Name: שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ taeda ל) ומינים אחרים Conifer (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: למדו שיטה משופרת לבידוד RNA מאורן Loblolly (Pinus taeda) ומיני מחטניים אחרים. הטכניקה מיועדת להתגבר על רמות גבוהות של פנולים ופוליסכרידים המפריעים לטיהור RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לאנשים הבאים שללא עזרתה אוסף של רקמות אורן לא היה אפשרי: ד&quot;ר ג&#39;ו נעים, מאט Bryman, מיכאל בורדו, Ujwal Bagal, Huizhe ג&#39;ין, ואמנדה Bouffier.

חלק 1: קציר עץ לאחר עץ נבחרה כרותים, חשוב לעבוד בזהירות במהירות האפשרית. כמו כל סוג רקמה שונה שנקטפו, הם צריכים להציב מיד לתוך כלי משלהם חנקן נוזלי, כדי למנוע זיהום לחצות החומר המדגם. זה פרוטוקול בידוד RNA הוא מדרגי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור ברגים לתוך באורכים של מ כ ו 0.5-0.75 עם ציון מסור את הקליפה בשניים או שלושה מקומות בעקבות ציר האורך של הבורג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל עץ, העבודה קצה האזור הבקיע עד הקליפה מתחילה נפרד מן העץ ולהמשיך לעבוד את האזמל תוך משיכת חזרה על הקטע של לנבוח עד שהוא מפריד לחלוטין מן הגבעול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העצה המשנית שנקטפו עם תער קצה, על ידי גירוד צדדית יחיד לאורך ציר האורך של הבורג כי כבר מקולף. ללבוש כפפות גומי כדי למזער זיהום של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השיפה, הנמצא על הצד הפנימי של הסעיפים לנבוח, הוא לקצור בקלות על ידי מדריך מתקלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עץ תגובת נאסף מן החלק התחתון של הגפיים לאחר סימון אותם עם ספריי כדי לציין האוריינטציה המקורית שלהם לגבי הקרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איברים נחתכים לתוך גלילים של 1-2 מ 'והבקיע בצדדים מנוגדים לאורך ציר האורך פי במיקום המשוער של שני סוגי עץ תגובה: עץ מול (בצד העליון של האיבר) ועץ דחיסה (בתחתית בצד של האיבר). הנביחה מופרד הגפה כפי שתואר לעיל, אלא רק את הקליפה מכסה כל סוג של עץ תגובת מוסר בבת אחת. העצה השיפה המשני או נאסף אז כפי שתואר לעיל והושמו חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות אחרות, כמו מחטים, טיפים לירות קונוסים צעיר, ניתן לקצור ביד או באמצעות מזמרה כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות שנאספו מוקפאת בחנקן נוזלי צריך להיות ממוקם בתוך שקיות או מיכלים המסומנים מתאים ארוז בקרח יבש עבור המשלוח בחזרה למעבדה. </li></ol> חלק 2: מיל מקפיא עיבוד של דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את 6850 טחנת Spex מאגר במקפיא עם חנקן נוזלי והמקום בר השפעה לאחד צלוחיות שחיקה למלא עם חנקן נוזלי לצנן מראש. יוצקים את חנקן נוזלי ולהוסיף מדגם בקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי לא נותר עודף חנקן נוזלי בתא כרסום כי גז חנקן עודף פרקו לחלוטין לפני את הכובע בסוף יושב לאטום את החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בקבוקון טחינה לתוך המוביל ולסגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיל דגימות וודי עבור שני מחזורים של דקה 1 / מחזור בהגדרה שיעור של 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מרית חנקן נוזלי מקורר כדי להסיר את המדגם הסתובבו (קמח עץ) לתוך מבחנה כי כבר מראש מקורר והוא מכיל כמות קטנה של חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את slurry חנקן נוזלי / מדגם לתוך מיכל אחסון מקום -80 ° C עד הצורך. </li></ol> חלק 3: בידוד RNA, יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 20mL של הצפת בידוד RNA לתוך צינור פלקון 50 מ"ל כתרים ולהוסיף 400 בקצרה μL β-mercaptoethanol, מערבולת, אז חום לאמבטיה מים 60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 גרם של רקמה קפוא צינור אחד. שווי ולנער במרץ ביד ואחריו vortexing למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של כלורופורם אל הצינור להפוך בעדינות לתערובת. מניחים את הצינור על גלגל מסתובב ולאפשר סוף סוף על ערבוב במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את התערובת לתוך שפופרת 50 מ"ל ו Oak Ridge צנטריפוגות ב 12,000 (17,200 XG) סל"ד ב הרוטור קבוע זווית SS34 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית כדי צינור Oak Ridge טרי ולהוסיף חצי נפח של כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס דקה 1 וממשיכים לערבב על גלגל מסתובב במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 12,000 סל"ד (17,200 XG) בתוך הרוטור SS34 זווית קבועה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית כדי צינור Oak Ridge טרי ולהוסיף חצי נפח של כלורופורם. וורטקס דקה 1. צנטריפוגה ב 12,000 סל"ד (17,200 XG) בתוך הרוטור SS34 זווית קבועה למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית כדי צינור 50 מ"ל מהירות גבוהה פוליפרופילן. צנטריפוגה ב 10,000 סל"ד (11,900 XG) בתוך הרוטור SS34 זווית קבועה למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant לתוך צינור פלקון 50 מ"ל ומוסיפים 1 / 4 נפח 10 M פתרון LiCl כדי supernatant. בקצרה מערבולת מקום ב 4 ° C עבור משקעים בין לילה. </li></ol> חלק 4: בידוד RNA, יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SSTE חום חיץ אמבטיה 65 מעלות צלזיוס המים לפני ההתחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את המדגם LiCl-זירז לתוך צינור פוליפרופילן גלולה הרנ"א על ​​ידי צנטריפוגה ב 11,000 סל"ד ב הרוטור SS34 זווית קבועה (14,450 XG) במשך 30 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה,לשפוך וישאירו את הנוזל, ו להפוך את הצינורות על Kimwipes דקה בערך 1. פיפטה את כל supernatant הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה ב 800 μL של SSTE מחומם בעזרת פיפטה כדי לערבב היטב את הדגימות. העברת דגימת resuspended עד 2 מ"ל Ambion RNAse ללא צינורות microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מחממים על 65 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ואחריה vortexing נמרצת על מנת להבטיח resuspension להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של פנול, כלורופורם, pH8, אל צינור כל המדגם. וורטקס כל מדגם למשך 30 שניות ואז ספין microfuge בסל"ד 14,000 עבור 3 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית כדי חדש 2ml RNAse ללא צינורות Ambion microfuge, ולהוסיף נפח שווה של כלורופורם. וורטקס כל מדגם למשך 30 שניות ספין microfuge ב 14,000 סל"ד למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השלב מימית לשלב-Lock שפופרות ג'ל שהוכנו בעבר על ידי microfuging בסל"ד 11,000 במשך 2 דקות. הוסף חצי נפח של כלורופורם בעדינות פיפטה לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל"ד 11,000 במשך 5 דקות ולהעביר את השלב מימית כדי טריים 2ml Ambion RNAse ללא צינורות microfuge. </li></ol> חלק 5: RNA רטיבות ולשטוף אתנול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 אצטט μL 3.0 M נתרן, pH 4.8, ו - 1 מ"ל 100% אתנול לשלב מימית. וורטקס ו להאיץ ב -80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או לילה ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microfuge דגימות 14,000 סל"ד במשך 30 דקות ב 4 ° C, ובזהירות לשאוב את supernatant. נא לא להפריע את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כדורי RNA עם 1 מ"ל אתנול ° C 70% (v / v) -20. Microfuge בסל"ד 14000 לרגע 1 ו לשאוב את אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסירה את הפקק מעל צינורות אוויר יבש כדורי על הספסל במשך 3-5 דקות. </li></ol> חלק 6: Resuspension כימות הסופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה במים 100 DEPC שטופלו μL. מערבבים על ידי vortexing ו דגירה הצינורות על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לפני ששמים על הקרח. חזור במידת הצורך, כדי להבטיח resuspension המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת כמו דגימות אם רוצים ולעשות 50 μL של דילול 1:10 ב 10mm טריס, pH 7.5, עבור quantitation spectrophotometric. יחס ספיגת עבור 260/280 ו 260/230 הם בדרך כלל יותר מ 2.1 ו -2.2, בהתאמה. RNA התשואות בידוד נע בין 60-120μg / גרם רקמה קפוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות ידי הפעלת 1.5-2.5 מיקרוגרם RNA על 1% agarose ג'ל חיץ טה. לקבלת דוגמיות יותר קריטי, לנתח את RNA באמצעות 2100 Agilent Bioanalyzer לפי הוראות היצרן. </li></ol> נציג תוצאות: התשואות RNA בידוד מטווח כוניפאר רקמות שונות 60-120 מיקרוגרם / גרם רקמה קפוא עם דגימות וודי מניב בדרך כלל סביב 70-80g / גרם רקמה קפוא. יחסי אבחון של 260/280 ו 260/230 הן בדרך כלל יותר מ 2.1, הם אינדיקטורים טובים כי המדגם RNA ללא פנוליות משמעותי או זיהום הפחמימות, בהתאמה. דוגמאות נותחו על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose ואחריו מכתים EtBr צריך להראות שלוש להקות שונות עבור 25s, 18S, 5S ו-RNA (איור 1). קביעת stoichiometry של 18S ל -28 על agarose ג'ל הוא סובייקטיבי במקצת, גורמים כגון ריצה התנאים הג'ל, מכתים, והוא יכול לטעון מדגם כל השפעה. באופן כללי, -28: יחס 18S ייראה&gt; 1.5. עם זאת, כמה דוגמאות כוניפאר יש יחס נמוך יותר. לדוגמה, לאחר ניתוח Agilent 2100 ראינו כמה מקרים של דגימות מן כוניפאר סוגי רקמות שונים שבהם stoichiometry הוא קרוב יותר 1.2:1. לכן, לכאורה -28 נמוך: 18S stoichiometry ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose אינו מצביע בהכרח על מדגם באיכות ירודה. ליף, לירות, דגימות חרוט לעתים קרובות יהיה להקות שונות נוספות הנוכחי בשל RNAs ריבוזומלי chloroplastic. EtBr מוכתם מחומרים שאינם נודדים מן המדגם טוב או גבוה להקות מסה מולקולרית (&gt; 8-10 kb) בדרך כלל מצביעים על זיהום הדנ"א הגנומי (איור 2). מסה מולקולרית נמוכה מריחות בקרבת או מתחת הלהקה 5S והלהקה מופחת מכתים ריבוזומלי או 18S לכאורה&gt; stoichiometry -28 הוא אינדיקטור טוב כי RNA השפלה אירעה (איור 3). בסופו של Agilent 2100 electropherogram, קו הבסיס צריך להיות נמוך יחסית וחלק גדול עם פסגות המתאים 18S ו -28 RNAs ריבוזומלי שיש -28: 18S יחסי בכל מקום החל 1.2-2.0. מספר RNA Agilent יושרה (רין) ערך עשויה להיות מנבא טוב יותר של איכות רנ"א צריך להיות לפחות 7 או יותר עבור רנ"א היא לשמש להכנת מטרות microarray. איור 4 מראה טיפוסי Agilent 2100 electropherogram עבור RNA עם העצה -28: 18S יחס שווה 1.4 וערך רין של 8.6 בעוד איור 5 מראה העצה עניים RNA לאחר הכנה בסיסית גבוהה מאוד מורגש השפלה, כפי שהיא מתגלה על ידי -28: 18S raשווה ל 0.65 וערך רין של 3.4 טיו. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> 1. איור ג'ל agarose ניתוח באיכות גבוהה RNA אורן. ליין 1, חוד 1 kb סטנדרטי, ליין 2 מראה אופייני הכולל בידוד RNA מן העצה loblolly אורן המשני -28 ריבוזומלי, 18S אופיינית, ו 5S להקות -28 לעין: היחס 18S&gt; 1. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור ג'ל agarose ניתוח של מדגם RNA אורן מזוהם עם הדנ"א הגנומי. ליין 1, חוד 1 kb סטנדרטי, ליין 2, העצה RNA מדגם מראה זיהום הדנ"א הגנומי. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> 3. איור ג'ל agarose ניתוח של מדגם אורן מראה השפלה RNA וזיהום עם הדנ"א הגנומי. ליין 1, חוד 1 kb סטנדרטי, Lane2, העצה RNA מדגם מראה זיהום הדנ"א הגנומי וחמור השפלה RNA. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. Agilent 2100 electropherogram של רנ"א סך העצה מבודדים בשיטה המתוארת על העצה אורן loblolly. -28: יחס שווה 1.4 18S, ערך רין שווה 8.6 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. Agilent 2100 electropherogram של רנ"א קצה apical מסך המציג והשפלה קשות זיהום גנטי. -28: יחס שווה 18S 0.65, ערך רין שווה 3.4

<ol><li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li>
</ol>

קבלת באיכות גבוהה RNA ממינים כוניפאר יכול להיות משימה קשה בהתחשב רמות גבוהות של תרכובות פנוליות וכן פוליסכריד נמצא ברקמות וודי. החל פרוטוקול שפותח על ידי Chang et al. (1), נמצא כי מיצוי קפדני יותר לנקות צעדים להוביל לבידוד עקבית של RNA מסך מאוד איכותי של וודי וודי שונים שאינם רקמות שנדגמו מתוך מגוון רחב של מינים כוניפאר. סרט הווידאו הזה הוכיח לא רק שלנו שונה פרוטוקול RNA בידוד, אלא גם את הצעדים שננקטו באוסף בשדה וטכניקות עיבוד המשמש אורנים loblolly לפני RNA בבידוד. צעדים אלה קצירת...

<table><tbody><tr><td>בופר לבידוד RNA</td><td></td><td></td><td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-4</td><td></td></tr><tr><td>פנול, Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15509-037</td><td></td></tr><tr><td>10M LiCl</td><td></td><td></td><td>הוכן עם מים שעובדו ב-DEPC</td></tr><tr><td>בופר SSTE</td><td></td><td></td><td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td></tr><tr><td>נתרן אצטט (NaOAc) 3M pH4.8</td><td></td><td></td><td>הוכן עם מים שעובדו ב-DEPC</td></tr><tr><td>פנול-כלורופורם (pH8.0)</td><td></td><td></td><td>120mL פנול, 160mL כלורופורם שעברו טיטרציה עם מספר החלפות של 0.5M Tris-Cl pH 8.0</td></tr><tr><td>מבחנות טפלון למהירות גבוהה של Oak Ridge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-16B</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות פוליפרופילן 50mL למהירות גבוהה</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-10K</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות BD Falcon, סטריליות, עם פקק, קוניות וחד-פעמיות 50mL</td><td>VWR international</td><td>#21008-939</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#2302830</td><td></tr><tr><td>מבחנות מיקרופוג Ambion נטולות RNase, 2mL</td><td>Ambion</td><td>#AM12425</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה משופרת של בידוד rna מן אורן loblolly ( פ &#39; taeda ל) ומינים אחרים conifer

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

רקמות שבודד מינים כוניפאר, בעיקר אלה השייכים למשפחת Pinaceae, כגון אורן loblolly (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; ל), מכילים ריכוז גבוה של תרכובות פנוליות ופוליסכרידים שמפריעים טיהור RNA. בידוד איכותיים RNA ממינים אלה מחייב איסוף קפדני רקמות נהלים בתחום וכן את העסקתם של פרוטוקול בידוד RNA מורכב מספר שלבים מיצוי אורגני כדי לבודד RNA באיכות מספקת microarray גנומי וניתוחים אחרים. הבידוד באיכות גבוהה RNA מן השדה שנאספו אורן loblolly דגימות יכול להיות מאתגר, אבל כמה שינויים ברקמת תקן ונהלים RNA בידוד לשפר באופן משמעותי את התוצאות. היקף השפלה RNA כללי מגדילה אם דגימות אינם נאספים כראוי והעבירו מהשדה, במיוחד במהלך רחב היקף היבול. סך התשואות RNA ניתן להגדיל באופן משמעותי טחנת במקפיא חנקן נוזלי לפני RNA בידוד על ידי דגימות כתישה, במיוחד כאשר מגיעים דגימות מרקמות וודי. זה בעיקר בשל נוכחותם של סוכני חמצון, כגון תרכובות פנוליות, ופוליסכרידים כי הן נוכח רמות גבוהות של תמציות מרקמות של מינים מעוצים כוניפאר ביותר. אם לא יוסר, מזהמים אלו יכולות לשאת מעל המובילים לבעיות, כגון רנ&quot;א השפלה, כי בעקבות התשואות נמוכות מדגם באיכות ירודה RNA. שריד של תרכובות פנוליות, כמו גם סוכרים, יכול גם להפחית או אפילו לבטל לחלוטין את הפעילות של transcriptase הפוכה או polymerases השני הנפוץ לסינתזה cDNA. בפרט, RNA נועד לשמש כתבנית לסינתזה פעמיים תקועים cDNA בדור של ספריות cDNA, חד גדילי סינתזה cDNA עבור PCR או qPCR של, או לסינתזה של חומרים היעד microarray חייב להיות באיכות הגבוהה ביותר אם החוקרים לצפות כדי להשיג תוצאות אופטימליות. טכניקות בידוד RNA מועסקים בדרך כלל על מיני צמחים רבים אחרים הם לעתים קרובות מספיק ביכולתם להסיר מזהמים אלה מדגימות כוניפאר ולכן לא התשואה הכולל דגימות RNA מתאים מניפולציות במורד הזרם. בסרטון הזה אנחנו מדגימים שיטות לאיסוף השדה של רקמות כוניפאר, החל כריתת עץ בן ארבעים, על קצירת של השיפה, העצה המשנית, ועץ העצה התגובה. אנחנו גם להדגים פרוטוקול בידוד RNA אשר הניב באופן עקבי באיכות גבוהה של רנ&quot;א מניפולציות האנזימטית הבאים.

הצמח וברקמות רבים, כולל השיפה ו העצה של אורן loblolly (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; ל), מכילים רמות גבוהות של phenolics ופוליסכרידים שמפריעים טיהור RNA. מצגת זה דן טכניקות הקציר השדה גדל רקמות הבידוד של רנ&quot;א באיכות מספקת microarrays ומנתח גנומית אחרים.

שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ &#39; taeda ל) ומינים אחרים Conifer

רקמות שבודדו ממיני עצי מחט, ובמיוחד מאלה השייכים למשפחת האורנים (Pinaceae), כגון אור לבננה (Pinus taeda L.), מכילות ריכוז גבוה של...

התוכן הבא הופק על ידי חוקרים מאוניברסיטת ג'ורג'יה ומבית הספר וורנל למשב ומשאבי טבע. סרטון הדגמה זה מתאר את קצירת רקמת ה-xylem וה-phloem ובידוד RNA שלאחריה מ-Pinus taeda, המכונה נפוצות כ-lob lolly pine, שהוא מין העץ המחטני החשוב ביותר לייצור מוצרי יער בארצות הברית. לאחר כריתת העץ, במקרה זה עץ בן 40 שנה, הגזע הראשי נחתך לקטעים (bolts) באורך של כ-50 centimeters.לאחר מכן, מבצעים חריצים לאורכיים בגזע באמצעות מסור חשמלי במספר נקודות כדי להקל על הסרת הקליפה. בעזרת פטיש ואסמכס (שבב עץ), מרימים את הקליפה עד שניתן לקלף אותה במקטעים. לאחר מכן, מסירים ידנית את רקמת הליבה (flowing tissue), מקלפים אותה מהחלק הפנימי של מקטעי הקליפה ומטבילים אותה באופן מיידי בחנקן נוזלי.לאחר הסרת הקליפה, ניתן לאסוף את השכבה הדקה של הlylem המשני על ידי גירוד פני השטח של הbolt באמצעות להב תער חד-צדדי. רקמת הlylem המימית מועברת מיד לחנקן נוזלי. באיסוף זה, אספנו גם דגימות של reaction wood, המכונה בדרך כלל compression wood ו-opposite wood, לפני חיתוך הענפים מהגזע הראשי.ראשית מסמנים את כיוון הענף בצבע ספריי כדי שניתן יהיה לקבוע את האזורים המכילים את שני סוגי הרקמות: Opposite wood בחלק העליון של הענף ו-Compression wood בחלק התחתון. במהלך הסרת הקליפה, חורצים תחילה את הענפים באמצעות מסור שרשרה לאורך קווים המגדירים את ה-Compression wood וה-Opposite wood, והסרת הקליפה מבוצעת כפי שנעשה בברגי הגזע הראשי, למעט העובדה שמוסרת רק קליפה באזור התואם לסוג התגובה.עץ הנכרת מוסר בכל זמן נתון. בדרך כלל קשה יותר להסיר מקטעי קליפה גדולים מענפים קטנים אלה. דגימות של עץ תגובה של xylem משני נאספות באותה דרך שבה נאסף xylem משני רגיל, על ידי גירוד באמצעות להב תער וטבילה מיידית בחנקן נוזלי.שימו לב לצבע החום-אדמדם האופייני לעץ דחיסה. ראוי לציין כי איסוף ועיבוד של מספר דגימות מעץ גדול דורשים כושר אדם רב, כאשר כל אדם המעורב מבצע משימה מוגדרת כדי שכל סוגי הרקמות ייאספו בו-זמנית לסיוע בהפחתת דגרדציה של RNA; דגימות שהוקפאו בחנקן נוזלי מועברות לאחר מכן לשקיות אחסון מסומנות ומונחות על קרח יבש להובלה חזרה למעבדה. השלב הראשון שלנו הוא טחיקה של הרקמה באמצעות freezer mill מדגם specs model 68 50; בהשוואה לטחינה בעזרת מכתש ועלי, שלב זה מגדיל משמעותית את תשואת מיצוי ה-RNA מדגימות של רקמת עץ, תוך שמירה על הדגימות קרות באמצעות חנקן נוזלי.ראשית, קורעים את הרקמה לשברים קטנים יותר באופן ידני ומניחים אותם בתא הדגימה. מכניסים את התא אל הנושא, נועלים אותו במקומו, וטוחנים את הדגימה במשך שתי דקות. המוצר הסופי הוא בעל עקביות של אבקה גסה.פרוטוקול מיצוי ה-RNA הוא תהליך הנמשך יומיים. ביום הראשון, מוסיפים 2.5 גרם של רקמה קפואה לחוצץ מיצוי RNA שחומם ל-65 מעלות צלזיוס. מנערים את הדגימה בעוצמה כדי לערבב, מוסיפים נפח שווה של כלורופורם ומערבבים שוב את הדגימה באמצעות היפוך עדין.לאחר מכן, מניחים את הדגימה על גלגל סיבוב למשך חמש דקות. לאחר מכן מעבירים את הדגימה למבחנות Teflon Oakridge במהירות גבוהה ומסבבים בצנטריפוגה ברוטור SS 34 במהירות של 12,000 RPM למשך חמש דקות. את השכבה המימית העליונה מעבירים למבחנה חדשה ומוסיפים חצי נפח של כלורופורם.את הדגימה מערבלים במכשיר vortex למשך דקה אחת ומחזירים שוב לגלגל הסיבוב למשך חמש דקות. לאחר סנטריפוגה שנייה, מחלצים שוב את הפракציה המימית לתוך מבחנת פוליפרופילן המיועדת למהירות גבוהה בנפח 50 mil ומסנטריפוגים במהירות של 10,000 RPM למשך 20 דקות. כדי להסיר חלקיקים שאריתיים, שופכים את הדגימה למבחנת Falcon בנפח 50 mil ומוסיפים לדגימה נפח של רבע מליתיום כלוריד בריכוז 10 molar.מערבבים את הדגימה על ידי ניעור ומניחים אותה בטמפרטורה של 4°C למשך לילה. ביום השני, סובבים במ centri-fuge את הדגימה שבה שקע הליתיום כלוריד במהירות של 11,000 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C.שופכים את הנוזל העליון ומשליכים אותו, ומהופכים את המבחנות על גבי ניגוני מעבדה (chem wipes) למשך דקה אחת. כדי להסיר שאריות נוזל, את משקע ה-RNA, שאמור להיות גלוי, מרספנדים ב-800 µL של בופר SSTE חם שחומם מראש ל-65 °C. יש להקפיד על פיפטור למעלה ולמטה מספר פעמים ובכל שולי המשקע כדי להבטיח שכל החומר יימסן בתמיסה.בשלב הבא, העבירו את ה-RNA שהוחזר לתמיסה לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה סטרילית ל-RNA (מסוג two mil and beyond). חממו את הדגימה במשך דקה עד שתי דקות במקלח מים בטמפרטורה של 65 °C, ולאחר מכן בצעו ערבול במערבל Vortex כדי להבטיח שהדגימה הוחזרה לתמיסה באופן מלא. ניתן לחזור על פעולה זו במידת הצורך.כעת, הוסיפו נפח שווה של פנול-כלורופורם בבופר. ערבבו את הדגימה במערבל וורטקס (Vortex) למשך 15 עד 20 שניות וסבבו במיקרו-צנטריפוגה במהירות של 14,000 RPM למשך שלוש דקות. את השכבה המימית העבירו למסורת מיקרו-צנטריפוגה חדשה והוסיפו נפח שווה.את הדגימה מערבלים במיקסר (vortex) ומסובבים במיקרו-צנטריפוגה כפי שבוצע בהפקה הקודמת. עבור שלב ההפקה האורגנית הסופי, את מבחנות ה-Lock gel מסובבים תחילה במיקרו-צנטריפוגה ב-11,000 RPM למשך שתי דקות.בשלב הבא, מוסיפים את מדגם ה-RNA מההפקה הקודמת לג'ל phase lock, לאחר מכן מוסיפים חצי נפח של כלורופורם, ומערבבים את השניים על ידי פיפטינג עדין. לאחר מכן, סובבים את המדגם במיקרוצנטריפוגה במהירות של 11,000 RPM למשך חמש דקות, ומעבירים את מדגם ה-RNA השכבה המימית לנבובת ambion RNA free micro fuge חדשה. השלב הבא הוא שקיעת RNA פשוטה של המדגם, על ידי הוספת נפח של 1/10 מ-sodium acetate 3M ב-pH 4.8 ושני נפחים של 100% ethanol.את הדגימה מערבלים במיקסר (vortex), מניחים לזמן קצר במקפיא של 80- מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן מרכזים במיקרו-צנטריפוגה למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שואבים בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) ושוטפים את המשקע הלבן הקטן עם 1 ml של אתנול 70% קר מאוד; שואבים את הנוזל וחוזרים על שטיפת האתנול לאחר השאיבה הסופית. מאפשרים לאתנול שנותר להתאדות על ידי השארת המבחנות פתוחות על השולחן למשך חמש דקות.את משקעי ה-RNA מרחיפים ב-100 µL של מים מטופלי DEPC ומרחיפים באמצעות וורטקס וחימום ל-65 °C. ניתן לחזור על פעולה זו במידת הצורך. ריכוז הדגימה נקבע.היחסים הספקטרופוטומטריים 260/280 ו-260/230 מחושבים כדי להעריך את מידת זיהום החלבונים והפחמימות בדגימה. אלקטרופורזה של ג'ל 1%AGROS משמשת להערכה איכותנית של איכות הדגימה, זיהום ב-genomic DNA ודגרדציה של RNA. שלמותן של דגימות קריטיות מוערכת בהמשך באמצעות Agilent 2100 bioanalyzer לקביעת היחסים בין 28S ל-18S וערך RNA integrity number. תודה שצפיתם בסרטון שלנו על קצירת דגימות רקמה ובידוד RNA כולל מ-LOB lolly pine.האנשים הבאים אחראים לצילומי והפקת סרטון ההדרכה זה.

an-improved-method-rna-isolation-from-loblolly-pine-p-taeda-l-other

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

CDNA microarray PtGen2 פותחה ללימודי ביטוי גנים אורן...

עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray

Non-רדיואקטיבי באתרו הכלאה פרוטוקול ישים עבור נורווגיה Spruce ומגוון של מיני צמחים

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

הצלחנו לבסס שיטה לבידוד RNA מזרעי צמחים המכילים כמויות גדולות של שמנים, חלבונים ופוליפנולים, שיש להם השפעות מעכבות על בידוד RNA בטוהר גבוה. השיטה שלנו מתאימה לניטור ביטוי גנים בעלי תעתיקים ברמה נמוכה בזרעים.

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מעקב גנומית דנ א (gDNA) זיהום בדגימות ה-RNA. השיטה הציג מנצל תחל ספציפיות עבור אזור פנימי מרווח משועתקים (ITS) של גנים ribosomal DNA (rDNA). השיטה מתאים זיהוי אמין, רגיש לזיהום DNA ברוב פרוקריוטים, אאוקריוטים.

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

פרוטוקול זה מספק סקירה של נוהלי בידוד של RNA עבור פרופיל transcriptomic של הצומת לימפה רקמות חיות גדולות, כולל צעדים זיהוי, כריתה של בלוטות הלימפה של חיות המשק וחיות, דגימה גישות כדי לספק עקביות על-פני מספר בעלי חיים, שיקולים בתוספת תוצאות נציג פוסט אוסף שימור ועיבוד לניתוח RNA.

איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

כאן, אנו מציגים גישה ביולוגית ואנליזות כדי לזהות את הביטוי LINE-1 ברמה מסוימת.

ה-RNA רצף הדור הבא וצינור ביואינפורמטיקה לזיהוי קו מבוטא-1s ברמה הספציפית לוקוס

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

פרוטוקול זה נועד לבודד mRNA ריבוזומלי ספציפי לסוג התא באמצעות מודל העכבר NuTRAP.

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

אנו מתארים שיטה פשוטה אך ניתנת לשחזור מאוד לבידוד RNA חוץ-תאי מפני השטח של העלים והאפופלסט של צמחי Arabidopsis.

מדריך מדורג לבידוד וניתוח של משטח העלים ו-RNA אפופלסטי באמצעות רוזטות Arabidopsis

למדו שיטה משופרת לבידוד RNA מאורן Loblolly (Pinus taeda) ומיני מחטניים אחרים. הטכניקה מיועדת להתגבר על רמות גבוהות של פנולים ופוליסכרידים המפריעים לטיהור RNA.

שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ ' taeda ל) ומינים אחרים Conifer

גלה סרטונים נוספים