Name: בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: למדו לבודד תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים (HUVEC) מחבל הטבור לצורך מחקר אנגיוגנזה וביולוגיה כלייתית. הפרוטוקול מדגים שימוש בקולגנאז ובתמיסת מלחי האנק לניקוי ופירוק התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חוט על משטח נקי טיפה את הדם העודף. לבצע חתכים טריים על שני קצוות של חוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 21 02/01 מחט G עם נדן את המחט הפלסטיק, לתוך הווריד. (וריד היא הפתיחה הגדולה ביותר; 2 הקטנים הם העורקים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את המחט במקום עם hemostat ולצרף את המזרק 20cc של הנקס אל המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את הנקס דרך הווריד עם לחץ מתון. איסוף הפסולת בתוך כוס עם אקונומיקה. (מחזיק את המחט בחוט ביד אחת בזמן דוחפים ימנע את המחט קופצים מתוך הווריד.) אם יש הרבה דם בווריד, לשטוף בפעם השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חוט על משטח לצבוט את הקצה השני של הווריד. מלאו מ&quot;ל כמה הנקס כדי לבדוק דליפות לאורך חוט. למשוך את 5 מ&quot;ל ונתק את מהדק התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את מזרק 20cc. הסר את הבוכנה של המזרק 10cc. צרף מזרק 10cc אל המחט, לשפוך 10 מ&quot;ל collagenase ולהחליף הבוכנה. Push collagenase לווריד עד שתראה את כמות first לצאת את הקצה הפתוח. Re-לצבוט את הקצה הפתוח ולמלא עם collagenase עד בינוני יש התנפחות של וריד. התנפחות תוצאות יותר מדי זיהום שריר חלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיסוי חוט בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבל דגירה (עם מחט, מזרק hemostats ו המצורפת) ב DPBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד דוגרים, המשך צעדים 1-8 עם כבל 2 nd. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לקחת חוט מתוך כוס ובעוד מחזיק את כבל על צינור 50 מ&quot;ל לחתוך את הקצה התחתון מעל מהדק. הקפד לגבות כל הצינור. לחצו על collagenase הנותרים באמצעות כבל, ולאחר מכן לצרף את המזרק 20cc ולדחוף הנקס דרך עם לחץ מתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא בתאי שריר חלק יש צורך, לזרוק את כבל בשלב זה. אחרת, מקום את כבל אותו לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל השני עם collagenase ~ דגירה 5 מ&quot;ל ו - ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינור עד שכל כבלי נעשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינורות ב 1200 סל&quot;ד ~ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant (למעט מ&quot;ל 1-2 ~). Resuspend גלולה ב 5mls PHEC + ו צלחת T25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת supernatant להסיר ולהחליף עם מדיה חדשה. אם יש RBCs רבים, לשטוף פעם עם M199, ולאחר מכן להוסיף + PHEC. המשך דוגרים כרגיל עד צלחת הוא ומחוברות (1-4 ימים). פיצול לתוך T75 gelatinized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר T75 הוא ומחוברות, מפוצל לשלושה T75s. הקפאת שתי צנצנות לכל בקבוק. </li></ol> הערה: לתאי אנדותל (לא ממושכת) יש מראה המרוצף. בתאי האנדותל מופעלים לעתים (ארוך מחודד) מיד לאחר הבידוד, לאחר כמה עובר הם בדרך כלל לחזור למצב unactive. ניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות רבה, תשליך מחטים במיכל החדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך מזרקים במיכל Biohazard גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את כל רקמת לשקית Biohazard קטן. תיק הקפאת סגור ב -20 ° עד שריפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את כל המכשירים virucide דקות לפחות 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה הדגירה לבזבז כוס / אקונומיקה. בואו לשבת לפחות 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל כריות ספסל לתוך פסולת Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס את ומחוצה של כוסות, גבי הספסל ואת אמבטיה עם מים מכסה vircide. בואו לשבת 10 דקות, ולאחר מכן לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כוסות וכלי עם מים חמים לתלות על מתלה לייבוש (למחוק את המכשירים כך שהם לא חלודה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השליכו פסולת חיטוי לכיור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור התקשורת בשימוש למקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את הכפפות פסולת Biohazard. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>0.1% Collagenase</td><td></td><td></td><td>10 mL לכל חבל טבורי, מחומם ל-37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>בקבוקי תרבית רקמה</td><td></td><td></td><td>T75, אחד לכל חבל טבורי.</td></tr><tr><td>תווך Hanks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td>סטריליים</td></tr><tr><td>ביਕਰ</td><td></td><td></td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>מבחנות 50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (huvec)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

אנגיוגנזה היא תהליך מורכב רב שלבי, שבו בתגובה לגירויים angiogenic, כלי חדש נוצרות vasculature הקיים. צעדים אלה כוללים: ירידה של התפשטות קרום, מרתף והגירה (נביטה) של בתאי האנדותל (EC) לתוך המטריצה ​​תאיים, יישור של EC לתוך מיתרי, היווצרות לומן, השקה, ועל היווצרות קרום מרתף חדשה. רבים מבחני חוץ גופית פותחו כדי ללמוד את התהליך הזה, אבל רוב לחקות רק בשלבים מסוימים של אנגיוגנזה, ואת מורפולוגית כלי לעתים קרובות לא דומים כלי in vivo. כאן אנו מדגימים אופטימיזציה assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC ו fibroblasts. זה המודל משחזר את כל השלבים המוקדמים המפתח של אנגיוגנזה, ואת כלי חשוב להציג לומן פטנט אינטר מוקף EC מקוטב. כלי ניתן להבחין בקלות לעומת שלב ואת זמן לשגות מיקרוסקופ, והחלים בצורה הטהורה עבור יישומים במורד הזרם.

זה פרוטוקול וידאו ממחישה את הבידוד של התרבות האנושית וריד הטבור בתאי האנדותל (HUVEC) מ חבל הטבור האדם. לאחר מבודד את התאים האלה יכול לשמש ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה כמו Assay אופטימליים הפיברין ביד ג&#39;ל הוכיח גם על ידי המעבדה יוז.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

אנגיוגנזה (יצירת כלי דם חדשים) היא תהליך רב-שלבי ומורכב, שבו נוצרים כלי דם חדשים מרשת כלי הדם הקיימת כמענה לגירויים אנגיוגניים. שלבים אלו...

שלום, שמי Jager Davis והיום אראה לכם כיצד לבודד תאי אנדותל מווריד טבורי אנושי, הידועים גם כ-HUVECs. נשתמש במגוון מצעים, החל מ-Hank's balanced salt solution, שישמש לניקוי התאים מתאי דם אדומים או מזיהומים אחרים שעלולים להימצא בווריד. שנית, נשתמש ב-collagenase המומס מחדש ב-DPBS, ותמיסה זו תשמש לשחרור ה-HUVECs מהווריד, ולאחר מכן נבצע זריעה בתוך מצע EGM-2, המורכב מ-M199 עם FBS שעבר דה-אקטיבציה תרמית ותמיסת pen-strep.בנוסף, נתוסיף לתמיסת ה-Resus שלנו תוסף לצמיחת תאי אנדותל של BD Biosciences. אוקיי, יש לי זוג מספרי ניתוח. אני אבצע חיתוך ישר לרוחב השרוך כך.בשלב הבא, אני אנקה את חבל הטבור. לכן, מה שאעשה הוא לזהות את העורקים ואת הווריד. ישנם שני עורקים וווריד אחד.בדרך כלל אני מזהה את העורקים לפי השניים. הם יוצאים לכיוונך. כך שיש לנו עורק אחד כאן ועורק נוסף ממש כאן.וכפי שניתן לראות, הווריד נכנס למעשה אל השרוול, ושם נמקם את מחט הפרפר שלנו. אנו משתמשים במחט פרפר במידה 21 gauge ובאורך three quarter Accutane. לכן, פתחו אותה.אני פשוט אכנס כך. שוב, אני אזהה את העורקים. יש לנו עורק אחד ועורק שני, ואז יש את הווריד שלנו.אני אקח את מחט הפרפר ואחדיר אותה לווריד בעדינות רבה, אך ייתכן שתרגישו התנגדות מסוימת. במקרה כזה, אני מעדיף לסובב מעט את הצינור ובמקביל לדחוף את המחט, בתנועה כזו, ולהמשיך עד שכנפי מחט הפרפר צמודות לצינור, בדיוק כך. כעת סיימנו, ואפשר לסגור את התפסן.כעת אמלא שתי מזרקים של 20 µL ב-20 µL של דיו. לאחר מכן, אמלא מבחנה קונית של 50 µL בחמישה µL של 20% effect. ובשלב הבא אעביר באמצעות פיפט 10 µL של DPBS לאחת ממבחנות קוניות אלו של 15 µL.ל-15 ml של DPBS אלו, אני אוסיף 10 mg של אבקת הקולגנאז שלנו, אותה אשקול במאזניים. אני אבצע השהיה (resuspension) של הקולגנאז פשוט על ידי היפוך השפופרת מספר פעמים עד שהאבקה תרד מדפנות השפופרת. לאחר כחמש או שש פעמים, אבצע סינון סטרילי לקולגנאז באמצעות מזרק של 10 ml כדי להוסיף את המסנן.כעת אנו מוכנים להעביר את המצעים הללו דרך השרוול. מה שעשיתי הוא ששפכתי את שארית ה-DPPS לבקער של ליטר אחד, ואני עומד להניח אותו בתוך אמבט מים של 37°C כדי שיתחמם. מצע זה ישמש להדגרת השרוול שלנו למשך כ-15 דקות.זהו תמיסת הקולגנאז המסוננת שלנו. אני אבקיע את המבחנה הקונית הזו לאמבט מים של 37 מעלות כדי לאפשר לה להתחמם, ואני אשתמש בה בהמשך הפרוצדורה כדי לשחרר את ה-uve מהחלק הפנימי של הווריד שלנו. לכן, השלב הבא יהיה לסגור את השרית בנקודה שבה נמצאת מחט הפרפר, ואני אעביר 20 ml של hanks דרך השרית כדי לשטוף החוצה תאי דם.לאחר קיבוע מחט הפרפר, אני עומד להזרים 20 mils מההפרין שלנו. אני אעשה זאת לאט מאוד כדי למנוע קרע של הווריד. זהו בערך הקצב שבו אתם רוצים שהנוזל ייצא, אך אין להזרים את ההפרין כזרם מהיר.זה אומר שאתה לוחץ חזק מדי. לכן אני בדרך כלל עושה זאת, אתה יודע, טיפה אחר טיפה. ושוב, אני דוחף את ה-hanks רק כדי לנקות את הווריד.כעת חושפים את התאים הקצביים. לאחר מכן, לאחר שהעברנו את כל התליינים, אני אפרוש את השרוך, ואחריו אסגור בתפסנית את הקצה התחתון של השרוך ואוציא את המזרק, ואפנה אותו לשק פסולת ביולוגית.בשלב הבא, אני אחבר מזרק חד של 10 ml. כעת, אני אדחף קולגנאז דרך הקטטר, וזאת כדי לשטוף שאריות של חומרים שעשויים להישאר בווריד. אני אדחף כמות מספקת של קולגנאז.כאשר הנוזל יצא מהקצה כאן, נראה שהוא בצבע דומה לזה שבמזרק. לאחר מכן, אסגור בעזרת תסמיך את הקצה התחתון של השרוך. השלב הבא יהיה להזרים כמות קטנה נוספת של collagenase, רק עד לרמה שבה נוכל לראות את השרוך מתרחב.לאחר שהחבל התרחב מעט, אעס אותו, משמאל לימין. אני משתמש בדרך כלל בשלוש אצבעות תוך הפעלת לחץ נחוש למדי. הפעולה דומה כמעט לגלגול בצק.אין לדחוף את החוט בעוצמה רבה מדי, אך גם לא בעדינות רבה מדי. דחיפה חזקה מדי עלולה להוביל לזיהום של שריר חלק. מנגד, אם הפעולה תבוצע בעדינות רבה מדי, לא תצליחו להוציא את ה-Q חזרה.לכן, שהו כחמש עד שש שניות בנקודה אחת והמשיכו כך כלפי מטה. כעת אעביר את השרוול מהשולחן אל אמבט המים בטמפרטורה של 37 °C, ואני אתן לזה לעמוד לדגירה במשך 15 דקות. ייתכן שחלק מהדגימות ידרשו דגירה של 15 דקות.מנה אחרת עשויה לדרוש 20 דקות, ומנה שלישית עשויה לדרוש 10 דקות. לכן, חשוב לבצע אופטימיזציה לזמן הדגירה עבור המנה הספציפית שלנו. במקרה זה, הזמן הוא 15 דקות.נסיר כעת את הכבלים מאמבט ה-DPVS. נניח אותם כאן לרגע. נסיר את הפקק מהמבחנה הקונית בנפח 15 ml המכילה 5 ml של 20%feck.ב-20%feck יש מעכב טריפסין, ולכן הוא יעצור את פעולת הקולגנאז שלנו. לכן, אני אחזיק את השרוך מעל המבחנה בעזרת המספריים. וכעת אני אגזור לאורך קו התפסן שלנו.אתם מעבירים את החלק התחתון לכאן. אוקיי, עכשיו יש לנו חתך טרי בקצה השרוך שלנו. והדבר הבא שאעשה הוא להזרים את ה-collagenase.ושוב, בדיוק כמו עם ה-hanks, אין לדחוף מהר מדי. זהו הקצב שבו יש לדחוף את ה-immediate שלכם. וזה כל מה שצריך עבור הקולגנאז שלנו.מדי פעם תגלו שהמזרק מהודק חזק מדי. במצבים אלו, מה שאעשה הוא להשתמש בתפסן שהיה לנו על השרווית (umbilical cord), לתפוס אותו בדיוק כאן ולהבריג אותו בעדינות, רק מספיק כדי לשחרר אותו כך שאוכל להסיר אותו ביד או שהוא יסתיר את עצמו. בשלב הבא, אקח את שאר ה-20 mil של ה-hangs במזרק, אחבר אותו למחט, ואדחף את כל נפח ה-hangs.שוב, אני אדחף באיטיות רבה, בדיוק כפי שעשיתי עם הקולגנאז (collagenase) ומזרק ה-hanks השני; זה יירד טיפה אחר טיפה. זהו בערך הקצב שבו תרצו לדחוף את המדיום שלכם. זה מכיל 20% hanks ותמיסת קולגנאז (collagenase) שלנו.כעת אני ממקם את הדגימה בצנטריפוגה ומסובב אותה למשך חמש דקות ב-1200 RPMs. אני אבדוק שוב כדי לוודא שהמכסה סגור היטב, ואז אמקם אותה בצנטריפוגה שלנו.צנטריפגנו למשך חמש דקות במהירות של 1200 RPMs. כך שסובבנו את המבחנה הקונית בנפח 50 ml למשך חמש דקות ב-1200 RPMs. מה שנותר לנו הוא משקע (pellet) קטן בתחתית המבחנה. משקע זה מורכב מכמה תאי דם אדומים שנותרו וממהתאים האנדותליאליים שלנו.בשלב הבא אשאב את העלייה והמשקע, אתることができる את הכדור (pellet) באמצעות 5 mL של PBS בריכוז 20%, ואבצע פיפטינג עדין למעלה ולמטה מספר פעמים עד שייראה כי נותר מעט מאוד חומר פסולית בתמיסה. לאחר מכן, אעביר באמצעות פיפטה את כל 5 ה-mL ואפרוס אותם על בקבוק T25. אנסה להיות זהיר כדי לא ליצור בועות.כעת אוסיף את ה-ECPS שלי. אוסיף 50 µL, ואנער בעדינות את הבקבוק רק כדי לוודא שכל ה-ECPS מתפזר בתוך הכלי. וזהו.המשיכו בביצוע. את הבקבוק הדגירו בטמפרטורה של 37 מעלות.

isolation-of-human-umbilical-vein-endothelial-cells-huvec

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מיתרי הטבור משמשים כדי לבודד לתאי שריר חלק על ידי דרכים שונות. בעבודה זו השתמשנו טיפול אנזימטי כדי לבודד לתאי שריר חלק.

בידוד של האדם עורקי טבורי תאים שרירים חלקים (HUASMC)

אנו מספקים שיטה בידוד אוכלוסיות culturing טהור של שסתום הלב תאים אנדותל (VEC). VEC יכול להיות מבודד צדי סף או העלעל ומיד הבאה, תא ביניים הבסיסית (ויק) בידוד היא פשוטה.

בידוד של תאים אנדותל valvular

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

שיטה של ​​quantitating הידבקות נויטרופילים היא מדווחת. שיטה זו יוצרת זרימת סביבה דינמית דומה לזו שנתקלה בה בכלי דם. זה מאפשר החקירה של הידבקות נויטרופילים לשתי מולקולות מטוהרים הידבקות (ליגנד) או מצע תא אנדותל (HUVEC) בהקשר דומה לסביבת in vivo עם לחץ העצום.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

פרוטוקול זה מוכן לחלוק את השיטה שלנו לבידוד תאי אנדותל כליליים של עכברים לצורך הדמיה או לביצוע ניסויים ביולוגיים מולקולריים.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

פרוטוקולים לתרבית תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC), טרנספקציה חולפת של סמנים פלואורסצנטיים של צמיחת מיקרו-צינוריות, הדמיית תאים חיים וניתוח אוטומטי של דינמיקת צמיחת מיקרו-צינורות בין-פאזיים.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול משולב המודד מונוציט subpopulation סחר תחת זרימה במבחנה באמצעות סמני פני שטח מסוים, מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את השלבים רציפים גיוס גם לגבי פרופיל אחרים יחוברו ליקוציט באמצעות סמנים אחרים משטח מסוים.

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

למרות שהוא מאתגר, הבידוד של תאי אנדותל ריאתיים חיוני למחקרים על דלקת ריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של תאי אנדותל מקרו-וסקולריים ומיקרו-וסקולריים.

בידוד וטיהור תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ומקרו-וסקולריים מדגימות שמקורן בריאה

המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לניטור השינויים בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) במהלך זיהום ויראלי באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA).

ניטור שינויים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי בעת זיהום ויראלי באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). אנו מספקים גם שיטות מפורטות לייצור לחץ גזירה ומתיחה כדי לחקור לחץ מכני ב- hSVECs.

בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה

למדו לבודד תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים (HUVEC) מחבל הטבור לצורך מחקר אנגיוגנזה וביולוגיה כלייתית. הפרוטוקול מדגים שימוש בקולגנאז ובתמיסת מלחי האנק לניקוי ופירוק התאים.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

גלה סרטונים נוספים