הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

סרטון זה מדגים הליך להרכבת עוברי דרוזופילה להדמיית ציטים המו. המקרופאגים העובריים שלהם. עוברים מונחים על ידי זבובים על צלחות אגר מיץ תפוחים בכלוב הטלה למשך הלילה.

למחרת מסירים את לוחית החקלאות והעוברים נשטפים מהצלחת החקלאית למסננת תאים לאחר שטיפות נוספות להסרת פסולת. מסננת התאים המכילה עוברים טובלת באקונומיקה כדי לצפות את העוברים. לאחר שטיפת האקונומיקה, העוברים מועברים לטיפה של מים.

לאחר מכן נשאבת טיפת המים והעוברים מכוסים בשמן הלו פחמן. עוברים מבוימים כראוי עם ציטים גלויים מועברים לפטרי לכל ממברנה בין שני פתקי כיסוי מודבקים ומיושרים בזהירות בשמן. לאחר מכן מניחים החלקת כיסוי שלישית על העוברים ומודבקים למקומה עם לכה לציפורניים.

כעת ניתן לדמות את התנועתיות של ציטים המו בתוך העובר באמצעות החלקת הכיסוי העליונה ביותר במיקרוסקופ. היי, אני ג'ניפר זאיד ממעבדת בריאן סטרם בחטיבת ההשכרה של סיאול וביופיזיקה מולקולרית בקינגס קולג' בלונדון. ואני איאן אוונס ממעבדת העץ במחלקה לביולוגיה וביוכימיה באוניברסיטת באת'.

היום נראה לכם נוהל להרכבה של ג'וזף בריו לתמונה חיה, אתר ההמו, המקרופאגים העובריים של אורגניזם זה. אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור את הפיזור ההתפתחותי ותגובת הרוח לתאי החיסון החשובים הללו ואת מנגנון השלד הציטו-שלד שהם משתמשים בו כדי לבצע תהליכים אלה. אז בואו נתחיל.

התחל בהליך זה על ידי השגת קווי TROs OAL מתאימים המכילים דרייברים ספציפיים ל-hemo cyte gal four ומדווחים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית תחת שליטת UAS. כאן, נחש גל ארבע משמש להנעת ביטוי של סמן גרעיני אדום פלואורסצנטי מ-UAS Red Stinger. לדיון במגוון המומלצים של דרייברים לארבעה GAL ומבנים של כטב"מים, אנא עיין בפרוטוקול הכתוב המצורף למקם 20 דרוזופילה מכל מין בכלוב הטלה.

כלוב ההטלה מורכב מפלטה חקלאית של מיץ תפוחים בנפח 55 מיליליטר המותקנת בתחתית צינור פלסטיק עם גזה המכסה את הקצה השני כדי לאפשר זרימת אוויר. לחלופין, ניתן להשתמש בפסגת פלסטיק פשוטה עם חורים. ניקוב הבסיס, אפשר לזבובים להתאקלם לכלוב ההטלה לפחות יומיים לאחר שהזבובים התאקלמו, החליפו לסורג חדש של מיץ תפוחים חם מראש ואפשרו לזבובים לשכב למשך הלילה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

למידע על איסוף עוברים בשלבים דיסקרטיים יותר, אנא עיין בפרוטוקול הכתוב המצורף. לאחר שהזבובים דגרו למשך הזמן המתאים להטלה, השתמשו בבקבוק כביסה כדי למרוח כשלושה מיליליטר מים על הצלחת. לאחר מכן, באמצעות מכחול רך, עקירת עוברים ממיץ התפוחים, ניתן לראות בקלות עוברים שנעקרו ממקומם בעין בלתי מחזיקה מסננת תאים מעל.

שופכים את המים ממיץ התפוחים לתוך מסננת התאים כדי לאסוף את העוברים. לאחר מכן מוסיפים עוד מים למיץ התפוחים. אטה. חזור על תהליך הסינון עד לאיסוף מספר העוברים הרצוי.

לאחר מכן, בעזרת בקבוק כביסה, שטפו את העוברים במסננת התאים בעזרת כ -10 מיליליטר מים. לאחר שטיפת העוברים, הניחו את מסננת התאים במכסה של מיץ התפוחים Aerate. הוסף אקונומיקה מסודרת מספיק כדי להשעות עוברים במסננת התאים כדי לצפות את העוברים.

העבירו את מסננת התאים ואת מכסה צלחת הפטרי למיקרוסקופ דיסקציה כדי לעקוב אחר קישוט העוברים. תחת תאורת שדה בהיר, הקישוט הושלם כאשר נספחי הגב התמוססו, מה שאמור להתרחש תוך שתי דקות. לאחר השלמת הקישוט, הסר את מסננת התאים המכילה את העוברים מהאקונומיקה, שוב, החזק את המסננת מעל.

השתמש בבקבוק כביסה כדי לשטוף בעדינות אך ביסודיות את שאריות האקונומיקה. מרחו רקמות מעבדה בצבע כחול על החלק התחתון של מסננת התאים כדי למחוק את המים שנותרו. אם הצבע הכחול משתנה לאקונומיקה שיורית לבנה או ורודה, המשך לשטוף וודא שכל עקבות האקונומיקה הוסרו לפני שתמשיך לשלב הבא.

הוצאת עודפי מים ממסננת התאים מקלה על איסוף העוברים בעזרת מכחול בשלב הבא. לאחר שכל האקונומיקה הוסרה מהעוברים, הניחו טיפת מים במכסה צלחת פטרי בעזרת מברשת עדינה. אסוף את כל העוברים המצופים מהמסננת והשהה אותם מחדש בטיפה.

לאחר מכן, מרחו מגבון כימי על החלק החיצוני של מסננת התאים כדי לייבש את העוברים. לאחר ייבוש העוברים, הוסיפו טיפה של שמן פחמן הילה, 700 כדי לכסות את כל העוברים. לאחר מכן הניחו טיפת שמן קטנה שנייה בסמוך לטיפה המכילה את העוברים.

בדוק את העוברים תחת מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי. זהה עוברים בשלבים מתאימים של הגנוטיפ הרצוי כדי לדמות נדידה רוחבית של ציטים. על קו האמצע הגחוני.

בחר שלב 13 עד 14 עוברים. בדוגמה זו, ציטים מזוהים על ידי הגרעינים הפלואורסצנטיים ונראים בראש ולאורך חוט העצב הגחוני וכלי הגב המתפתח כדי לדמות את תנועתיות ההמו לאחר פיזור על פני העובר, בחר עוברים בשלב 15. בשלב זה, ההמו יתפזר על פני כל העובר.

עם זאת, שלושה קווים מקבילים של חמוס צריכים להיות גלויים בצד הגחון של העובר לאחר נדידה רוחבית מקו האמצע. לאחר בחירת העוברים, השתמשו בזוג מלקחיים מעוקלים של שענים מספר חמש כדי לגרוף את העוברים שנבחרו. הקפדה לא לנקב את ממברנות הבקבוקון.

לאחר מכן מניחים את העוברים בטיפת השמן השנייה בצד התחתון של צלחת פטרי פרם לומקס בגודל 50 מילימטר. מניחים שתי טיפות קטנות של שמן Halo Caron 700 במרחק של כסנטימטר אחד זה מזה. החל פתק כיסוי על כל טיפה תחת תאורת שדה בהיר במיקרוסקופ דיסקציה.

העבירו בזהירות עד 15 עוברים באמצעות מלקחיים מעוקלים. יישור צד הגחון של העוברים כלפי מעלה ובמקביל לקצה הכיסוי. מחליק ברגע שהעוברים מיושרים בטיפת שמן קטנה ומאפשר לו להתפשט ליצירת שכבה הומוגנית בין שתי החלקות הכיסוי.

לאחר שהשמן התפשט, זה עשוי לקחת מספר דקות. בדוק שהעוברים עדיין גחוניים. יש להרים את הצד אם העוברים התגלגלו מעט.

מקם אותם מחדש עם המלקחיים. לבסוף השתמש בפינצטה מספר שלוש. הניחו החלקה שלישית על העוברים.

גישור בין שני פתקי הכיסוי שהודבקו קודם לכן. הדבק את תלוש הכיסוי הזה לכיסוי. תומכי החלקה באמצעות לק.

העוברים מוכנים כעת להדמיה. עובר SRP gal 4 Red Stinger זה הותקן עם צד הגחון כלפי מעלה ותמונות זמן-lapse נרכשו במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי Leica M 2 0 5. ציטי הוא מוצגים על ידי גרעיניהם המסומנים באדום.

הסרט מתחיל בשלב 12 עד 13 של ההתפתחות כאשר הצייטים עוזבים את הראש ונודדים במורד קו האמצע הגחוני. לאחר כשעה, הציטים מתחילים לנדוד מקו האמצע כדי להתפזר למיקומים רוחביים לאורך פני הגחון. להמשך הפיתוח.

ציטי ההמו פעילים מאוד, נודדים בכל העובר. עלינו להראות לך כיצד לפקח על עובר ג'וזף כדי לעקוב אחר התנועה או צד ההמו לחיות in vivo. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לטפל בעוברים בזהירות, במיוחד על צלחת הפטרו סלסול, כדי למנוע נזק או ברגע שהעוברים נמצאים בשמן, הם עמידים יחסית להתייבשות, אך יש להקפיד לא להלבין את העוברים זמן רב מדי בעת הסרת הקוריון.

לבסוף, על ידי הרכבה של מספר עוברים, תיתן לעצמך את הסיכוי הטוב ביותר להשיג עובר באוריינטציה המושלמת להדמיה חיה. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.