בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

עבור הקישור הצולב, ואחריו משקעים חיסוניים. תאי נוהל בצפיפות של 80 עד 90% מודגרים בקור קרח של מילי-מולרית אחת. DSP ב-PBS, סידן, מגנזיום או DMSO בלבד.

בקרת רכב. DSP הוא ממברנה דו-תפקודית הומו חדיר וניתן לצמצום צולב הניתן לצילוב חופשי ופירושו בטווח של 12 אנגסטרומים זה מזה. תאים צולבים עוברים ליזה ומשקעים חיסוניים מבוצעים באמצעות בקרות סטנדרטיות.

קומפלקסים של חלבונים נפתרים לאחר מכן על ידי הפחתת דף SDS, הפחתת ה-DSP השסוע של הסוכנים, מה שמאפשר זיהוי של חלבונים בודדים על ידי כתם חיסוני. היי, אני סטפני איק, מהמעבדה של ד"ר ויקטור פונדה במחלקה לביולוגיה של התא באוניברסיטת אמורי. ואני פרל ריידר, גם היא ממעבדת פונדה.

היום נראה לכם הליך לבידוד קומפלקסים של myprotein באמצעות קישור צולב מבוקר ואחריו כרומטוגרפיה של זיקה מגנטית חיסונית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור אינטראקציות חלבון חולפות. אז בואו נתחיל.

התחל בתיוג החלק התחתון של לוחות התא כדי לציין את סוג התא ומצב הניסוי הספציפי. סמל חיובי כאן מציין ש-DSP שטופל כולל בקרת רכב שלילית של DMSO בלבד. הוסף מדיה לצלחות כדי להכין אותן לצלחת זריעת תאים.

תאי HEK שנזרעו בדילול של 1 עד 5 כדי לאפשר בידוד של 500 מיקרוגרם חלבון לכל תגובת צינור סטנדרטית. צינור בודד עשוי להספיק כדי לזהות את שותפי הקישור המשוערים של חלבון מעניין על ידי כתם חיסוני מניתוח ספקטרומטריית מסה. הגדל את מספר התגובות הסטנדרטיות לפחות 10 פעמים.

הכינו גם גבעולים של רוב הפתרונות המשמשים בניסוי הקישור הצולב. אלה כוללים PBS בתוספת 0.1 מילי-מולרי של סידן כלוריד ומילי-מולרי אחד מגנזיום כלוריד המכונה PBS סידן מגנזיום. תוספת יוני סידן ומגנזיום היא קריטית להדבקה של תאים לצלחת התרבית.

במהלך הניסוי יש לאחסן את התמיסה בארבע מעלות צלזיוס. מניות אחרות כוללות תמיסת מרווה קרוסלינקר 50 X קוקטייל מעכב פרוטאז מלא, שהוא מערבולת כל 20 דקות עד להמסת הגלולה. 20% Tritan X 100, המאוחסן בארבע מעלות צלזיוס ויש להשתמש בו תוך חודש אחד ו-10 x ו-1 x Buffer a תמיסות.

הכינו ואחסנו את כל הפתרונות כמפורט בפרוטוקול הכתוב המצורף. לבסוף, הכן את מאגר הליזיס המורכב ממאגר X אחד. פלוס 0.5% TRITTON X 100 ומאגר משקעים מגנטי חיסוני או מאגר IP המורכב ממאגר X אחד.

פלוס 0.1% TRITTON X 101 עד יומיים לאחר הציפוי, התאים הם 80 עד 90% שטף קו, וזה אופטימלי לקישור צולב. בתנאים של שטף משותף גבוה, תאים נוטים להיערם זה על זה מה שמוביל לירידה בנגישות של התא החדיר לכל התאים. החזירו את הצלחות לחממה עד שהן מוכנות לקישור צולב.

הכן את פתרון DSP Crosslinker מיד לפני החלתו על התאים. DSP הוא הידרופובי מאוד ולכן מומס ב-DMSO לריכוז של 100 מילי-מולרית לפני שהוא מדולל למאגר סידן מגנזיום PBS. כדי לשפר עוד יותר את דילול ה-DSP למאגר הסידן מגנזיום PBS, נפח חם ומתאים, הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת המלאי DSP ו-DMSO.

על כל מיליליטר אחד של מגנזיום סידן PBS חם, הוסף את תמיסת המלאי D-S-P-D-M-S-O טיפה אחר טיפה עם ערבוב חוזר עד שכל ה-DSP נמס. כמו כן, הכינו תמיסת בקרת רכב של 10 מיקרוליטר DMSO לכל מיליליטר סידן מגנזיום PBS. לאחר דילול ה-DSP, שמור את כל תמיסות הסידן מגנזיום PBS באמבט מי קרח לא יותר מ-10 דקות.

לאחר מכן, הכינו אמבט מי קרח שיכיל את כל הצלחות ששימשו בניסוי. המשך לקחת את צלחות התרבות המכילות את התאים מהחממה של 37 מעלות צלזיוס ולהניח אותן מיד לאמבט מי הקרח. שוטפים את התאים פעמיים עם מגנזיום סידן PBS קר כקרח, תוך שימוש באותם נפחים שהוכנו בעבר לדגירה עם הצלב לשישה, צלחת היטב מחשבת שני מיליליטר לבאר וכן הלאה.

לאחר הכביסה השנייה. הוסף את בקרת הרכב, שהיא ה-DMSO המומס במאגר או את תמיסת המאגר הצולבת DSP לתאים הדוגרים על קרח למשך שעתיים ובדוק בערך כל 20 דקות כדי לוודא שכל התאים מכוסים בתמיסה. אם חלק מהתאים נחשפים, הטה וסובב את הכלי כדי לכסות אותם שוב באופן שווה, זה נורמלי שכמות קטנה של DSP תשקע.

במהלך הדגירה של שעתיים עם התאים לפני סיום הדגירה של שעתיים, הכינו תמיסת מרווה XDSP אחת על ידי דילול הגבעול למגנזיום סידן PBS. שמור את התמיסה על קרח עד השימוש בה כדי לעצור את תגובת הקישור הצולב על ידי השבתת ה-DSP שלא הגיב. בתום השעתיים, הסר את פתרונות בקרת הרכב והצלבה מהתאים.

מוסיפים את תמיסת המרווה DSP הקרה כקרח ודוגרים על קרח למשך 15 דקות. בינתיים, יש לדלל את מלאי קוקטייל מעכבי הפרוטאז השלם מאחד עד 50 לתוך מאגר הליזיס של התאים. לאחר תום 15 הדקות, שטפו את התאים פעמיים עם PBS סידן מגנזיום.

לאחר מכן הוסיפו לתאים את מאגר הליזיס המכיל את מעכבי הפרוטאז והתנדנדו בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות של ליזיס תאים, השתמש במגרד תאים כדי לאסוף את התאים מהצלחת. הקפד לשמור את הליזטים על קרח כדי למזער את פעילות הפרוטאז.

סובב את התא במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס במיני צנטריפוגה ספסל במהירות מרבית של 15,000 Gs. נתח את רמות החלבון באמצעות מבחן ברדפורד והמשך עם משקעים חיסוניים. התחל להתכונן למשקעים החיסוניים מיד לאחר תחילת תגובת הצלבה של שעתיים בצינורות מיקרו צנטריפוגה עליונים.

שלב 30 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים חיסוניים נגד IgG עם 500 מיקרוליטר של מאגר IP. הוסף את הנוגדן כנגד המטרה המעניינת. יש לקבוע את כמות הנוגדנים המתאימה לכל אנטיגן בנפרד.

בניסויים ראשוניים, בקרות שליליות אפשריות לחרוזים אינן כוללות נוגדנים, חרוזים וחרוזי נוגדנים לבקרת איזוטיפ כדי לקשור את נוגדן ה-IP לחרוזים המגנטיים. דגירה בנדנדה בקצה הקצה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בסוף הדגירה, סובב במהירות את הצינורות והחלק אותם לתוך המחזיק המגנטי. החרוזים יתרכזו בצד המגנט.

הסר את התמיסה המכילה נוגדנים לא קשורים ושטוף מיד את החרוזים כדי למנוע מהם להתייבש. לאחר שתי כביסות, הוסף 500 מיקרוליטר של מיקרוגרם אחד למיליליטר של ליזאט תאים שלילי DSP או DSP חיובי לצינורות המתאימים. ניתן להכין בקרה שלילית של תחרות פפטיד בשלב זה על ידי הוספת הפפטיד האימונוגני בריכוז שנקבע בניסויים ראשוניים לתערובת חרוזי הליזאט.

בקרה שלילית אפשרית נוספת שהוכנה בשלב זה היא תגובה חופשית של חיץ בלבד או ליזאט שהוכנה על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה רק לחרוזים. השהה בעדינות את החרוזים לתגובות הניסוי והבקרה. אין מערבולת מכיוון שהדבר יגרום לחרוזים להישבר לדגור בארבע מעלות עם סיבוב מקצה לקצה למשך שעתיים.

בתום שעתיים, הסר את הליזאט באמצעות המחזיק המגנטי. סובב במהירות ושטוף את החרוזים בסך הכל שש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר IP. דגירה של כל שטיפה בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

כדי להתחמק מהקומפלקסים הקשורים, הוסף מאגר דגימת ג'ל x אחד לצינור ה-IP ממש מעל גלולת החרוזים. כדי לאגד את החרוזים בתחתית הצינור, הקש בעדינות על תחתית הצינור כדי להשעות את כל החרוזים במאגר דגימת הג'ל. לחלופין, לבידוד זיקה חיסונית ב-30 מיקרוליטר של מאגר A בתוספת הפפטיד האימונוגני לחרוזים.

הריכוז הנדרש של הפפטיד האימונוגני נקבע באופן אמפירי. לאחר בדיקת טווח של 10 עד 200 מיקרומולר, דגרו את החרוזים בארבע מעלות למשך שעתיים, הקישו על הצינורות כל 30 דקות. השתמש במחזיק המגנטי כדי להסיר את 30 המיקרוליטר המכילים את הקומפלקסים החמקמקים ולשמור בשטיפת צינור נקייה עם מאגר IP ולשמור את החרוזים.

הוסף מאגר דגימת ג'ל אחד לחרוזים עבור שתי שיטות הפליטה. מחממים את החרוזים המגנטיים החיסוניים המושעיים מחדש במאגר דגימת ג'ל ב-75 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות בנוסף לדנטורציה של החלבונים. שלב זה גם יחתוך את מולקולת ה-DSP ויאפשר לפתור את החלבונים הבודדים בריצה המורכבת.

הדגימות בדף SDS ג'ל לכתמים מערביים. ניתן להדוף את החרוזים המגנטיים החיסוניים המרוקנים על ידי צנטריפוגה ולהוציא אותם מהדגימה עם מחזיק מגנטי לפני הטעינה. אם הזיקה החיסונית EUA נקייה מ-IgG הן על ידי כתם חלבון של דף SDS והן על ידי כתמים חיסוניים, היא מתאימה לספקטרומטריית מסה.

הנה דוגמה לכתם מערבי של חומר מליזאט תאים צולבים ולא מקושרים, ואחריו משקעים מגנטיים חיסוניים באמצעות נוגדן חד שבטי כנגד תת-היחידה AP 3. קישור צולב דלתא מאפשר זיהוי של חלבונים אינטראקטיביים שאינם נראים בדגימות שאינן מקושרות במהלך בידוד מגנטי חיסוני. בקרות שליליות לא הראו משיכת חלבון ספציפית כלפי מטה באמצעות בקרה נטולת נוגדנים ואיזוטיפ תואם נוגדנים באמצעות IgG המכוון כנגד קולטן הטרנספרין עבור דגימות שאינן מקושרות והן צולבות.

בדוגמה זו, נעשה שימוש בפליטת פפטיד זיקה כדי לשחזר את החלבונים הקשורים לנוגדני ה-IP. שימו לב שהנוגדן החיסוני נעדר בשבר הסופרנט ונשאר בשבר הפעימות במהלך פליטת הפפטיד. זה עתה הראינו לך כיצד לבודד קומפלקסים של MultiPro באמצעות ה-crosslinker הכימי DSP, ואחריו טיהור זיקה מגנטית חיסונית.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על תמיסות תאים וליזטים מקוררים כדי לשמור על אינטראקציות לא יציבות במהלך קישור צולב וכדי למזער את פעילות הפרוטאז. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.