ה-DNA מבוססי פרוטוקול זיהוי דגים המינים

מערכת זיהוי מיני הדגים היא שיטה פשוטה, מהירה ומדויקת מבוססת DNA לזיהוי מיני הדגים הקיימים בדגימה נתונה. דגימות דגים מטופלות בחלבון K כדי לשחרר חומצות גרעין לתמיסה. לאחר מכן מבודדים את ה-DNA הגנומי של הדגים ומגבירים את ה-PCR באמצעות פריימרים הנקשרים לרצפים הנמצאים בכל הגנומים של הדגים.

לאחר מכן, מוצרי ה-PCR מתעכלים עם שלושה אנזימי הגבלה שונים ונפתרים על הביו-אנלייזר Agilent 2100. ניתן להשתמש באורכי השברים המיוצרים בתגובות העיכול כדי לקבוע את מיני הדגים באמצעות פולימורפיזם אורך שבר הגבלה, או תוכנת התאמת דפוסי RFLP. היי, אני רייצ'ל פורמוזה מ-Agilent Technologies.

היום נראה לכם נוהל לזיהוי מיני דגים מבוססי DNA. הליך זה הוא שיטת סינון המאפשרת לזהות את מיני הדגים הקיימים בדגימות טריות, קפואות, טחונות, מבושלות, מיובשות או מעובדות אחרת. וניתן להשיג זאת בפחות מיום עבודה אחד.

אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור אותנטיות של פירות ים, שהיא חשובה מאוד לתעשיית פירות הים שכן להחלפה ותיוג שגוי יכולות להיות השלכות כלכליות, סביבתיות ובטיחות מזון משמעותיות. בנוסף, זה יכול להיות קשה במיוחד לקבוע מיני דגים על ידי זיהוי חזותי ושיטות מסורתיות אחרות. לאחר עיבוד דג, בדיקת DNA מספקת תוצאה הרבה יותר מדויקת ואמינה.

אז בואו נתחיל. התחל להכין דגימות למיצוי DNA על ידי הנחת 10 עד 1000 מיליגרם מכל דגימת רקמת דג גולמית או מבושלת בצינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לכל דג. דגימה ב -220 מיקרוליטר של תמיסת מארז חלבון טרי שהוכנה ופיפטה למעלה ולמטה.

דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחר צנטריפוגת הדגירה למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורה של 14,000 גרם כדי לגלול רקמות לא מעוכלות. לאחר מכן העבירו בזהירות 150 מיקרוליטר מכל סופרנטנט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר, תוך הימנעות מכל חומר לא מעוכל בתחתית וחומר שומני הקיים בחלק העליון. הסופרנטנט ישמש כעת למיצוי DNA גנומי.

התחל את מיצוי ה-DNA הגנומי על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר קשירת חומצות הגרעין לכל דגימה. זה יביא את נפח הדגימה הכולל ל-650 מיקרוליטר. מערבולת הדגימה עד להומוגניזציה.

לאחר מכן, העבירו כל דגימה לכוס ספין קושרת DNA שישבה באחד משני צינורות השקע של מיליליטר המסופקים בערכה. הצמידו את מכסה הצינור לחלק העליון של הסחיטה. סובב את הדגימות למשך דקה אחת ב-14,000 Gs כדי להעמיס את ה-DNA על מטריצת הספין.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את כוסות הסיבוב, השליך את התסנין והנח את הכוסות בחזרה בצינורות השקע. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר שטיפת מלח גבוה אחד. מכסים שוב את הצינורות והצנטריפוגה לאחר הצנטריפוגה.

השליכו את המסנן ושוב, הניחו את כוסות הסיבוב בחזרה בצינורות השקע. כעת הוסיפו 500 מיקרוליטר של 80% אתנול. מכסים את הצינור וסובבים על 14,000 גרם למשך דקה אחת.

חזור על שטיפת האתנול פעמיים נוספות לאחר הכביסה השלישית באתנול 80% שוב, השליך את המסננים. החזר את כוסות הסיבוב לצינורות השקע והפעם סובב במשך שתי דקות לייבוש מטריצת הסיבים. כעת העבירו את כוסות הסיבוב לצינורות איסוף של 1.5 מיליליטר.

הוסף מאגר אבולוציה של 100 מיקרוליטר לכל סיבוב ישירות על מטריצת הסיבים שבתוך הכוס. לאחר מכן הצמד את מכסי צינור האיסוף על כוסות הסיבוב ודגר אותם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר הדגירה, סובב את הדגימות במהירות מרבית למשך דקה אחת.

לאחר מכן, השליכו את הסיבוב וכסו את הצינורות. אם נמדדים ריכוזי DNA, צפויים ריכוזים הנעים בין חמישה ננוגרם למיקרוליטר ל-500 ננוגרם למיקרוליטר. כעת ניתן לאחסן את הדנ"א בארבע מעלות צלזיוס למשך עד חודש לאחסון לטווח ארוך, למקם את הדנ"א במינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס.

בצע PCR באמצעות הפריימרים והריאגנטים המסופקים בערכת הריאגנטים P-C-R-R-F-L-P. על פי הפרוטוקול הכתוב הנלווה, מומלץ להריץ כל דגימה, כולל בקרת האנטי אין תבנית החיובית בשכפול בזמן שה-PCR פועל. הכן תערובות מאסטר של אנזימי הגבלה לעיכול עם DTE E אחד, HAE שלוש ו-NL שלוש על ידי שילוב הרכיבים הבאים לפי הסדר, 1.5 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים, 0.5 מיקרוליטר של 10 x מאגר אנזים ו-0.5 מיקרוליטר של 10 x אנזים.

הכן מספיק לכל הדגימות בתוספת נפח תגובה אחד, עודף תערובת ארבעה שלושה ריאגנטים. לאחר מכן מחלקים 2.5 מיקרוליטר לכל צינור תגובה המסומן בשם הדגימה והאנזים. לאחר השלמת ה-PCR, הסר את הדגימות מהמחזור התרמי והנח אותן על קרח.

הוסף 2.5 מיקרוליטר מכל מוצר PCR לכל אחד משלושת צינורות עיכול ההגבלה לתגובה זו. DDE אחד HAE שלוש, ו-NLA שלוש. המערבולת הבאה.

צנטריפוגה קצרה ודגירה על העיכול ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. אם נוח יותר, ניתן לדגור את העיכול גם למשך הלילה. לאחר העיכול, דגרו את התגובות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של 60 מילי-מולרי EDTA לכל צינור כדי לסיים את התגובה והמערבולת. באמצעות ערכת הריאגנטים הביולוגית של Agilent, הכינו וטענו את תקציר ההגבלה לבארות של שבב DNA בהתאם למדריך הערכה. עבור כל דגימה, יש לטעון את כל שלושת התקצירים על אותו שבב.

לאחר מכן מערבל את השבב וטען אותו למכונה. לאחר סיום הריצה, עבור להקשר הבדיקה ובחר בכרטיסיית סיכום השבב. בשדה שם המדגם, הזן שם מדגם עבור כל 12 הבארות של השבב כדי לזהות את מיני הדגים עבור דגימות ה-DNA לבדיקה.

הפעל את תוכנית מפענח RFLP על ידי לחיצה על קובץ. לאחר מכן פתח את קובץ XAD. תיבת הדו-שיח הפתוחה תיפתח.

כעת בחר את קובץ ה-XAD עבור שבב ה-DNA בו נעשה שימוש. ולחץ על פתח כדי לראות רשימה של הדגימות שנטענו על השבב. בחר את שלושת התקצירים המתאימים לדגימת ה-DNA הראשונה.

תחת עמודת האנזים, ציין את אנזימי ההגבלה ששימשו בשדה המסומנים בגובה שיא מינימלי כאחוז מהסמן התחתון. ערך ברירת המחדל הוא 10%במידת הצורך. ניתן להוריד ערך זה כדי לזהות פסגות קטנות שהוחמצו או הועלו כדי להשליך פסגות הנובעות מרעש לא ספציפי באלקטרופרוגרמה.

לאחר ביצוע התאמות כלשהן לערך גובה השיא המינימלי, לחץ על שלב מחדש. כעת לחץ על calc בתחתית תיבת הדו-שיח. נתוני אורך השבר המתקבלים מהפעלת הביו-אנלייזר יאכלסו את שדות התוכנה.

הבא ברשימה הנפתחת של הניקוד בפינה הימנית העליונה של המסך, בחר קוביות. אם דגימת הדג מורכבת ממין דג יחיד או מתערובת, אם הדגימה עשויה להיות מורכבת מתערובת, הטבלה בתחתית המסך מסומנת ברשימת הניקוד המשולבת. ההתאמות הטובות ביותר של המינים מבוססות על התוצאות של כל שלוש תגובות העיכול.

התאמות מושלמות עם ציון אחד מודגשות בירוק. משחקים קרובים מודגשים בצהוב בחלק העליון של המסך. ערך החיתוך התחתון מציין את גודל השבר המינימלי המשמש בניתוח וערך סובלנות ההתאמה קובע עד כמה קרוב באורך שבר חייב להיות לשבר החזוי כדי להיחשב להתאמה.

הערך המוצג הוא הגדרות ברירת המחדל וניתן להתאמתו. חזור על שלבים אלה לניתוח דגימות ה-DNA הנותרות בקצה. דגימות DNA מארבעה מיני דגים שונים בודדו, הוגברו ועוכלו בשיטה המתוארת בסרטון זה.

ג'ל ביואנלייזר המציג את דגימות עיכול ההגבלה מוצג כאן באמצעות מפענח הביו-אנלייזר וה-RFLP של Agilent. דפוסי כיפוף תוכנה משמשים לזיהוי הדגים כאן. הדגימה הראשונה מזוהה נכון כפורל, השנייה כטונה, השלישית כאדמת סלע.

והדגימה האחרונה כבקלה ספציפית. זה עתה הראינו לכם כיצד לבצע זיהוי מיני דגים מבוססי DNA באמצעות שיטת P-C-R-R-F-L-P של אג'ילנט. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להימנע מזיהום צולב של דגימות מכיוון שהשיטה כל כך רגישה.

אז זהו. עכשיו אתם יודעים לזהות במהירות, בקלות ובדייקנות את מיני הדגים שנמצאים בדגימות שלכם. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.