Name: הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנא Bacillus subtilis /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למדו הדמיה של תיקון נזק לדנ"א בזמן אמת בחיידקי Bacillus subtilis באמצעות שילובי GFP. פרוטוקול זה מאפשר מעקב אחר דינמיקת חלבוני תיקון אי-התאמה בחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות בני הזוג. Philina ס לי אלן ד גרוסמן עבור בתחילה הכשרה LAS ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המחברים מודים גם בני הזוג. מלאני Berkmen ו האג&#39;ימה קוביאשי לעזרה וטיפים הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי הזנק וקרנות מהמכללה, ספרות מדע אמנות מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית, נייד, ו התפתחותית באוניברסיטת מישיגן.

גידול תרביות של תאים עבור מיקרוסקופיה 1. אחד או יומיים לפני ההדמיה, להכין את B. subtilis זן המכיל את החלבון היתוך translational אתם רוצים לדמיין. סיבובים משפט 1A ו-1B צעדים יהיה צורך לקבוע אילו תנאי גידול מספק את התמונות הטובות ביותר של זן שלך. ברוב המקרים, התאים צריכים להיות צילמו במהלך שלב הצמיחה המעריכית. <ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חלק ב ' subtilis זנים (ב, זנים מסוימים הגדלים גרוע עקב שילוב של היתוך translational בין הגן של ריבית ה-GFP על מוקד אנדוגני שלה), צמיחה ראשונית יומיים לפני הדמיה הוא הכרחי עבור תמונות באיכות גבוהה. ביום הראשון, פס ב subtilis להתאמץ כדי להיות צילמו על אגר LB עם אנטיביוטיקה סלקטיבית (ים) ו דגירה לילה בשעה 30 ° C. ביום השני, לחסן 100 μl של 0.85% עם מלח מושבת יחיד לבצע שלוש דילולים סדרתי של פי 10 על צלחות אגר LB (עם אנטיביוטיקה סלקטיבית), ציפוי 100 μL של דילול כל, ואחריו הדגירה לילה בשעה 30 ° C. ביום השלישי, בחר את צלחת דילול עם צמיחה ומחוברות אור של תאים. צמיחה ומחוברות אור על צלחת תספק צמיחה בינוני עם inoculum בריא המתנע אקספוננציאלית גדל פוטנציאל להניב תוצאות הדמיה מעולה (ראה שלב 4). צעד זה שימושי במיוחד עבור הדמיה באיכות הגבוהה ביותר קרום עם כתם FM4-64. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרים ב זנים subtilis יכול פשוט להיות מיושם בינוני אגר סלקטיבי LB עבור מושבות יחיד עם מקל סטרילי יום לפני הדמיה דגירה לילה בשעה 30 ° C. למחרת, תאים על הצלחת זה יהיה מספיק כדי לשמש inoculum הדמיה (ראה שלב 4). הערה: לקבלת B. subtilis, תרבויות לילה במדיום נוזלי אינם מתאימים עקב שילוב של יצירת הנבגים ותגובות המניין, אשר יגרום תקופה ממושכת של צמיחה בפיגור שלב 1. </li></ol> 2. בבוקרו של הדמיה, מקום 10 מ"ל של מדיום 50 S7 1-3 לתוך בקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer סטרילי. 3. Resuspend התאים עד 2 מ"ל של מדיום 50 S7 מהצלחת LB אגר עם מושבות יחיד או בתאי אור ומחוברות להשיג inoculum. 4. הוסף מספיק S7 50 בינוני תא inoculum אל הבקבוק המכיל 10 מ"ל Erlenmeyer S7 50 בינוני תרבות עם צפיפות אופטית הראשונית נמדד ב 600 nm (OD 600) של ~ 0.08-0.1. בשלב זה חשוב לי לפחות אוויר של פי 10 יחס בינוני. לפיכך, אנו משתמשים 10-12.5 מ"ל של מדיום מחוסן בתוך בקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer. 5. לגדול בכל תרבות ב 30 ° C עד התרבות מגיע OD 600 ~ 0.5-0.8. אמבטיות מים רועד עדיפים עם סיבובים לדקה 150-200. תרבויות תיגר עם סוכני ה-DNA אי התאמה או גרימת נזק צריך להיות בשלב מוקדם הצמיחה המעריכית OD 600 תאים כאלה יגיעו ליעד OD 600 לתקופה נוספת של צמיחה הנדרש לטיפול (ראה לוח 1) לדוגמה, 2-aminopurine דורש שעה אחת של טיפול, ולכן תרבות שטופלו aminopurine-2 צריך להיות 600 ~ OD 0.3-0.4, כך שעה אחת של טיפול / תוצאות הצמיחה OD 600 ~ 0.5-0.8, לפיו תאים מוכנים הדמיה. לדוגמא הכנה 1. פיפטה 300 μl של תאים בתרבית לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. 2. אם הדמיה של ממברנות הסלולר הוא הרצוי, להוסיף 1:1000 דילול של קרום FM4-64 כתם (Invitrogen) לדגום כל מפתרון מ"ג / מ"ל ​​1 המניות. טיטרציה של FM4-64 עשויים להידרש כדי להשיג את אותות הקרינה הרצויה. מגוון טיטרציה טיפוסית היא 1:100, 1:1000, ו 1:10,000. 3. אפשר הדגימות לשבת בטמפרטורת החדר לתקופה של עד עשר דקות או בעוד שקופית מכינים עם agarose 1% בטווח הבינוני Spizizens 1X כמתואר להלן (ראה שלב 1 של "הכנת שקופית"). 4. אם ריכוז של התאים נדרשת, אנו מעדיפים תאים סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר עם מנגנון ואקום. תאים לאחר מכן ניתן לשטוף בעדינות מפני השטח של המסנן עם PBS, עוד חיץ מתאים או בינוני לפני להדמיה. הכנת שקופיות 1. הכן agarose 1% עם 1X Spizizens. הוסף 5 מ"ל של המניה Spizizens 10X ל 45 מ"ל ddH2O יחד עם 0.5 גרם agarose, ומיקרוגל להינמס. Agarose מותכת חמה קשה פיפטה, ביסוס agarose לא ייכנסו קצה פיפטה. Agarose צריך להיות equilibrated באמבט מים בטמפרטורה של 55-65 ° C ~ את זה כדי להזין את קצה פיפטה ללא לחיזוק בתוך טיפ. 2. צייר 20 μl של Spizizens עם agarose מומסת 1% אל קצה פיפטה. פיפטה טיפה אחת (כ 1-2 μL) של הפתרון agarose לתוך שקופית היטב (אנחנו משתמשים גם 15 שקופיות, ראה טבלה 2) כדי ליצור רדוד רפידות agarose. Agarose יהיה לגבש באופן מיידי. שקופיות חייב להיות גם מיד לפני יישום של התאים. אם כריות agarose נותרים בטמפרטורת החדר לבד, הם יכולים תוך דקות מייבשים ולהיות שמיש. רפידות agarose צריך להיות מרוכז ומלא כל טוב אבל יש גובה מינימום כדי למנוע שיבוש coverslip, אם הטיפות הן גבוהות מדי (כמו בועה) או אם המדגם מתפשט גם מעבר לגבול, פשוט לסחוב לנקות היטב עם Kimwipe ולהחיל חדש agarose כרית. 3. החל המדגם כולו 300 μl (ראה שלב 6) לשקופית, מופץ על החלק העליון של כל משטח agarose. זו כמות של תאים אמור להיות מספיק כדי לכסות את כל טוב בשקופית. 4. אפשר להחליק עמוסה התאים לשבת בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס) במשך כ עשר דקות. צעד זה יאפשר את התאים להתיישב על כרית agarose להיות נייח ומוכן הדמיה. עבור צרכים מיוחדים בטמפרטורה זו ייתכן שיהיה צורך לשנות, למשל, בעת ביצוע הניסויים הדורשים שינוי הטמפרטורה 4. 5. לשאוב משם את המדיום עודף גם מבלי להסיר את כל הרפידות עצמם. 6. החל את coverslip לשקופית, לחיצה בחוזקה ובאופן שווה, אבל בעדינות, על פני שטח של השקופית. ודא כי להחליק כיסוי נגד לשקופית וכי להחליק לכסות לא עולה מעל השקופית. ויזואליזציה של תאים 1. רבים מיקרוסקופים פלואורסצנציה שונים יעבדו היטב. זה קריטי יש עדשה 100x טבילה שמן. המעבדה סימונס משתמש: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אולימפוס BX61 מיקרוסקופ המצויד 1,45 NA TIRFM העדשה 100x טבילה שמן אובייקטיבי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hamamatsu ORCAR 2 CCD מקורר מצלמה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lumen 200 מתכת קשת (לפני) מקור אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של ה-GFP (FITC), עירור לסנן 460-500 ופליטה 510-560 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של FM4-64 (TRITC), עירור לסנן 510-560 ופליטה 572-648. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות שנתפסו באמצעות SlideBook 4.2 (איור 1) </li></ul> 2. תביאו את התאים אל המוקד באמצעות אור לבן. 3. צלמו את התמונה באמצעות מסננים מתאים fluorophore כל אחד. נציג תוצאות תמונות נציג מוצגים (איור 1). GFP מוקדים צריך להיות מוגדר היטב, בעוד FM4-64 מכתים צריך להיות בהיר 4-7. תמונות GFP או קרום יכול להיות פסאודו בצבע עם כל צבע, על מנת לאפשר את התמונה באיכות הגבוהה ביותר שיוצגו מבלי לאבד נתונים. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: תמונות GFP נציג B. subtilis חלבונים היתוך translational. חלבוני ה-GFP מוצגים ירוק, בעוד מכתים FM4-64 ממברנה מוצג באדום. סרגל סולם לבן מציין 3 מיקרומטר (א) MutS-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: mutS - GFP (SPC), amyE: Pspac mutL (חתול)]. בנוכחותו של 600 מיקרוגרם / מ"ל 2-aminopurine ו IPTG 1 מ"מ. FM4-64 אות לא מוצגת על מנת להראות בצורה ברורה יותר MutS-GFP מוקדים (ב) MutL-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: mutL: mutL-GFP (SPC)].. בנוכחות aminopurine-2 (C) DnaX-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: dnaX: dnaX-GFP (SPC)]. (ד) RecA-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: recA: recA-GFP (SPC)] בנוכחות של 20 ng / mL mitomycin ג (E) TagC-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: tagC: tagC-GFP (SPC) ] בנוכחות של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​mitomycin ג <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טיפול / ריכוז או כמות </td><td> פונקציה </td><td> זמן הדגירה של </td></tr><tr><td> Mitomycin C (MMC) [20-150 ng / mL] </td><td> סוכן ה-DNA אלקילציה </td><td> 1 שעה </td></tr><tr><td> 2-aminopurine (2-AP) [600 מיקרוגרם / מ"ל] </td><td> גרימת אי התאמה </td><td> 1 שעה </td></tr><tr><td> Hydroxyurea (האוניברסיטה העברית) </td><td> מכלה dNTPs </td><td> 3 שעות </td></tr><tr><td> אור אולטרה סגול (UV) 20 J/m2 </td><td> תימין, תימין הדימרים ו 6-4 photoproducts </td><td> משתנה בהתאם למקור, בדרך כלל 20 שניות </td></tr><tr><td> אפור (קרינה מייננת) 5-100 Gy </td><td> גדיל שוברת פעמיים, הפסקות גדיל יחיד נזק אתרי בסיס </td><td> משתנה בהתאם למקור </td></tr></tbody></table>"&gt; בטבלה 1. סיכום של ה-DNA ואת גרימת נזק טיפולים אי התאמה <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שקופית Multitest, 15-היטב </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית מיקרוסקופ </td><td> דיג </td><td> 12-544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> דיג </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> סיגמא </td><td> M0503-2MG </td><td> mutagen, ללבוש כפפות </td></tr><tr><td> 2-Aminopurine </td><td> סיגמא </td><td> A3509-טבליות של 250 </td><td> כפפות </td></tr><tr><td> Hydroxyurea </td><td> סיגמא </td><td> H8627-25 גרם </td><td> כפפות </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> אור רגיש </td></tr></tbody></table> טבלה 2. רשימת ריאגנטים ספציפיים ציוד:

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

ניסוי וטעייה נדרשים למצוא את התנאים החשיפה לתמונות באיכות הגבוהה ביותר עבור כל זן, אנו מוצאים כי 1 אלפית השנייה מתאים תמונות אור לבן, תוך חשיפה של 100-2000 ms המתאימים GFP (FITC) ו FM4-64 (TRITC ) תמונות. זמן חשיפה ישתנו בהתאם לציוד הדמיה בשימוש. אנו ממליצים להשתמש זן אחד לכל שקופית 15 גם מיקרוסקופ הדמיה הפשוטה ביותר, כמו איכות פנקס דיפוזיה של תאים מהגבול כרית עלולה לסבך בידול זן אם זנים רבים נמצאים בשקופית אחת. איכות תמונה ישירות תלוי באיכות של כרית agarose שבו החיידקים נחים. התמ...

פתרון מתכונים ספציפיים 1: 10x S7 50 מלחים 0.5 מ מגבים 100 mM אמוניום סולפט 50 מ&quot;מ פוספט אשלגן Monobasic סנן לעקר, ועוטפים S7 50 מדיה בנייר לפני אחסון 100x מתכות 0.2 מ MgCl 2 70 mM CaCl 2 5 מ&quot;מ MnCl 2 0.1 מ&quot;מ ZnCl 2 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​תיאמין HCl 2 מ&quot;מ HCl 0.5 mM FeCl 3 * DH 2 O לנפח סופי * FeCl 3 יש להוסיף שעברה, על מנת למנוע משקעים. לאחר עיקור לסנן, לעטוף 100x פתרון מתכת בנייר כסף. S7 50 מדיה 1x S7 50 מלחים 1x מתכת 1% גלוקוז 0.1% גלוטמט 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​טריפטופן 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פנילאלנין מזוקקים H 2 O לנפח סופי Spizizens 10x (גרם / ליטר) 151.4 mM אמוניום סולפט (20 גרם / L) 803.8 mM אשלגן פוספט Monobasic (140g / L) 440.9 mM אשלגן פוספט Dibasic (60G / L) 34.0 נתרן mM ציטראט (10g / L) 16.6 mM MgSO 4 (2G / L) DH 2 O לנפח סופי סנן לעקר

הדמיה תיקון mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א bacillus subtilis</em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

שני ו אאוקריוטים פרוקריוטים להגיב נזק לדנ&quot;א באמצעות מערכת מורכבת של שינויים פיזיולוגיים. שינויים בביטוי הגנים, חלוקה מחדש של החלבונים הקיימים, ואת הרכבה של קומפלקסים חלבונים חדשים יכול להיות מגורה על ידי מגוון של נגעים דנ&quot;א תואמים בסיס זוגות DNA. מיקרוסקופ פלואורסצנטי שימש ככלי ניסיוני רב עוצמה המאפשר הדמיה לכימות תגובות אלה ואחרים נגעים דנ&quot;א כדי לפקח על שכפול ה-DNA מעמד בתוך הארכיטקטורה subcellular המורכב של התא החי. Fusions Translational בין חלבונים כתב ניאון ורכיבים של שכפול ה-DNA ואת מנגנון תיקון שימשו כדי לקבוע את הרמזים כי ה-DNA היעד לתיקון חלבונים נגעים שלהם מאותו מקור<em&gt; In vivo</em&gt; כדי להבין כיצד חלבונים אלו מאורגנים בתוך תאים חיידקיים. בנוסף, fusions תעתיק ו translational קשורה נזק היזמים ועין מתנהלת DNA חשפו שבו תאים בתוך אוכלוסיה שהפעלת תגובות דחק genotoxic. בסקירה זו, אנו מספקים פרוטוקול מפורט באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונה הרכבה של תיקון דנ&quot;א שכפול הדנ&quot;א קומפלקסים של תאים חיידקיים יחיד. בפרט, עבודה זו מתמקדת לתקן הדמיה חלבונים אי התאמה, הומולוגיים רקומבינציה, שכפול הדנ&quot;א ואת החלבונים SOS-ועין מתנהלת ב<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. כל ההליכים המתוארים כאן ניתנים בקלות מתחמי הדמיה חלבון במגוון מינים חיידקי.

פרוטוקול מפורט מתואר הדמיה בזמן אמת היווצרות של קומפלקסים לתקן דנ&quot;א<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; תאים.

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

הן פרוקריוטים והן איקריוטים מגיבים לנזק ל-DNA באמצעות מערך מורכב של שינויים פיזיולוגיים. שינויים בביטוי גנים, חלוקה מחדש של...

זני Baus TLU הנושאים חלבוני היתוך תרגומיים של תיקון אי-התאמה. חלבונים המהולכים ל-GFP נמרחים על מצע ברירה. התאים שנמרחו משמשים כאינוקולום טרי לתרבית נוזלית.מגדלים את התאים עד להגעה ל-OD 600 של 0.3 עד 0.4, ולאחר מכן מחילים טיפולים המודים אי-התאמה (mismatch) לפי הצורך, וממשיכים לגדל את התאים עד להגעה ל-OD 600 של 0.5 עד 0.8, אז מוציאים את התאים. ניתן להוסיף את צבע הממברנה FM 4 64 במידת הצורך, ומעבירים את התאים לסליידים עם פדי aros מוכנים ומניחים להם לשקוע לאחר הסרת עודפי המצע באמצעות שאיבה.מניחים זכוכית כיסוי ומבצעים הדמיה של התאים באמצעות מיקרוסקופיה. שלום, אני ד"ר Andrew Kow מהמעבדה של ד"ר Lyle Simmons במחלקה לביולוגיה מולקולרית, תאית והתפתחותית באוניברסיטת מישיגן אנו ארבור. היום נראה לכם פרוצדורה המשמשת להדמיה של חלומי תרגום (translational fusions) של חלבוני תיקון אי-התאמה של DNA, וכן חלבוני תיקון וריבוסומליים אחרים ב-bacillus subtilis.אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבוני תיקון אי-התאמה של DNA לבין החלבוני הריבוסומליים בתאים חיים של bacillus subtiles. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את זני B sublist המכילים את חלבון איחוי התרגום שברצונכם להדמות עבור חלק מהזנים.התחלה יום אחד לפני הדימוי היא מספיקה. דוגמאות לכך כוללות זנים הגדלים היטב כאשר היתוך תרגומי בין GFP לבין הגן המבוקש מוטמע במיקומו האנדוגני של הגן, כגון MU LGFP. בעת התחלה יום אחד לפני הדימוי, השתמש במקל סטרילי תחת תנאים סטריליים כדי למרוח את החיידקים על מצע LB agro סלקטיבי בצלחות.על מנת לגדל מושבות בודדות, דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C. למחרת, השתמשו במושבות כ접 접 접 접 접 접 כאינוקולום התנעה. חלק מזני B sublist דורשים שני ימי גדילה לפני ביצוע המיקרוסקופיה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה. זנים ספציפיים הדורשים שני ימי גדילה הם אלו הגדלים בצורה לקויה עקב איחוי תרגומי (translational fusion), כגון rec A GFP. ביום הראשון, זרעו את החיידקים על מצע LB AED סלקטיבי ודגרו למשך לילה.ביום השני, בצעו דילול סדרתי. ראשית, בחרו מושבה בודדת כדי להחדיר אותה ל-100 µL של תמיסת מלח (saline) בריכוז 0.85%, לאחר מכן בצעו ארבעה דילולים סדרתיים של פי עשרה. זרעו 100 µL מכל דילול של תמיסת המלח, כמו גם מהמושבה הראשונית ומתמיסת המלח, על פלטות LB אווריות המכילות אנטיביוטיקה סלקטיבית. דגרו את הפלטות למשך לילה, בדרך כלל ב-30 °C. לאחר הדגירה השנייה למשך לילה, בחרו את פלטת הדילול שבה נצפה גדילה קלה ומתמזגת (confluent) של תאים.אלו מספקים אינוקולום התנעה בריא הגדל באופן אקספוננציאלי, שעשוי להניב תוצאות דימוי מצוינות. דבר זה מועיל במיוחד עבור דימוי באיכות הגבוהה ביותר של צביעת ממברנה. בבוקר הדימוי, עם FM 4 64, העבירו 10 milliliters של מצע S seven 50 אל תוך בקבוק סטרילי של 125 milliliter.בכך יישמר יחס של לפחות פי עשרה בין האוויר למצע. השהו מחדש את התאים בעד שני מיליליטרים של מצע S seven 50 מה-lppl עם מושבות בודדות או תאים בצפיפות דומה כדי להשיג תכשיר הדבקה. הוסיפו כמות מספקת של תכשיר הדבקה של תאי מצע S seven 50 לבקבוק ארלנמאייר המכיל 10 מיליליטרים של מצע S seven 50, כך שלתרבית יהיה OD 600 ראשוני של כ-0.08 עד 0.1.בשלב הבא, גדלו כל תרבית בטמפרטורה המתאימה עבור זן תת-הרשימה B שייסור לדימות. עדיף להשתמש במכשירי טבילה במים עם ערבול במהירות של 150 עד 200 סיבובים לדקה. המשיכו בגידול התרביות עד שיגיעו ל-OD 600 של כ-0.5 עד 0.8.עבור תרביות המועמדות למתן חומרים הגורמים לנזק ל-DNA או מחוללים אי-התאמה, תכננו את הטיפול כך שסיום תקופת האינקובציה עם החומר המשנה את ה-DNA יחול במועד הגעה ל-OD 600 היעד. לדוגמה, two amino purine, אנלוג מבוסס DNA, המדמה בסיס עם אי-התאמה כאשר הוא נטמע בגנום, דורש שעת אינקובציה ומוביל להיווצרות מוקדים (focuses) של חלבוני תיקון אי-התאמה כגון mut LGFP. עם זאת, היווצרות מוקדי REC A GFP דורשת אינקובציה של שעה עם mitomycin C או עם ריאגנט אחר הגורם לנזק ל-DNA לצורך השראת שברים דו-גדיליים ב-DNA; both two amino purine and mitomycin C מתווספים.כאשר התרביות מגיעות ל-OD 600 של כ-0.3 עד 0.4, ולאחר שעה אחת של צמיחה הנדרשת עם כל אחד מהטיפולים, סביר להניח שהתרביות יגיעו ל-OD 600 של 0.5 עד 0.8 ויהיו מוכנות לדימוג. התחילו בהעברה באמצעות פיפט של 300 µL של תאי התרבית למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL. אם ברצונכם לבצע דימוג של ממברנות תאיות בדילול של 1:1000 של צבע ממברנה FM 4 64 בריכוז 1 mg/mL לכל דגימה, ייתכן שיהיה צורך בתיסתור של FM 4 64 כדי להגיע לאות הפלואורסצנציה הרצוי.טווח טיטרציה טיפוסי הוא 1:100 עד 1:10,000. השאר את הדגימות למשך עד 10 דקות או בזמן הכנת הפסחית. אם נדרש ריכוז התאים, סנן את התאים באמצעות מסנן 0.2 micrometer עם מכשיר ואקום.לאחר מכן, שטפו בעדינות את התאים מהמסנן בעזרת בופר או מצע מתאים בזמן שדגימות התאים מדגירות עם FM 4 64. הכינו 1% agros עם 1x zens על ידי הוספת 5 mL של תמיסת סטוק 10x zen ל-45 mL של מים מזוקקים, יחד עם 0.5 גרם agros, וחימום במיקרוגל להמסה.השאירו את ה-aros להגיע לשיווי משקל תרמי באמבט מים לטמפרטורה של כ-65 °C, ושאבו 20 µL של מין בעזרת טיפ של פיפט המכיל 1% aros מומס. aros שחם מדי קשה לשאיבה, ו-aros קר יתגבש ולא ייכנס לטיפ של הפיפט.בשלב הבא, השתמשו בשקופית Multitest בעלת 15 בארות והעבירו בפיפטה טיפה אחת של כ-1 עד 2 µL של תמיסת ה-aros לכל בארה בשקופית כדי ליצור פדים דקים של aros; ה-aros יתמצק באופן מיידי.את השקופיות מכינים מיד לפני יישום התאים כדי למנוע התייבשות, אשר תהפוך את השקופיות לבלתי שמישות. על פדי ה-aros להיות ממורכזים ולמלא כל באר, אך בגובה מינימלי כדי למנוע הפרעה לכיסוי השקופית. אם הטפטופים גבוהים מדי, דומים לבועות, או אם הדגימה מתפשטת מעבר לגבול הבאר, פשוט נקו את הבאר באמצעות נייר Kimwipe ויישמו פד aros חדש.כעת, כאשר השקופית מוכנה, העבירו לשקופית את כל דגימת ה-300 microliter שהופרשה קודם לכן בתוך מבחורת המיקרו-צנטריפוגה, כך שהדגימה תתפזר על החלק העליון של כל רפידת אירוסול (aeros pad). כמות תאים זו אמורה להיות מספיקה כדי לכסות כל באר בשקופית. השאירו את השקופית הטעונה בתאים בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות.שלב זה יאפשר לתאים לשקוע על פדי ה-agros ולהפוך לבלתי ניידים, ובכך להיות מוכנים לדימות בסוף דגירה של 10 דקות. שאבו את עודפי המצע מכל באר מבלי להסיר את הפדים עצמם. הניחו את לוחית הכיסוי על השקופית תוך לחיצה חזקה ואחידה, אך עדינה, על פני שטח השקופית; ודאו שלוחית הכיסוי צמודה לשקופית ושאינה מורמת מעליה.ניתן להמשיך לדמיוּן; מיקרוסקופים פלואורסצנטיים רבים יעבדו היטב. קריטי להשתמש בעדשת טבילה בשמן 100x. מעבדת Simmons משתמשת במיקרוסקופ Olympus BX 61 המצויד בעדשת יען טבילה בשמן 100x עם מפתח מספרי 1.45, המתאימה למיקרוסקופיה של החזר פנימי מלא, פלואורסצנציה או turf m.המיקרוסקופ מצויד גם במצלמת CCD מקוררת ובמקור אור מתכתי מסוג LU 200 arch. התחילו במיקוד התאים באמצעות אור לבן. השתמשו בפילטר המתאים עבור כל פלורה.מסנן ארבעה לזיהוי GFP. השתמש במסנן עירור 460 עד 500 ובמסנן פליטה 510 עד 560 לזיהוי FM 4 64. השתמש במסנן עירור 510 עד 560 ובמסנן פליטה 572 עד 648.דגמו את התמונה באמצעות המסננים המתאימים לכל קומה. בצעו זאת באמצעות תוכנת slide book 4.2. להלן מספר תוצאות מייצגות של דימות חלבון תיקון חסרי התאמה של DNA מסוג MU L, אשר חובּר תרגומית ל-GFP.תרבית הביקורת ללא טיפול של MU LGFP מראה מוקדים מינימליים, כאשר ברוב התאים קיימות רמות ציטופלזמיות בלבד של חלבון היתוך mut LGFP. עם זאת, ברוב התאים שגודלו בנוכחות של two amino purine, המדמה בסיס לא תואם כאשר הוא משולב בגנום, נצפים מוקדי GFP המעידים על כך שחלבון mutal GFP מעורב בזיהוי ובתיקון של בסיסי DNA שאינם תואמים.תוצאות דומות מתקבלות עם זן REC A GFP שגודל בנוכחות התרופה המשרה נזק ל-DNA, mitomycin C. במקרה זה, מרבית התאים מכילים מוקד של rec A GFP לאחר הטיפול ב-mitomycin C, מה שמעיד על כך שה-rec A GFP הגיב לנזק ב-DNA והחל את תהליך התיקון; ללא טיפול ב-mitomycin C, pho IR לא נראה. הרגע הצגנו לכם כיצד להדמיות של חלבוני תיקון בתאי bacillus subtilis חיים. בעת ביצוע הליך זה.חשוב לזכור להקדיש את הזמן הדרוש ולהביא את התאים למיקוד נכון, וביצוע פעולה זו עשוי לדרוש תרגול. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא הוקמה במלואה. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לזהות וקדי המושרה קרינה (רי ' ף) של תיקון חלבונים על ידי immunofluorescence כתמים של סרטן המעי הגס האנושי התאים לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

משואות bimolecular ratiometric (RBMBs) יכולות לשמש לתעתיקים בודדים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, מסירה של RBMBs לתוך תאים על ידי microporation ודימות פלואורסצנטי של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

למדו הדמיה של תיקון נזק לדנ"א בזמן אמת בחיידקי Bacillus subtilis באמצעות שילובי GFP. פרוטוקול זה מאפשר מעקב אחר דינמיקת חלבוני תיקון אי-התאמה בחיים.

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ"א Bacillus subtilis

גלה סרטונים נוספים