שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ ' taeda ל) ומינים אחרים Conifer

התוכן הבא הופק על ידי חוקרים מאוניברסיטת ג'ורג'יה ומבית הספר וורנל למשב ומשאבי טבע. סרטון הדגמה זה מתאר את קצירת רקמת ה-xylem וה-phloem ובידוד RNA שלאחריה מ-Pinus taeda, המכונה נפוצות כ-lob lolly pine, שהוא מין העץ המחטני החשוב ביותר לייצור מוצרי יער בארצות הברית. לאחר כריתת העץ, במקרה זה עץ בן 40 שנה, הגזע הראשי נחתך לקטעים (bolts) באורך של כ-50 centimeters.

לאחר מכן, מבצעים חריצים לאורכיים בגזע באמצעות מסור חשמלי במספר נקודות כדי להקל על הסרת הקליפה. בעזרת פטיש ואסמכס (שבב עץ), מרימים את הקליפה עד שניתן לקלף אותה במקטעים. לאחר מכן, מסירים ידנית את רקמת הליבה (flowing tissue), מקלפים אותה מהחלק הפנימי של מקטעי הקליפה ומטבילים אותה באופן מיידי בחנקן נוזלי.

לאחר הסרת הקליפה, ניתן לאסוף את השכבה הדקה של הlylem המשני על ידי גירוד פני השטח של הbolt באמצעות להב תער חד-צדדי. רקמת הlylem המימית מועברת מיד לחנקן נוזלי. באיסוף זה, אספנו גם דגימות של reaction wood, המכונה בדרך כלל compression wood ו-opposite wood, לפני חיתוך הענפים מהגזע הראשי.

ראשית מסמנים את כיוון הענף בצבע ספריי כדי שניתן יהיה לקבוע את האזורים המכילים את שני סוגי הרקמות: Opposite wood בחלק העליון של הענף ו-Compression wood בחלק התחתון. במהלך הסרת הקליפה, חורצים תחילה את הענפים באמצעות מסור שרשרה לאורך קווים המגדירים את ה-Compression wood וה-Opposite wood, והסרת הקליפה מבוצעת כפי שנעשה בברגי הגזע הראשי, למעט העובדה שמוסרת רק קליפה באזור התואם לסוג התגובה.

עץ הנכרת מוסר בכל זמן נתון. בדרך כלל קשה יותר להסיר מקטעי קליפה גדולים מענפים קטנים אלה. דגימות של עץ תגובה של xylem משני נאספות באותה דרך שבה נאסף xylem משני רגיל, על ידי גירוד באמצעות להב תער וטבילה מיידית בחנקן נוזלי.

שימו לב לצבע החום-אדמדם האופייני לעץ דחיסה. ראוי לציין כי איסוף ועיבוד של מספר דגימות מעץ גדול דורשים כושר אדם רב, כאשר כל אדם המעורב מבצע משימה מוגדרת כדי שכל סוגי הרקמות ייאספו בו-זמנית לסיוע בהפחתת דגרדציה של RNA; דגימות שהוקפאו בחנקן נוזלי מועברות לאחר מכן לשקיות אחסון מסומנות ומונחות על קרח יבש להובלה חזרה למעבדה. השלב הראשון שלנו הוא טחיקה של הרקמה באמצעות freezer mill מדגם specs model 68 50; בהשוואה לטחינה בעזרת מכתש ועלי, שלב זה מגדיל משמעותית את תשואת מיצוי ה-RNA מדגימות של רקמת עץ, תוך שמירה על הדגימות קרות באמצעות חנקן נוזלי.

ראשית, קורעים את הרקמה לשברים קטנים יותר באופן ידני ומניחים אותם בתא הדגימה. מכניסים את התא אל הנושא, נועלים אותו במקומו, וטוחנים את הדגימה במשך שתי דקות. המוצר הסופי הוא בעל עקביות של אבקה גסה.

פרוטוקול מיצוי ה-RNA הוא תהליך הנמשך יומיים. ביום הראשון, מוסיפים 2.5 גרם של רקמה קפואה לחוצץ מיצוי RNA שחומם ל-65 מעלות צלזיוס. מנערים את הדגימה בעוצמה כדי לערבב, מוסיפים נפח שווה של כלורופורם ומערבבים שוב את הדגימה באמצעות היפוך עדין.

לאחר מכן, מניחים את הדגימה על גלגל סיבוב למשך חמש דקות. לאחר מכן מעבירים את הדגימה למבחנות Teflon Oakridge במהירות גבוהה ומסבבים בצנטריפוגה ברוטור SS 34 במהירות של 12,000 RPM למשך חמש דקות. את השכבה המימית העליונה מעבירים למבחנה חדשה ומוסיפים חצי נפח של כלורופורם.

את הדגימה מערבלים במכשיר vortex למשך דקה אחת ומחזירים שוב לגלגל הסיבוב למשך חמש דקות. לאחר סנטריפוגה שנייה, מחלצים שוב את הפракציה המימית לתוך מבחנת פוליפרופילן המיועדת למהירות גבוהה בנפח 50 mil ומסנטריפוגים במהירות של 10,000 RPM למשך 20 דקות. כדי להסיר חלקיקים שאריתיים, שופכים את הדגימה למבחנת Falcon בנפח 50 mil ומוסיפים לדגימה נפח של רבע מליתיום כלוריד בריכוז 10 molar.

מערבבים את הדגימה על ידי ניעור ומניחים אותה בטמפרטורה של 4°C למשך לילה. ביום השני, סובבים במ centri-fuge את הדגימה שבה שקע הליתיום כלוריד במהירות של 11,000 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C.

שופכים את הנוזל העליון ומשליכים אותו, ומהופכים את המבחנות על גבי ניגוני מעבדה (chem wipes) למשך דקה אחת. כדי להסיר שאריות נוזל, את משקע ה-RNA, שאמור להיות גלוי, מרספנדים ב-800 µL של בופר SSTE חם שחומם מראש ל-65 °C. יש להקפיד על פיפטור למעלה ולמטה מספר פעמים ובכל שולי המשקע כדי להבטיח שכל החומר יימסן בתמיסה.

בשלב הבא, העבירו את ה-RNA שהוחזר לתמיסה לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה סטרילית ל-RNA (מסוג two mil and beyond). חממו את הדגימה במשך דקה עד שתי דקות במקלח מים בטמפרטורה של 65 °C, ולאחר מכן בצעו ערבול במערבל Vortex כדי להבטיח שהדגימה הוחזרה לתמיסה באופן מלא. ניתן לחזור על פעולה זו במידת הצורך.

כעת, הוסיפו נפח שווה של פנול-כלורופורם בבופר. ערבבו את הדגימה במערבל וורטקס (Vortex) למשך 15 עד 20 שניות וסבבו במיקרו-צנטריפוגה במהירות של 14,000 RPM למשך שלוש דקות. את השכבה המימית העבירו למסורת מיקרו-צנטריפוגה חדשה והוסיפו נפח שווה.

את הדגימה מערבלים במיקסר (vortex) ומסובבים במיקרו-צנטריפוגה כפי שבוצע בהפקה הקודמת. עבור שלב ההפקה האורגנית הסופי, את מבחנות ה-Lock gel מסובבים תחילה במיקרו-צנטריפוגה ב-11,000 RPM למשך שתי דקות.

בשלב הבא, מוסיפים את מדגם ה-RNA מההפקה הקודמת לג'ל phase lock, לאחר מכן מוסיפים חצי נפח של כלורופורם, ומערבבים את השניים על ידי פיפטינג עדין. לאחר מכן, סובבים את המדגם במיקרוצנטריפוגה במהירות של 11,000 RPM למשך חמש דקות, ומעבירים את מדגם ה-RNA השכבה המימית לנבובת ambion RNA free micro fuge חדשה. השלב הבא הוא שקיעת RNA פשוטה של המדגם, על ידי הוספת נפח של 1/10 מ-sodium acetate 3M ב-pH 4.8 ושני נפחים של 100% ethanol.

את הדגימה מערבלים במיקסר (vortex), מניחים לזמן קצר במקפיא של 80- מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן מרכזים במיקרו-צנטריפוגה למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שואבים בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) ושוטפים את המשקע הלבן הקטן עם 1 ml של אתנול 70% קר מאוד; שואבים את הנוזל וחוזרים על שטיפת האתנול לאחר השאיבה הסופית. מאפשרים לאתנול שנותר להתאדות על ידי השארת המבחנות פתוחות על השולחן למשך חמש דקות.

את משקעי ה-RNA מרחיפים ב-100 µL של מים מטופלי DEPC ומרחיפים באמצעות וורטקס וחימום ל-65 °C. ניתן לחזור על פעולה זו במידת הצורך. ריכוז הדגימה נקבע.

היחסים הספקטרופוטומטריים 260/280 ו-260/230 מחושבים כדי להעריך את מידת זיהום החלבונים והפחמימות בדגימה. אלקטרופורזה של ג'ל 1%AGROS משמשת להערכה איכותנית של איכות הדגימה, זיהום ב-genomic DNA ודגרדציה של RNA. שלמותן של דגימות קריטיות מוערכת בהמשך באמצעות Agilent 2100 bioanalyzer לקביעת היחסים בין 28S ל-18S וערך RNA integrity number. תודה שצפיתם בסרטון שלנו על קצירת דגימות רקמה ובידוד RNA כולל מ-LOB lolly pine.

האנשים הבאים אחראים לצילומי והפקת סרטון ההדרכה זה.