Name: פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: חקור מערכת הדמיה אוטומטית לסקרינינג כימי בגדלי זברה טרנסגניים. השיטה מודדת השפעות תלויות מינון של BCI על ביטוי גן מדווח FGF באמבريונים בלוחות 96 בארים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומנת על ידי NICHD / NIH (1R01HD053287) כדי Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) כדי ווגט, NHLBI ו / NIH (1R01HL088016) כדי צאנג.

1) הגדרת הזדווגויות דג הזברה וטיפול BCI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני הטיפול, לזהות Tg זכר הומוזיגוטים (dusp6: d2eGFP) pt6 דג הזברה מקום בנפרד לתוך טנקים ההזדווגות 1. הוסף מפריד וסוג בר דגים AB * הנקבה ולהשאיר בכלובים ההזדווגות בין לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר להסיר מפריד, ולאסוף עוברים אחרי שעה 1. העברת עוברים למנות 100mm עם E3 (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4), פתרון לדגור על 28 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות. הסר מתים מופרית עוברים, להוסיף פתרון E3 טריים, דגירה בין לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין מהונדס עוברים לשלב דומה (24hpf) והביטוי GFP אחידה. מערך עוברים בנפרד לתוך הבאר כל צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון E3 עם עודף micropipette. הוסף 200μl של פתרון E3 עם pipettor רב ערוצי לתוך היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את התרכובות הבאות כמפורט: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> ב </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> ג </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mז) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ"מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> ריכוזים הסופי הם 1μM, 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI ב DMSO 1%. מכסים בנייר אלומיניום צלחת ו דגירה במשך 6 שעות 28 ° C. </li></ol> 2) אוטומטי הדמיה של 96-היטב צלחות ניתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10μl של tricaine (0.61mM) זה גם להרדים עוברים 30hpf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען לתוך צלחת מולקולרית התקנים Imagexpress Ultra. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תוכנה Metaxpress. בחר תצורה עם מטרה 4x ואת קוטר חריר מקסימלית, להגדיר לייזר פוקוס אוטומטי לזהות תחתית צלחת, ולקבוע אופטימלי Z-המטוס כדי לזהות אזורים של עניין. לרכוש תמונות על עירור / פליטה באורכי גל של 488/525 ננומטר (GFP). הגדר לסרוק שטח כאתר יחיד של 2000x2000 פיקסלים (4 x 4 מ"מ) עם binning לא. הגדרת כוח לייזר ולהשיג כזו האזורים הבהירים בתמונות בקרה חיובית לא מרווה. אישור הרכישה תמונה נכונה בכמה בארות בקרה חיוביים ושליליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל סריקה צלחת. המכשיר באופן אוטומטי לרכוש תמונות מכל הבארות וארכיון אותם נתונים של SQL Server. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלאת תמונות לתוך מפתחים Definiens באמצעות מודול יישום Cellenger ואת מסנן ייבוא ​​שמכירה פורמט התמונה מבנה קובץ שנוצר על ידי פלטפורמת התקנים מולקולריים Ultra Imagexpress. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך תמונות עם אלגוריתם אישית מעוצבת Network Technology קוגניציה (שמכונה גם ruleset). האלגוריתם, אשר אנו מותאם אישית שפותחה על בסיס ruleset שפורסם לאחרונה 2, נועד לזהות באופן אוטומטי העובר, חלמון, והראש, לכמת את הבהירות לאזור ה-GFP-לבטא מבנים הראש. וולס שבו אין העובר מזוהה או שבו ראש לא ניתן להקצות באופן חד משמעי (למשל, עם רעילות גבוהה או מחוץ למתחם של תמונות מוקד) אינם נכללים בניתוח. הגדר את האלגוריתם באמצעות כמה תמונות בקרה שלילית (הרכב מטופל) ותמונות בקרה חיובית (BCI מטופלים) כזה ראש חלמון מזוהים כהלכה בשני. הגדר "מבנים ראש" זיהוי סף כמו בכפולות של עוצמת חלמון אומר עד לגילוי של מבנים ראש בהיר תואם תצפית ויזואלית. הגדרת פרמטרים לייצא. בדוגמה זו, פרמטר אינפורמטיבי ביותר היה בהירות משולב הכולל של ה-GFP חיובי אזורים בתוך הראש, המכונה להלן "ראש הכולל מבנים בהירות" (איור 1). <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="דמות 1"> איור 1 גרף depicitng ההשפעות תלויות במינון של BCI על ביטוי של GFP בעוברים מהונדס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את האלגוריתם על כל התמונות צלחת באמצעות מתזמן עבודה משולבת. התוכנה משתמשת Definiens מחשוב מבוזר על כמה מעבדים ("מנועי"), דבר המאפשר ניתוח סימולטני של מספר רב של תמונות. האלגוריתם מחשב את צעדי מספריים על סמך תוצאות מתוך ניתוח התמונה, אשר נשמרים במסד הנתונים יחד עם עותק של התמונה מעובד, עם ניתוח מיושם. </li></ol> נציג תוצאות: אחרי כל התמונות מנותחות, נתונים ניתן דמיינו בתוך Cellenger או מיוצא תוכנות צד שלישי (Excel, GraphPad פריזמה) עבור ניתוח נוסף ייצוג גרפי. איור 2 מראה בארכיון לסרוק תמונות מרכב מטופלים BCI-יחס טוב, עם או בלי ניתוח CNT מיושם. איור 1 מסמכים השפעה תלוית מינון של BCI על ביטוי גנים GFP כתב Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 עוברים. הריכוז הדרוש לתגובה מקסימלית וחצי (EC50) היה כ 12 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="דמות 2"> איור 2 תמונה ללכוד ניתוח אוטומטי של העוברים דג הזברה מהונדס. (א) הרכב מטופל DMSO Tg (dusp6: d2eGFP) pt6 העובר על 30hpf. (ב) עוברים טראנסגנטי שטופלו להראות BCI 20μM עליות ביטוי של GFP. (ג) תמונה של העובר מן (א) לאחר הפעלת Definiens ruleset למצוא ביטוי של GFP בראש. כתמים כתומים מציינים שם תוכנה האמצעים עוצמת ה-GFP. (ד) העובר מקדימה של מ (ב ') לאחר שרץ Definiens ruleset למצוא ביטוי של GFP בראש. כתמים כתומים מציינים שם תוכנה האמצעים עוצמת ה-GFP. שים לב ruleset הצליח למצוא באזור המורחב של ה-GFP ביטוי בעובר טיפול.

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

הגורם העיקרי המגביל את התפוקה של מסכי דג הזברה כימיים היא חוסר מתודולוגיה לתהליך שיטתי 96-גם צלחות עבור הדמיה וניתוח. בגלל תמונות של אורגניזמים תאיים הם בניגוד מורכבים, נמוך, הטרוגנית בטבע, קיים ניתוח אלגוריתמים התמונה מצליחים לזהות ולכמת מבנים ספציפיים בתוך האורגניזם. רוב שפורסם כימיים מסכי דג הזברה ולכן כרוך בדיקה ויזואלית של בארות הפרט על ידי אנשי מוקדש בכל ההליך. בדרך כלל זה מונע את הדור של readouts מספרית מוחלטת בארכיון של תמונות מסך ונתונים. יתר על כן, הערכה ידנית מבטלת יתרונות מרכזיים של ההקרנה מבוססות תמונה, כלומר את היכולת לנהל ניתוח רטרוספקטיבי של ביצועי המסך, כדי לבחון שינויים פנוטיפי שלא היו המוקד העיקרי של הקמפיין ההקרנה (למשל, רעילות או ליקויים התפתחותיים) ו לחצות הפניה ההקרנה נתונים עם מסכי בעבר או בעתיד באמצעות ספריה המתחם זהה. בדו&quot;ח זה אנו מדגישים מתודולוגיה הדמיה ניתוח אוטומטי של עוברי דג הזברה בצלחות multiwell ללא התערבות המשתמש. אנחנו ללכוד תמונה אוטומטית על לייזר ImageXpress Ultra סריקה confocal הקורא (התקנים מולקולריים, Sunnyvale, CA) לתמונה Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 עוברים 96 צלחות היטב פיתחה אלגוריתם עיבוד תמונה מבוסס על טכנולוגיה &quot;Definiens רשת קוגניציה כי GFP לכמת ביטוי את ראשיהם של עוברי מהונדס. השיטה מועברת התגובות מדורגים לכמת בפעילות vivo של מולקולה קטנה activator של FGF איתות. תוצאות דומות התקבלו עם epifluorescence מבוססי ArrayScan II (Cellomics Inc, פיטסבורג רש&quot;פ) המתעדים כי ניתן ליישם לכידת תמונה אוטומטי של עוברי דג הזברה על מגוון רחב של קוראי צלחת זמינים מסחרית 2. פיתוח המתודולוגיה באופן אוטומטי לנתח תמונות אורגניזם רב לבטל את הצורך הבקיע חזותי על ידי הצופה האדם ואפשרה את הדור בארכיון של נתונים מספריים תמונות לניתוח רטרוספקטיבי השוואות עם מסכי בעתיד.

<table><tbody><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td >קטלוג מס׳ A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

אנו להדגים את היישום של התמונה מבוססי מתודולוגיה גבוהה תוכן ההקרנה (HCS) כדי לזהות מולקולות קטנות שיכולות לווסת את מסלול FGF / RAS / MAPK עוברי דג הזברה. העובר דג הזברה הוא אידיאלי עבור מערכת ב-high-vivo תוכן מסכי כימיים. עובר יום 1 הישן הוא כ 1 מ&quot;מ בקוטר יכול להיות ערוכים בקלות לתוך צלחות 96, טוב, פורמט סטנדרטי עבור הקרנת תפוקה גבוהה. במהלך היום הראשון של הפיתוח, עוברים הם שקופים עם רוב האיברים העיקריים הנוכחי, ובכך לאפשר הדמיה של היווצרות רקמות במהלך embryogenesis. אוטומציה מלאה של מסכי דג הזברה כימי הוא עדיין אתגר, לעומת זאת, במיוחד בפיתוח של רכישת התמונה ניתוח אוטומטי. אנחנו קודם שנוצר קו כתב מהונדס המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה של ​​פעילות FGF והפגינו השירות שלהם מסכי כימיים<sup&gt; 1</sup&gt;. כדי ליצור מתודולוגיה גבוהה מסכי התפוקה כל אורגניזם, פיתחנו מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של עוברי דג הזברה ב 24-48 שעות שלאחר ההפריה (hpf) ב 96-גם צלחות<sup&gt; 2</sup&gt;. בסרט זה אנו מדגישים את הליכי עריכה עוברים מהונדס לתוך צלחות multiwell ב 24hpf ועל תוספת של מולקולה קטנה (BCI) כי hyperactivates FGF איתות<sup&gt; 3</sup&gt;. הצלחות מודגרת במשך 6 שעות לאחר מכן על ידי תוספת של tricaine להרדים הזחלים לפני הדמיה אוטומטית על התקנים מולקולריים ImageXpress Ultra סריקת לייזר confocal HCS הקורא. תמונות מעובדים על ידי תוכנה המפתחים Definiens באמצעות רשת קוגניציה וטכנולוגיה האלגוריתם שפיתחנו כדי לזהות ולכמת ביטוי של GFP על ראשיהם של עוברי מהונדס. בדוגמה זו אנו מדגישים את היכולת של האלגוריתם כדי למדוד מינון תלויי השפעות BCI על הביטוי העיתונאי GFP גנים העוברים טיפול.

אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.

אנו מדגימים את היישום של מתודולוגיית סריקה בעלת תוכן גבוה (HCS) מבוססת תמונה, במטרה לזהות מולקולות קטנות שיכולות לווסת את מסלול ה-FGF/RAS/MAPK...

בסרטון זה מבוצע סינון בעל תוכן גבוה (high content screening) מבוסס דימות כדי להעריך מודולציה של מסלול ה-Rasm map kinase של גורם השאיפה לפיברובלסטים (fibroblast growth factor) באמצעות מולקולות קטנות. בעוברים של דגי זברופיש, מזברופיש זכר טרנסגני ונקבה מסוג פרא (wild type) מזביעים בכלוב גידול. ביצים מופרות נופלות לתחתית, נאספות ומועברות לצחנת פטרי. העוברים מדגרים למשך לילה, ולאחר מכן מונחים לבארים בודדות בלוח בעל 96 בארות עם תחתית עגולה.המולקולה הקטנה BCI מתווספת כדי להפעיל באופן מוגבר את סיגנל FGF, והפלטה מדגרה במשך שש שעות. תמונות מכל באר נלכדות באמצעות קורא פלטות קונפוקלי ומנותחות באמצעות אלגוריתם בעיצוב עצמי, המדווח על עוצמות פלואורסצנציה במבנים עובריים ספציפיים. שלום, אני היבה קאדו מהמעבדה של ד"ר מייקל צ'אנג במחלקה למיקרוביולוגיה וגנטיקה מולקולרית באוניברסיטת פיטסבורג.שלום, אני אנדראה ספוק ממכון גילוי התרופות של אוניברסיטת פיטסבורג. היום נראה לכם את ההליך של רבייה, בחירה וסידור של עוברים של דגי זברה לטיפול כימי. בפלטה של 96 בארות, נשתמש בעוברים טרנסגניים המדווחים על פעילויות של גורמי גדילה מסוג fibroblast growth factor אשר טופלו במולקולה המפעילה באופן יתר מסלול זה.נראה לכם כיצד אנו משתמשים במתודולוגיית סריקה בעלת תוכן גבוה (high content screening) כדי לרכוש, לנתח ולכמת באופן אוטומטי את הפעילות של גורם הגדילה של פיברובלסטים (fibroblast growth factor) בעוברים של דגי זברה טרנסגניים. הליך זה ידגיש טכנולוגיית פלטפורמה לניצול דגי זברה טרנסגניים וסריקות כימיות בתפוקה גבוהה. אז בואו נתחיל.יומיים לפני הטיפול, זהו זכרי דגי זברפיש טרנסגניים הומוזיגוטים והעביר אותם למכלי הזדווגות נפרדים. הוסף מפרידים למכלים, לאחר מכן הוסף נקבה מסוג פרא (wild type) לכל מכל והשאר את הדגים בכלובים להזדווגות למשך הלילה בטמפרטורה של 28 degrees Celsius. למחרת בבוקר, הסר את המפריד. לאחר שעה, העבר את הדגים למכל חדש ושפוך את העובריים למסננת פלסטיק.העבירו את העוברים למנות של 100 מילימטר עם תמיסת E3 והדגירו בטמפרטורה של 28 °C למשך שש עד שמונה שעות. לאחר ההדגרה, בחנו את העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאו. עוברים שיהיו מתאימים לניסויים יעברו גזציה.בשלב זה, יש להסיר עוברים שאינם מופרים, שיישארו בשלב התא הבודד. כמו כן, יש להסיר עוברים שאינם חיוניים, הנראים עכורים או מעוותים. לאחר מכן, יש להוסיף תמיסת E three טרייה ולדגור למשך לילה בטמפרטורה של 28 °C.ביום למחרת, הניחו את העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי כדי למיין את העוברים הטרנסגניים לפי שלב התפתחותי דומה וביטוי אחיד של GFP. עוברי 24 HPF מראים גבול גלוי בין המוח האמצעי לאחורי עם ביטוי GFP עז, ועיניים גבושות עם רשתית גבית חיובית ל-GFP. עוברים אלו פעילים ויזוזו ויתנו תנועות גוף בתוך הקוריון; ניתן להעבירם באמצעות פיפטת פסטור מפלסטיק.העבירו את 24 העוברים לאחר HPF, אחד בכל פעם, לבארות נפרדות בלוח 96 בארות. בעזרת מיקרו-פיפט, הסירו כל שארית של תמיסת E three מהבארות. לאחר מכן, בעזרת פיפט רב-ערוצי, הוסיפו 200 µL של תמיסת E three לכל בארה.לאחר מכן, הוסיפו 2 µL של DMSO לכל הבארים בעמודות 1 ו-12. לאחר מכן, הוסיפו 2 µL של BCL שהוכן ב-DMSO באופן הבא: 1 µM לעמודות 2 ו-7, 5 µM לעמודות 3 ו-8, 10 µM לעמודות 4 ו-9, ו-20 µM לעמודות 5 ו-10.מיקרומולרי לעמודות חמש ו-10. ולבסוף 25 מיקרומולרי לעמודות שש ו-11. כעת כסו את הפלטה בנייר אלומיניום והדגרו אותה במשך שש שעות ב-28 °C.הוסיפו 10 µL של trica לכל באר כדי להרדיים את העוברים בגיל 30 HPF. לאחר מכן, הכניסו את הפלטה למערכת molecular devices image express ultra תחת תוכנת open meta express. בחרו תצורה עם עדשת Forex וקוטר pinhole מקסימלי.הגדירו את המיקוד האוטומטי של הלייזר כך שיזהה את תחתית הפלטה וישתמש ב-Z offset אופטימלי שנקבע מראש. כדי לזהות את אזורי העניין, הגדירו את שטח הסריקה כאתר בודד של 2000 על 2000 פיקסלים ללא benning. בחרו את סוג הפלטה המתאים ואת לייזר הארגון ב-488 nanometer בעירור מעל אורכי גל פליטה של 488 מעל 525 nanometers.לאחר מכן, בחרו באבאר המכילה עובר שטופל בחומר נשאי (vehicle) ולחצו על find sample. המכשיר יבצע סריקת מיקוד אוטומטית ויקלוט תמונה אחת כדי לאשר רכישה תקינה של התמונה. בחרו באקראי אבאר שטופלה בחומר נשאי וקלטו תמונה.אם התמונה ממוקדת ומראה ביטוי GFP בראש, מקמו את הסמן מעל האזורים הבהירים ביותר ווידאו שעוצמת הפלואורסצנציה היא בטווח של המצלמה בעלת 16 הביטים, כלומר פחות מ-65,000 יחידות.חזור על שלבים אלו עם בקרת רכב (vehicle control) נוספת ומספר בארות שעובדו עם תרכובת. אם יש צורך, התאם את עוצמת הלייזר ואת ההגבר (gain) כך שהאזורים הבהירים ביותר בתמונות של הבקרה החיובית לא יגיעו לרוויה. לאחר מכן, בחלון רכישת השליטה בלוחית, בחר ב-acquire plate כדי להתחיל את סריקת הלוחית.המכשיר ירכוש באופן אוטומטי תמונה אחת לכל באר עבור כל המיקרופלטה ויאסוף אותן למסד נתונים של שרת SQL. לאחר סיום הסריקה, העלה את התמונות ל-D definition's. פתח את ה-developer עם אפשרות ה-slinger מופעלת.צרו מרחב עבודה חדש. לאחר מכן, בתפריט הקובץ, בחרו בייבוא מותאם אישית (customized import). בשלב הבא, נווטו לתיקייה המכילה את התמונות ופתחו קובץ לדוגמה.בחר מסנן ייבוא המזהה את פורמט התמונה ומבנה הקובץ שנוצרו על ידי פלטפורמת ה-image express ultra של molecular devices. כעת, כדי לעבד את התמונות, פתח תמונת בקרה וטען את טכנולוגיית רשת הקוגניציה הרצויה, או את אלגוריתם ה-CNT, או את מערכת הכללים. האלגוריתם המותאם אישית המשמש כאן תוכנן לזהות באופן אוטומטי את העובר, החלמון והראש, ולכמת את הבהירות והשטח של מבני ראש המבטאים GFP; הפעל את מערכת הכללים עד לשלב זיהוי הראש והחלמון.כדי להבטיח שיוך נכון של שק החלמון והראש, שנו את מערכת הכללים כדי להתאים את סף הגילוי של החלמון במקרים שבהם החלמון גדול מדי או קטן מדי. לאחר מכן, הפעילו את מערכת הכללים עד לשלב הגילוי של מבני ראש בהירים. כדי להבטיח שיוך נכון של אזורים המבטאים GFP בראש, שנו את מערכת הכללים כדי להתאים את סף הגילוי של מבני הראש ככפולות של עצימות מינימלית, עד שגילוי מבני הראש הבהירים תואם לתצפית הוויזואלית.בשלב הבא, בצעו ידנית את כל מערכת הכללים על מספר תמונות שנבחרו באופן אקראי, אשר הופקו מעוברים שעברו טיפול בשלילי (vehicle) ומתוך תמונות של בקרה חיובית מעוברים שעברו טיפול ב-PCI. כדי להריץ את האלגוריתם על כל תמונות הפלטה, בחרו את הפלטות לניתוח ובחרו ב-Analyze, ולאחר מכן נווטו למערכת הכללים המותאמת (optimized rule set) ובצעו ניתוח לכל הבארים.באמצעות מתזמן המשימות המובנה, בארות ריקות או תמונות מעורפלות יוחרגו אוטומטית מהניתוח במהלך הסריקה. מפה של הבארות שנשמרו (keep map) המוצגת בעדכון רציף תופיע על המסך. הן הנתונים והן התמונות נגישים במהלך ההרצה לצורך בדיקה ויזואלית.הנתונים המספריים והתמונות המעובדות נשמרים באופן אוטומטי. לאחר ניתוח כל התמונות, ניתן לייצא את הנתונים לתוכנות צד שלישי כגון Excel, GraphPad או prism. איור זה מציג תמונות סריקה מארכיון של באר שעברה טיפול ברכב ובאר שעברה טיפול BCI, עם ובלי ניתוח CNT.חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שיושם מזוהה בעין, בגבול שבין המוח האמצעי לאחורי ובגנגליון התריגמין של עוברים טרנסגניים. שימו לב כי הן עצימות ה-GFP והן תחומי הביטוי מורחבים. בעוברים שטופלו ב-BCI המוצגים כאן, נראה השפעה תלוית-מינון של BCI על ביטוי הגן המדווח GFP בעוברים טרנסגניים.הריכוז הדרוש להשגת תגובה מקסימלית של מחצית, או EC 50, היה בערך 12 micromolar. הרגע הדגמנו כיצד להרביע, לאסוף ולסדר עוברים של דגי זברה טרנסגניים בלוחות של 96 בארות. הוספנו ריכוזים עולים של PCI כפעיל של מסלול האיתות.הראינו גם כיצד להפוך לאוטומטי את הדימות של עוברים טרנסגניים וניתחנו את התמונות באמצעות אלגוריתם שתוכנן במיוחד המבוסס על טכנולוגיית רשת קוגניציה. באמצעות גישה זו, יכולנו למדוד באופן כמותי ומדורג את ההשפעות של מולקולה קטנה המפעילה את השליח של fibroblast growth factor. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבחור את העוברים בקפידה כדי לצמצם את השונות בין הדגימות.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

development-automated-imaging-analysis-for-zebrafish-chemical

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

כאן אנו מתארים assay הרומן גבוהה תוכן דלקת הנגרמת כימית מכוון לזיהוי modulatory החיסון bioactives. יש לנו שילוב בהצלחה מיקרוסקופ עם אוטומטיות מותאמות אישית סקריפטים תוכנה שפותחו המאפשרים כימות אוטומטי של התגובה הדלקתית כמו גם עוד עיבוד נתונים, ניתוח, כרייה, ואחסון.

גילוי תרופות בהנחיית: Assay אוטומטי גבוהים תוכן דלקת דג הזברה

במאמר זה, עוברים של דגי זברה משמשים לבדיקת רעילות כימית. רעילות כימית מתואמת עם קריאות פנוטיפ. פרוטוקול הדגימה מציג גישה מתודולוגית לביצוע בדיקת רעילות כימית.

מסך רעילות כימית מבוסס עוברים: הערכת השפעות על התפתחות עוברים של דגי זברה

אנו מתארים את ההליך וניתוח נתונים של מערכת כימית הקרנה לאיתות הורמון לחץ glucocorticoid באמצעות זחלי דג הזברה: assay תגובה Glucocorticoid בvivo דג הזברה בלוציפראז הפעילות (GRIZLY). Assay ברגישות ובאופן ספציפי מזהה השפעות על איתות glucocorticoid ידי תרכובות שתידרשנה metabolization או להשפיע על ייצור glucocorticoid אנדוגני.

הליך מיון כימי לGlucocorticoid איתות עם מערכת כתב דג הזברה הזחל בלוציפראז

המעבדה שלנו פיתחה מערכת שהיא שימושית לצורך זיהוי של כמה התנהגויות שונות בזחלי דג הזברה 7 ימים בת הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה רומן. המערכת יכולה לשמש לאיתור שינויים עדינים בהתנהגות לאחר הזחלים שנחשפו לרעלים או תרופות סביבתיים.

ניתוח התנהגות תפוקה גבוהה אוטומטי בזחלי דג הזברה

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

כאן, אנו מציגים לפרוטוקול תכנון, הרכיבו את העובר דג זברה סידור במערך תבנית, ולאחריו נוהל מפורט על השימוש של תבנית כזו עבור תפוקה גבוהה דג זברה סידור במערך העובר לתוך צלחת 96-ובכן.

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

עוברי דג משמשים להערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הם מפתחים מבחוץ ורגישים לכימיקלים, ומאפשרים זיהוי של שינויי פנופאיות עדינים. הניסוי דורש רק כמות קטנה של תרכובת, אשר מתווסף ישירות לצלחת המכילה עוברים, מה שהופך את מערכת הבדיקה יעילה וחסכונית.

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

אנו מתארים את זרימת העבודה וניתוח הנתונים של מערכת סינון להערכת רעילות של תרכובות כימיות בהתבסס על תגובת הבהלה של רטט עובר דג הזברה. המערכת מתעדת את תנועותיהם של עוברי דגי זברה בחשיפה לגירוי רטט ומאפשרת הערכה משולבת של רעילות/קטלניות כללית ורעילות עצבית-שרירית.

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

חקור מערכת הדמיה אוטומטית לסקרינינג כימי בגדלי זברה טרנסגניים. השיטה מודדת השפעות תלויות מינון של BCI על ביטוי גן מדווח FGF באמבريונים בלוחות 96 בארים.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

גלה סרטונים נוספים