאה של NC, תרבית של איבר קורטיקלי עם תאי גנגליון ספירליים או תאי גזע אקסוגניים, או ניתוח in vitro של מוות של תאי שערה. כדי להדגים את התועלת של הליך זה, נראה לכם טכניקה אחת הנפוצה במעבדתנו להבעת גנים אקסוגניים בתרביות של ה-explan.להדגמה זו, איבר קורטי (organ of corti) המבודד יעבור אלקטרופורציה עם וקטור ביטוי המבטא באופן קבוע את הגן המדווח DS red. לאחר האלקטרופורציה, התרביות יודגרו עם רכיב transfection של few gene six למשך 24 שעות כדי לשפר את תהליך הטרנספקציה. באמצעות מערכת זו, התאים שעברו טרנספקציה יפגינו פלורסצנציה אדומה ציטופלזמית בתוך 24 שעות.ראשית, הכין תערובת ביחס של שלושה לשניים של ריאגנט טרנספקציה FU gene six ל-DNA המטרה בתוך מבחנה פוליסטירן בעלת תחתית עגולה בנפח של 3 ml. תחת מ chụp זרימה למינרית, הסר את מצע השגבילה מאיבר הבוטניקה. הוסף 130 µL של מים למשך דקה אחת ולאחר מכן הסר אותם באמצעות פיפט בקיבולת של 200 µL.בשלב הבא, הוסיפו 30 µL של פלסמיד repoter DS red, המאוחסן בתמיסת מלאי של 2 mg של DNA פלסמידי ל-mL של מים. לצורך האלקטרופורציה, אנו משתמשים במכשיר BioRad gene Pulser Excel ליצירת הפולס החשמלי. האלקטרודות הותאמו אישית על ידי בית המלאכה שלנו כדי לענות על צרכינו; האלקטרודות מורכבות מחוטי נחושת חשופים המכופפים בזווית של 90 מעלות ומהודקו לצורת משוט.הקדם את האלקטרודות של המכשיר להאלקטורציה באמצעות מיקרו-מניפולטור, כך שהאנודה והקתודה יהיו משני צידי התרבית. ייצר 10 רצפי פולסים במתח של 27 volts ובמשך 30 millisecond כדי לבצע אלקטורפורציה של הגן המדווח לתוך תרבית של אקספלאנט של איבר.בשלב הבא, הוסף 130 µL של תמיסת ה-DNA של גן FU six לאקספלן (explan), ולאחר מכן הדגר בטמפרטורה של 37 °C בנוכחות 5% CO2 למשך לילה. למחרת, הוסף שתי מיליליטר של מצע תרבית סרום לכל צלחת. ניתן לתחזק את תרביות האקספלן למשך שישה ימים או יותר לאחר 24 שעות.ניתן להוצג תאים שעברו טרנספקציה באמצעות מסנן SI שלוש על מיקרוסקופ פלואורסצנציית-אפי. הצגנו כעת שיטה לבידוד ולתרבית ראשונית של ה-organ Corte. שיטה זו עובדת עם עכברים מגיל של היום העוברי 16 ועד ליום לאחר הלידה, נקודה שבה השבלול (cochlea) הופך למספיק מסויד כדי להפוך את הניתוח למסורבל.בנוסף, הדגמנו שיטה לביטוי של גנים אקסוגניים בתוך איבר מזוקן של corde. זוהי דוגמה לסוג אחד של ניסוי שניתן לבצע על האקספלנט המזווקן. אין ספק כי קיימים שימושים רבים לטכניקה זו.זה הכל. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

primary-culture-plasmid-electroporation-murine-organ

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג'ין מערכת MXCell electroporation.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

סרטון זה מתאר את פרוטוקול האלקטרופורציה להעברת פלסמידים גדולים לאורגנואידים תלת-ממדיים במערכת העיכול כדי להוכיח את תפקודו האוניברסלי בישויות שונות, כלומר אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), סרטן המעי הגס (CRC), כולנגיוקרצינומה (CCC) ואורגנואידים של סרטן קיבה (GC).

אלקטרופורציה אורגנואידית: שיטה להעברת DNA פלסמיד לאורגנואידים במערכת העיכול

מקור: Keener, D. G., et al. אלקטרופורציה של תא בודד על פני תרביות פרוסות אורגנוטיפיות שונות של נוירונים מעוררים ומעכבים ספציפיים לכיתה של עכבר. J. Vis. Exp. (2020).סרטון זה מדגים את התהליך של אלקטרופורציה של תא בודד להחדרת DNA פלסמיד לתאי עצב בתוך תרביות פרוסות היפוקמפוס של עכברים. ההליך כולל מיקום מדויק של פיפטה, התאמות לחץ ופולסים של אלקטרופורציה כדי לחלחל באופן זמני את הממברנה העצבית, מה שמקל על העברת גנים. לאחר האלקטרופורציה, הפרוסה מודגרת כדי לאפשר ביטוי של הגן המבוקש.

ביטוי גנים באמצעות אלקטרופורציה של תא בודד בתרביות פרוסות היפוקמפוס של עכברים

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית של גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים במגוון תרביות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הטכניקה שימושית לבחינת תפקודים מולקולריים ופיזיולוגיים ספציפיים של נוירונים, כולל מנגנונים אוטונומיים של תאים ואינטראקציות בין חלבונים טרנססינפטיים.

אלקטרופורציה של תא בודד בתרביות פרוסות מוח אורגנוטיפיות: טכניקה במבחנה להעברת פלסמידים בתוך נוירונים ממוקדים בפרוסות היפוקמפוס במוח

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי.  אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

כאן אנו מציגים פרוטוקול, שנועד להשתמש כלים גנטיים כדי לתמרן את הפעילות של הושלתי בקליפת המוח הפנימי מושתלים לתוך הקליפה של עכברים לידתיים מוקדם.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

הפרוטוקול הנוכחי מעדכן פרוטוקולים קודמים ומשלב גישות פשוטות יחסית לגידול צמחי שבלול באיכות גבוהה. זה מספק איסוף נתונים אמין והדמיה ברזולוציה גבוהה בתאים חיים וקבועים. פרוטוקול זה תומך במגמה המתמשכת של חקר תאי האוזן הפנימית.

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

כאן, אנו מציגים את המניפולציה הגנטית החריפה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים על ידי אלקטרופורציה. מודלים אלה של אורגנואידים בקליפת המוח נוחים במיוחד להזרקה מכיוון שניתן לזהות בקלות מבנים דמויי חדרים לאחר החיתוך, מה שמאפשר חקירה תפקודית של התפתחות קליפת המוח האנושית, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה קליפת המוח.

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

למד בידוד ותרבות של איבר קורטי בעכברים ואלקטרופורציה של גנים זרים בתרביות אקספלנט. שיטה זו מאפשרת מחקר מולקולרי של תאי שיער ומנגנוני שמיעה.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

גלה סרטונים נוספים