בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

עבור קישור צולב (cross-linking), ולאחריו שיקוע חיסוני (immunoprecipitation). תאים בצפיפות של 80% עד 90% מדגירים עם 1 mM של DSP קר ב-PBS, בסידן, מגנזיום או ב-DMSO בלבד.

ביקורת נשאי. DSP הוא מקשר (crosslinker) רדוקציוני, הומו-ביפונקציונלי וחודר ממברנה, המקשר בין קבוצות חופשיות הנמצאות במרחק של עד 12 angstroms זו מזו. לאחר קישור צולב, התאים מלוטים ומבוצעים תהליכי שיקוע חיסוני (immuno precipitation) תוך שימוש בביקורות סטנדרטיות.

לאחר מכן מפרידים את קומפלקסי החלבונים באמצעות SDS page תחת תנאי חיזור, כאשר חומרי החיזור מ 끊עים את ה-DSP, מה שמאפשר זיהוי של חלבונים בודדים באמצעות immuno blot. היי, אני סטפני איק מהמעבדה של ד"ר ויקטור פונדה במחלקה לביולוגיה של התא באוניברסיטת אמורי. ואני פירל ריידר, גם אני מהמעבדה של פונדה.

היום נדגים לכם הליך לבידוד של קומפלקסים חלבוניים באמצעות קישור צולב (cross-linking) מבוקר, ולאחריו כרומטוגרפיית זיקה מגנטית אימונית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור אינטראקציות חלבוניות לא יציבות וחולפות. אז בואו נתחיל.

התחילו בסימון תחתית פלטות התאים כדי לציין את סוג התא ואת התנאי הניסויי הספציפי. סימן חיובי כאן מציין טיפול ב-DSP, וכלול בקרת vehicle שלילית עם DMSO בלבד. הוסיפו מצע גידול לפלטות כדי להכין אותן לזריעת התאים.

תאי HEK שנזרעו בדילול של אחת לחמש כדי לאפשר בידוד של 500 micrograms של חלבון לכל תגובת מבחנה סטנדרטית. מבחנה אחת עשויה להספיק כדי לזהות את השותפים לקשירה המשוערים של חלבון עניין באמצעות immuno blot מניתוח mass spectrometry. הגדילו את מספר התגובות הסטנדרטיות לפחות פי 10.

הכינו מראש את רוב התמיסות המשמשות בניסוי הצליבה. אלו כוללות PBS מועשר ב-0.1 millimolar calcium chloride וב-one millimolar magnesium chloride, הנקרא PBS calcium magnesium. הוספת יוני סידן ומגנזיום היא קריטית להיצמדות התאים לצלחת התרבית.

במהלך הניסוי, יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4 °C. מלאים אחרים כוללים תמיסת כיבוי למקשר (crosslinker quenching solution), תערובת מעכבי פרוטאז מלאה 50 X, אותה יש לערבב ב-vortex מדי 20 דקות עד להמסת המשקע, Triton X 100 בריכוז 20% המאוחסן ב-4 °C ויש להשתמש בו תוך חודש, וכן תמיסות Buffer a בריכוזי 10 x ו-1 x.

יש להכין ולאחסן את כל התמיסות כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב המצורף. לבסוף, יש להכין את באפר הליזה המורכב מבאפר X 1 בתוספת 0.5% TRITTON X 100, ואת באפר השיקוע האימונו-מגנטי או באפר IP המורכב מבאפר X 1.

הוסף 0.1% TRITTON X 101; יומיים לאחר הזריעה, התאים מגיעים ל-80% עד 90% קונפלואנסיות (confluency), רמה שהיא אופטימלית לקשירה צולבת. בתנאי קונפלואנסיות גבוהים, התאים נוטים להיערם זה על זה, מה שמוביל לירידה בנגישות של החומר מקשר (crosslinker) החודר לתאים לכלל התאים. החזר את הצלחות הגדלה לאינקובטור עד למועד ביצוע הקשירה הצולבת.

יש להכין את תמיסת ה-DSP Crosslinker מיד לפני היישום על התאים. DSP הוא הידרופובבי מאוד ולכן הוא מומס ב-DMSO לריכוז של 100 millimolar לפני הדילול לתוך בופר PBS calcium magnesium. כדי לשפר עוד יותר את דילול ה-DSP לתוך בופר PBS calcium magnesium חמים בנפח מתאים, הוסף 10 µL מתמיסת המלאי של DSP ו-DMSO.

עבור כל מיליליטר אחד של PBS calcium magnesium חמים, הוסיפו את תמיסת המלאי של D-S-P-D-M-S-O טיפה אחר טיפה תוך ערבוב חוזר עד להמסה מלאה של ה-DSP. כמו כן, הכינו תמיסת ביקורת (vehicle control) של 10 microliters של DMSO עבור כל מיליליטר של PBS calcium magnesium. לאחר דילול ה-DSP, שמרו את כל תמיסות ה-PBS calcium magnesium באמבט קרח למשך 10 דקות לכל היותר.

לאחר מכן, הכינו אמבט קרח ומים שיוכל להכיל את כל הצלחות המשמשות בניסוי. הוציאו את צלחות התרבית המכילות את התאים מהאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C והניחו אותן מיד באמבט קרח ומים. שטפו את התאים פעמיים עם PBS עם סידן ומגנזיום קר מאוד, תוך שימוש באותם נפחים שהוכנו קודם לכן עבור האינקובציה עם חומר הקישור הצולב; עבור פלטה של שש בארות, חשבו 2 mL לכל בארה וכך הלאה.

לאחר השטיפה השנייה, הוסף לתאים או את בקרת הנשאי (vehicle control), שהיא DMSO המומס בבופר, או את תמיסת בופר הקישור הצולב של DSP. הדגר על קרח למשך שעתיים ובדוק בערך כל 20 דקות כדי לוודא שכל התאים מכוסים בתמיסה. אם חלק מהתאים נחשפים, הטה וסובב את הצלחת כדי לכסות אותם שוב באופן שווה; שקיעה של כמות קטנה של DSP היא תופעה נורמלית.

במהלך דגירה של שעתיים עם התאים, לפני סיום זמן הדגירה, הכין תמיסת כיבוי (quenching) של 1X DSP על ידי דילול ה-stalk בתוך PBS calcium magnesium. שמור את התמיסה על קרח עד לשימוש בה להפסקת תגובת הצלוב (cross-linking) באמצעות השבתה של ה-DSP שלא הגיב. בתום השעתיים, הסר מהתאים את ביקורת הנשא (vehicle control) ואת תמיסות הצלוב.

הוסיפו את תמיסת כיבוי ה-DSP הקרה (בקרח) והדגירו על קרח למשך 15 דקות. בינתיים, דללו את תמיסת המלאי של תערובת מעכבי הפרוטאז המלאה ביחס של 1:50 אל תוך בופר ליזיס התאים. עם סיום 15 הדקות, שטפו את התאים פעמיים עם PBS calcium magnesium.

לאחר מכן, הוסיפו לתאים את באפר הליזה המכיל את מעכבי הפרוטאז והניעו בעדינות (rock) בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות של ליזה של התאים, השתמשו במגרדת תאים (cell scraper) כדי לאסוף את התאים מהפלטה. הקפידו לשמור את הליזאטים על קרח כדי למזער את פעילות הפרוטאז.

סובב את ליזאטי התאים למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה מיני שולחנית במהירות מקסימלית של 15,000 Gs. העבר באמצעות פיפט את supernatant לשפופית נקייה והשלך את ה-pellet. נתח את רמות החלבון באמצעות בדיקת Bradford והמשך בתהליך immunoprecipitation. התחל בהכנות ל-immunoprecipitation מיד לאחר תחילת תגובת ה-cross-linking שנמשכת שעתיים בשפופרות מיקרו-צנטריפוגה עם מכסה הברגה.

ערבבו 30 µL של חרוזי אימונו-מגנט anti IgG עם 500 µL של IP buffer. הוסיפו את הנוגדן נגד יעד העניין. יש לקבוע את כמות הנוגדן המתאימה עבור כל אנטיגן בנפרד.

בניסויים מקדימים, בקרות שליליות אפשריות עבור החרוצים כוללות היעדר נוגדן, חרוצים בלבד, וחרוצים עם נוגדן בקרת איזוטייפ כדי לקשור את נוגדן ה-IP לחרוצים המגנטיים. דגרו ברוקר מסוג end-over-end למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בסיום הדגירה, בצעו ספינט קצר (quick spin) למבחנות והחליקו אותן לתוך המחזיק המגנטי. החרוצים יתרכזו בצד של המגנט.

הסיר את התמיסה המכילה נוגדנים שאינם קשורים ושטוף מיד את החרו지를 כדי למנוע מהם להתייבש. לאחר שתי שטיפות, הוסף 500 µL של 1 µg/mL של ליזאט תאים DSP negative או DSP positive למבחנות המתאימות. בשלב זה ניתן להכין ביקורת שלילית של תחרות פפטידים על ידי הוספת הפפטיד האימונוגני בריכוז שנקבע בניסויים מקדימים לתערובת של הליזאט והחרוזים.

בקרה שלילית אפשרית נוספת שניתן להכין בשלב זה היא תגובה של בופר בלבד או תגובה ללא ליזאט, המוכנה על ידי הוספת 500 microliters של בופר ליזיס בלבד לחרוצים. השהה את החרוצים בעדינות עבור התגובות הניסוייות ותגובות הבקרה. אין להשתמש בערבוב סיבוב (vortex) שכן הדבר יגרום לשבירת החרוצים; דגרו בטמפרטורה של ארבע מעלות עם סיבוב מקצה לקצה למשך שעתיים.

בסיום שעתיים, הסר את הליזט באמצעות המחזיק המגנטי. בצע סבב צנטריפוגה קצר ושטוף את החרוצים סך הכל שש פעמים עם 1 mL של IP buffer. הדגר כל שטיפה בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות.

כדי לשחרר את הקומפלקסים הקשורים, הוסף 1x gel sample buffer לשפופרת ה-IP, ממש מעל משקע החרוצים. כדי לרכז את החרוצים בתחתית השפופרת, הקיש בעדינות על תחתית השפופרת כדי שכל החרוצים יסחפו מחדש בתוך ה-gel sample buffer. לחלופין, עבור בידוד באמצעות אימונו-אפיניטי, הוסף 30 µL של באפר המועשר בפפטיד האימונוגני אל החרוצים.

הריכוז הנדרש של הפפטיד האימונוגני נקבע באופן אמפירי. לאחר בדיקה של טווח שבין 10 ל-200 micromolar, דגרו את החרוצים בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך שעתיים, והקישו על המבחנות מדי 30 דקות. השתמשו במחזיק המגנטי כדי להוציא את ה-30 microliters המכילים את הקומפלקסים ששולשלו, ושמרו אותם במבחנה נקייה; שטפו את החרוצים עם IP buffer ושמרו אותם.

הוסיפו 1x gel sample buffer לחרוצים עבור שתי שיטות האלוציה. חממו את חרוצי האימונו-מגנט שסוספנדו מחדש ב-gel sample buffer בטמפרטורה של 75 °C למשך חמש דקות כדי לדנטורציה של החלבונים. שלב זה יגרום גם לפירוק של מולקולת ה-DSP, מה שיאפשר הפרדה של החלבונים הבודדים בתוך הקומפלקס בריצה.

הדגימות על ג'ל SDS-PAGE עבור Western blotting. ניתן להרחיק את חרוזי האימונו-מגנט הריקים על ידי סבב צנטריפוגה ולהוציאם מהדגימה באמצעות מחזיק מגנטי לפני ההטענה. אם ה-EUA של אימונו-אפיניות נקי מ-IgG, הן לפי צביעת חלבון של SDS-PAGE והן לפי אימונו-בלוטים, הוא מתאים לספקטרומטריית מסות.

להלן דוגמה ל-western blot של חומר מליזאט תאים שעבר קשירה צולבת (cross-linked) וללא קשירה צולבת, ולאחריו שיקוע אימונו-מגנטי באמצעות נוגדן מונוקלונלי נגד תת-היחידה AP three. קשירה צולבת מאפשרת זיהוי של חלבונים באינטראקציה שלא נצפו בדגימות ללא קשירה צולבת במהלך בידוד אימונו-מגנטי. בביקורות השליליות לא נצפתה השקעה (pull down) ספציפית של חלבונים בשימוש בביקורת ללא נוגדן ובביקורת איזוטיפ תואמת באמצעות IgG המופנה נגד קולטן הטרנספרין, הן עבור דגימות ללא קשירה צולבת והן עבור דגימות שעברו קשירה צולבת.

בדוגמה זו, נעשה שימוש באלוציה של פפטיד זיקה כדי לשחזר את החלבונים הקשורים לנוגדן ה-IP. שימו לב כי הנוגדן האימונולוגי אינו נמצא בפרקציית העל (supernatant) ונשאר בפרקציית המשקע במהלך אלוציית הפפטיד. הרגע הדגמנו כיצד לבודד קומפלקסים לא יציבים של MultiPro באמצעות המשכיף הכימי DSP, ולאחריו טיהור בזיקה מגנטית אימונולוגית.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על תמיסות תאים וליזאטים בקירור כדי לשמר אינטראקציות לא יציבות במהלך הצלבתם (cross-linking) ולהפחית למינימום את פעילות הפרוטאז. זהו כל השלב. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.