פענוח מסלולים axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים התחתית צ'יק עצבית ניצול ב אובו Electroporation
May 2nd, 2010
וידאו זה מדגים כיצד לדמיין מסלולי axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים בחוט השדרה ניצול חומוס עובריים ב אובו Electroporation של גנים כתב תחת שליטתה של אלמנטים ספציפיים משפר.
היי, אני האם מהמעבדה של ד"ר ריוויו קלאר במחלקה לנוירוביולוגיה רפואית באוניברסיטה העברית בירושלים. היי, אני סופי אסמן ואני גם ממעבדה של לארס. היום אנו הולכים להראות לכם נוהל עבור Innovo, אלקטרופורציה והכנת ספר פתוח של חוט השדרה.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור מסלולים אקסונליים של אוכלוסיית נוירונים מוגדרת גנטית בחוט השדרה העוברי. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו ביצי עוף לבנים מופרות מטמפרטורת החדר לחממה לחה, רצוי עם מגשי נדנדה בטמפרטורה של 37 עד 38 מעלות צלזיוס.
חשוב לעקוב אחר הטמפרטורה והלחות של החממה על מנת להשיג עוברים ברי קיימא ומסונכרנים. עוברי הגוזלים עוברים אלקטרופוטציה כאשר הם מגיעים להמבורגר והמילטון או HH שלב 18 עד 20, שהוא שלב אופטימלי לביטוי ספציפי של תלות במשפר. בשלב זה, הראש מונח בזווית ישרה לתא המטען.
כמו כן, בשלב HH 18 עד 20, יש לראות גם קבוצה עצומה של כלי דם עובריים נוספים כגון כלי קו חיוניים קדמיים, אחוריים ימניים ושמאליים. עוברי הגוזלים מגיעים לשלב HH 19 עד 20 לאחר 66 שעות דגירה, ובאותו זמן מוציאים את הביצים מהחממה לאחר הוצאת הביצים, מניחים אותן אופקית וממתינים חמש עד 10 דקות. העובר ממוקם כעת בקוטב העליון של הביצית.
לפני האלקטרו-פרינג, העוברים מכינים את התמיסה של האנק עם 100 יחידות למיליליטר פניצילין ו-0.1 מיליגרם למיליליטר סטרפטומיצין. הכינו תערובת רצויה של DNA בשניים עד חמישה מיקרוגרם למיקרוליטר והוסיפו כמה גרגירים של הצבע הירוק המהיר להדמיה קלה של ה-DNA המוזרק. הכינו גם פיפטה לפה, מחט מזרק סטרילית, מספריים קטנים וסרט הדבקה.
הכן נימים מיקרו על ידי משיכת נימי זכוכית בקוטר 0.5 מילימטר בעזרת מושך פיפטה. הנח את אלקטרודות הטונגסטן לתוך המניפולטורים המיקרו וחבר את האלקטרודות למחולל הדופק. הגדר את המתח על מחולל הדופק למינוס 30 וולט, אורך כל דופק ל -50 אלפיות השנייה ומספר הפולסים לשלושה.
המשך לאלקטרופורציה לפני חשיפת העוברים וטיפול בהם. הכניסו מזרק לקוטב הצר של הביצה והוציאו חמישה עד שישה מיליליטר אלבומין מכל ביצה. האלבומין מוסר כדי למנוע את שפיכתו.
בעת חיתוך בשלב הבא, השתמש במספריים הקטנים כדי לחתוך. פתח חלון סגלגל בצד העליון של הביצה לאחר חשיפת עובר הגוזל, הרטיבו אותו ב-0.5 עד מיליליטר של תמיסת סטרפטומיצין פניצילין. לאחר מכן, השתמש במוט פה כדי לטעון את נימי המיקרו מזכוכית.
עם תערובת צבע DNA, מיקרו נימי בקוטר הנכון צריכים להיטען בקלות עם DNA. תחת מיקום דו-עיני העובר להזרקת ה- DNA לצינור העצבי. הניחו את העובר עם הזנב כלפיכם.
בשלב התפתחותי זה, חוט השדרה נראה בבירור ולכן אין צורך בטכניקות מנוגדות. חוט השדרה אטום הן בראש והן בקצה הזנב. עם זאת, כאשר הנימים המיקרו מנקבים חורים נוספים בצינור העצבי וחודרים אליו בזווית רדודה, מיקרו נימי דק מספיק ובקוטר הנכון צריכים לחדור לצינור מבלי לפגוע בו.
הזריק את ה-DNA באמצעות פרפט פה. מיקרו נימי בקוטר הנכון צריכים לשחרר את ה-DNA בנשיפה רגילה. הצבע הירוק צריך להתפשט מקצה הזנב עד לשלפוחיות המוח המתפתח.
הזרקה עד שהצינור העצבי מתמלא ב-DNA נדרשת אלקטרופורציה כדי שה-DNA המוזרק ייכנס תחילה לתאים. הניחו את האלקטרודות במקביל לצינור העצבי וקרוב אליו ככל האפשר מבלי לגעת בצינור עצמו. ודא שהאלקטרודות מכוסות בנוזל כדי לאפשר מוליכות חשמלית במהלך הדופק.
בדרך כלל תמיסת האנק שנוספה מיד לאחר חשיפת העובר מספיקה. אבל אם לא טיפה אחת מהתמיסה של האנק ממש לפני הדופק כשהאלקטרודות ממוקמות ושקועות בפולס נוזלי להפעלה חשמלית, אז הסר בזהירות את האלקטרודות ואטום את החלון ואת הביצה בנייר דבק. חשוב לאטום את הביצה לחלוטין כדי למנוע ייבוש של העובר בתקופת הדגירה הבאה.
מניחים את הביצה בחזרה בחממה ודוגרים עד שעובר הגוזל מגיע לעובר התפתחותי. היום השישי או ה-E השישי, כאשר מגיע הזמן להדמיה כאשר העובר האלקטרופוטרי הגיע לעובר התפתחותי. יום שישי, E שישה שלושה ימים לאחר האלקטרופורציה, הוציאו אותה מהביצה והניחו אותה בצלחת פטרי מצופה סיליקון המכילה PBS בעזרת מספריים עדינים.
חותכים את הממברנות ומותחים את העובר בצד הגחון שלו באמצעות סיכות שנדחפות לתוך הסיליקון כדי להחזיק אותו במקומו. באמצעות מיקרו נימי טונגסטן חדים. בצע חתך אורכי לאורך לוחית הגג מהמוח האחורי ועד לזנב.
בצע שני חתכים אורכיים נוספים משני צידי חוט השדרה, ונתק את גרעיני השורש הגבי או DRGs מחוט השדרה. נתק את לוחית הרצפה מהרקמה החל מהזנב למוח האחורי, והשאיר את חוט השדרה שלם. לבסוף, השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך את חוט השדרה בחתך רוחבי במוח האחורי ולהפריד את חוט השדרה מהגוף.
כעת, לאחר שחוט השדרה בודד, מורחים אותו בצלחת פטרי חדשה מצופה סיליקון המכילה PBS באמצעות סיכות כדי להחזיק אותו מהמוח האחורי לזנב וליצור הכנה שטוחה. תקן את חוט השדרה ב-4% פרלדהיד ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כתם חיסוני לאחר הליך האימונוהיסטוכימיה, פרוטוקול כתוב מפורט ונלווה להרכבת חוט השדרה פתוח. הכנת ספר להדמיה.
מורחים שומן או סיליקון בצורת מלבן על שקופית ומטפטפים PBS בתוך המלבן. השתמש בפינצטה כדי למקם את חוט השדרה, מתח את אמצע המלבן ולמשוך את הנוזל סביבו. עם פסטה לכל חיית מחמד, הניחו טיפה אחת עד שתיים של אמצעי הרכבה על חוט השדרה וכסו בהחלקת כיסוי.
הפעל לחץ על החלקת הכיסוי. כדי למנוע בועות אוויר. שמור את המגלשות בחושך בארבע מעלות צלזיוס.
בדוק את חוט השדרה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. להלן כמה תוצאות מייצגות של דחייה אקסונלית של נוירונים בין עמוד השדרה של אפרוחים בניסויי בקרה שבהם RFP מתבטא בכל הנוירונים תוך שימוש באלמנט משפר בכל מקום מ-CMV, רוב הנוירונים והאקסונים שלהם מסומנים. אי אפשר לפענח את המסלול האקסונלי של תת-אוכלוסיות עצביות.
עם זאת, כאשר מיישמים אלמנטים ספציפיים של שיפור, מתגלה מסלול אקסונלי מוגדר של תת-אוכלוסייה ספציפית DI שני נוירונים בדוגמה זו. אז זה עתה הראינו לכם כיצד להפעיל צינור עצבי של הלחי עם משפר עצבי ספציפי ב-E 3 וכיצד להכין חוט שדרה עם ספר פתוח ב-E 6. כאשר אתה מבצע הליך זה, עליך לזכור להיות זהיר וסבלני.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך. בהצלחה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
הסרטון הזה מדגים נוהל לדמיית נתיבי אקסונים של נוירונים מוגדרים גנטית בחוט השדרה העוברי של אפרוח באמצעות אלקטרופורציה בתוך הביצה. השיטה מאפשרת לחוקרים לחקור מסלולי אקסונים ביעילות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- הבנת נתיבי אקסונים חיונית למחקר מדעי המוח.
- אלקטרופורציה בתוך הביצה היא טכניקה המשמשת להכנסת גנים מדווחים.
- חוט השדרה העוברי של האפרוח משמש כמודל לחקר התפתחות נוירונים.
- אוכלוסיות נוירונים מוגדרות גנטית יכולות לספק תובנות לגבי מעגלים עצביים ספציפיים.
מטרת המחקר
- לדמות נתיבי אקסונים בחוט השדרה העוברי.
- להשתמש באלקטרופורציה בתוך הביצה למחקרי ביטוי גנים.
- לשפר את ההבנה של התפתחות נוירונים וקישוריות.
שיטות ששימשו
- העברת ביצי תרנגולת מופרית לחממה מאווררת.
- שמירת הדגירה בטמפרטורה של 37 עד 38 מעלות צלזיוס.
- ביצוע אלקטרופורציה בתוך הביצה להכנסת גנים מדווחים.
- הכנת הכנות ספר פתוח של חוט השדרה לצורך הדמיה.
תוצאות עיקריות
- דמיית הצלחה של נתיבי אקסונים בחוט השדרה.
- הדגמה של יעילות האלקטרופורציה בתוך הביצה.
- תובנות לגבי מסלולי אוכלוסיות נוירונים מוגדרות גנטית.
- הקמת שיטה אמינה לחקר התפתחות נוירונים.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי חשוב למחקר מדעי המוח.
- אלקטרופורציה בתוך הביצה יעילה להעברת גנים במודלים עוברייים.
- הבנת נתיבי אקסונים יכולה לספק מידע למחקרים על יצירת מעגלים עצביים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
