פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.
24 ביוני 2010
אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.
בסרטון זה מבוצע סינון בעל תוכן גבוה מבוסס דימות כדי להעריך מודולציה של נתיב ה-Rasm map kinase של גורם הגדילה של פיברובלסטים באמצעות מולקולות קטנות. בעוברים של דגי זברופיש, זכרים טרנסגניים ונקבות פרא (wild type) מושבחים בכלוב גידול. ביצים מופיות נופלות לתחתית, נאספות ומועברות לכלי פטרי. העוברים מדגרים למשך לילה, ולאחר מכן מועברים לבארים בודדות בלוח 96 בארות בעל תחתית עגולה.
הקטן BCI מתווסף כדי להפעיל באופן מוגבר את סיגנל ה-FGF, והפלטה מדגרה למשך שש שעות. תמונות מכל באר נלכדות באמצעות קורא פלטות קונפוקאלי ומנותחות באמצעות אלגוריתם בעיצוב עצמי המדווח על עצימויות פלואורסצנציה במבנים עובריים ספציפיים. שלום, אני היבּא קדו מהמעבדה של ד"ר מייקל צ'אנג במחלקה למיקרוביולוגיה וגנטיקה מולקולרית באוניברסיטת פיטסבורג.
שלום, אני אנדריאה ספוק ממכון לגילוי תרופות של אוניברסיטת פיטסבורג. היום נראה לכם את ההליך להרבייה, בחירה וסידור של עוברי דגי זהב עבור טיפול כימי. בלוחית של 96 בארות, נשתמש בעוברי טרנסגניים המדווחים על פעילויות של גורמי גדילה מסוג FGF, אשר יטופלו במולקולה המפעילה באופן מוגבר נתיב זה.
נראה לכם כיצד אנו משתמשים במתודולוגיה של סריקה בעלת תוכן גבוה (high content screening) כדי לרכוש, לנתח ולכמת באופן אוטומטי את הפעילות של גורם גידול פיברובלסטים בעוברים של דגי זברה טרנסגניים. הליך זה ידגיש טכנולוגיית פלטפורמה לניצול דגי זברה טרנסגניים וסריקות כימיות בסביבה בעלת תפוקה גבוהה. אז בואו נתחיל.
יומיים לפני הטיפול, זהו זכרים טראנסגניים הומוזיגוטים של דגי זברפיש והעבר אותם למכלי הרבעה נפרדים. הוסף מפרידים למכלים, ולאחר מכן הוסף נקבה מסוג פרא (wild type) לכל מכל והשאר את הדגים בכלוב ההרבעה למשך הלילה בטמפרטורה של 28 degrees Celsius. למחרת בבוקר, הסר את המפריד. לאחר שעה אחת, העבר את הדגים למכל חדש ושפוך את העובריים למסננת פלסטיק.
העבירו את העוברים לצלוחיות של 100 millimeter עם תמיסת E three והדגירו בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך שש עד שמונה שעות. לאחר ההדגרה, בחנו את העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאו. עוברים המתאימים לניסויים יהיו בשלב הגסטולציה.
בשלב זה, הסירו עוברים שלא הופרו, אשר יישארו בשלב התא הבודד. כמו כן, הסירו עוברים שאינם בני חיים, הנראים עכורים או מעוותים. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת E three רעננה והדגרירו למשך לילה בטמפרטורה של 28 °C.
ביום למחרת, הניחו את העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי כדי למיין את העוברים הטרנסגניים לפי שלב התפתחותי דומה ואחידות. עוברים עם ביטוי GFP ב-24 HPF מראים גבול גלוי בין המוח האמצעי לאחורי עם ביטוי GFP אינטנסיבי ועיניים גובשות עם רשתית גבית חיובית ל-GFP. עוברים אלו פעילים ויזוזו וירתעו בתוך הכוריון בעזרת פיפטה פלסטית.
העבירו את העוברים בני 24 HPF אחד אחד לבארות בודדות בלוחית 96 בארות. באמצעות מיקרופיפט, הסירו עודפי תמיסת E three מהבארות. לאחר מכן, באמצעות פיפט רב-ערוצי, הוסיפו 200 µL של תמיסת E three לכל בארה.
בשלב הבא, הוסיפו 2 µL של DMSO לכל הבארים בעמודות 1 ו-12. לאחר מכן, הוסיפו 2 µL של BCL שהוכן ב-DMSO באופן הבא: 1 µM לעמודות 2 ו-7, 5 µM לעמודות 3 ו-8, 10 µM לעמודות 4 ו-9, ו-20 µM לעמודות 5 ו-10.
מיקרומולרי לעמודות חמש ו-10. ולבסוף 25 מיקרומולרי לעמודות שש ו-11. כעת כסו את הפלטה בנייר אלומיניום והדגירו אותה למשך שש שעות ב-28 °C.
הוסיפו 10 µL של trica לכל באר כדי להרדימ את העוברים ב-30 HPF. לאחר מכן, הכניסו את הפלטה למכשיר molecular devices image express ultra והפעילו את תוכנת meta express. בחרו תצורה עם עדשת Forex וקוטר pinhole מקסימלי.
הגדירו את המיקוד האוטומטי של הלייזר כך שיזהה את תחתית הפלטה וישתמש ב-Z offset אופטימלי שנקבע מראש. כדי לזהות את אזורי העניין, הגדירו את שטח הסריקה כאתר בודד של 2000 על 2000 פיקסלים ללא benning. בחרו את סוג הפלטה המתאים ואת לייזר הארגון בעוצמה של 488 nanometer עבור אורכי גל של עירור מעל פליטה של 488 מעל 525 nanometers.
לאחר מכן, בחרו באבאר המכילה עובר שטופל בביקורת (vehicle) ולחצו על Find Sample. המכשיר יבצע סריקת מיקוד אוטומטית וידגים תמונה אחת כדי לאשר את רכישת התמונה התקינה. בחרו באופן אקראי באבאר שטופלה בביקורת ורכשו תמונה.
אם התמונה ממוקדת ומראה ביטוי GFP בראש, מקמו את הסמן מעל האזורים הבהירים ביותר וודאו שעוצמת הפלואורסצנציה נמצאת בטווח של המצלמה בעלת ה-16 bit. פחות מ-65,000 יחידות.
חזרו על שלבים אלו עם בקרת רכב (vehicle control) נוספת ומספר בארות שעובדו עם תרכובת. במידת הצורך, כוונותו את הספק הלייזר ואת ההגבר (gain) כך שהאזורים הבהירים ביותר בתמונות של בקרת החיוביות לא יסבלו מרוויה. לאחר מכן, בחלון רכישת הלוח והבקרתו, בחרו ב-acquire plate כדי להתחיל בסריקת הלוח.
המכשיר ירכוש באופן אוטומטי תמונה אחת לכל באר עבור כל המיקרופלטה ויאחסן אותן במסד נתונים של שרת SQL. לאחר סיום הסריקה, העלה את התמונות ל-D definition's. פתח את ה-developer עם אפשרות ה-slinger מופעלת.
צרו סביבת עבודה חדשה. לאחר מכן, בתפריט הקובץ, בחרו בייבוא מותאם אישית. כעת, נווטו לתיקייה המכילה את התמונות ופתחו קובץ לדוגמה.
בחרו מסנן ייבוא המזהה את פורמט התמונה ומבנה הקובץ שנוצרו על ידי פלטפורמת ה-molecular devices image express ultra. כדי לעבד את התמונות, פתחו תמונת בקרה וטענו את טכנולוגיית רשת הזיהוי הרצויה, או את אלגוריתם ה-CNT או את סט הכללים. האלגוריתם המותאם אישית המשמש כאן תוכנן לזהות באופן אוטומטי את העובר, החלמון והראש, ולכמת את הבהירות והשטח של מבני ראש המבטאים GFP; הפעילו את סט הכללים עד לשלב זיהוי הראש והחלמון.
כדי להבטיח השמה נכונה של שק החלמון והראש, שנו את מערכת הכללים כדי להתאים את סף הגילוי של החלמון במידה והחלמון גדול מדי או קטן מדי. לאחר מכן, הפעילו את מערכת הכללים עד לשלב הגילוי של מבני ראש בהירים. כדי להבטיח השמה נכונה של אזורים המבטאים GFP בראש, שנו את מערכת הכללים כדי להתאים את סף הגילוי של מבני הראש ככפולות של העוצמה המינימלית, עד שגילוי מבני הראש הבהירים יתאים לתצפית הוויזואלית.
לאחר מכן, בצעו את כל סט הכללים באופן ידני על מספר תמונות שנבחרו באופן אקראי והופקו מעוברים שטופלו ב-vehicle, וכן על תמונות של ביקורת חיובית מעוברים שטופלו ב-PCI. כדי להריץ את האלגוריתם על כל תמונות הפלטות, בחרו את הפלטות לניתוח ובחרו ב-Analyze, לאחר מכן עברו לסט הכללים המותאם (optimized rule set) ונתחו את כל הבארים.
באמצעות מתזמן המשימות המובנה, בארות ריקות או תמונות מעומבנות יוחרגו באופן אוטומטי מהניתוח במהלך הסריקה. מפת שמירה המתעדכנת באופן רציף מוצגת על המסך. הן הנתונים והן התמונות נגישים במהלך ההרצה לצורך בדיקה ויזואלית.
הנתונים המספריים והתמונות המעובדות נשמרים באופן אוטומטי. לאחר שכל התמונות נותחו, ניתן לייצא את הנתונים לתוכנות צד שלישי כגון Excel, GraphPad או prism. איור זה מציג תמונות סריקה מאורכבות מרכב שעבר טיפול ומרכב שעבר טיפול BCI, עם ובלי ניתוח CNT.
חלבון פלואוריסצנטי ירוק (GFP) שהוחלל מזוהה בעין, בגבול שבין המוח האמצעי לאחורי ובגנגליונים הטריגמינליים של עוברים טרנסגניים. שימו לב כי הן עצימות ה-GFP והן תחומי הביטוי התרחבו. בעוברים שטופלו ב-BCI כאן, נראה השפעה תלויית מינון של BCI על ביטוי הגן השמאח (reporter gene) של GFP בעוברים טרנסגניים.
הריכוז הנדרש לעירור תגובה מקסימלית של חצי, או EC 50, היה בערך 12 micromolar. הראינו לכם כיצד להרביע, לאסוף ולסדר עוברים של דגי זברה טרנסגניים בלוחיות 96 באר. הוספנו ריכוזים עולים של PCI כמפעיל של נתיב השליח.
הדגמנו גם כיצד לבצע אוטומציה של הדמיית עוברים טרנסגניים וניתחנו את התמונות באמצעות אלגוריתם בעיצוב מותאם אישית המבוסס על טכנולוגיית רשתות קוגניציה. באמצעות גישה זו, יכולנו למדוד באופן כמותי ובצורה מדורגת את ההשפעות של מולקולה קטנה המפעילה את סיגנלציה של fibroblast growth factor. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבחור את העוברים בקפידה כדי למזער את השונות בין הדגימות.
זהו. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מערכת לדימות וניתוח אוטומטיים של עוברים טרנסגניים של דגי זברא (zebrafish) בלוחיות מולטי-וול (multiwell plates). הוא מדגים את היכולת למדוד השפעות תלויות-מינון של המולקולה הקטנה BCI על ביטוי גן ד reporter של גורם גידול פיברובלסטים (Fibroblast Growth Factor), ובכך מסייע לביצוע סריקות כימיות בעלות תפוקה גבוהה בדגי זברא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה התפתחותית
- סריקה בשפיעות גבוהה
רקע
- דגי זברה משמשים נפוצה כאורגניזם מודל בביולוגיה של ההתפתחות.
- דגי זברה טרנסגניים יכולים לבטא חלבונים פלואורסצנטיים, מה שמאפשר ויזואליזציה של ביטוי גנים.
- סריקה בעלת תוכן גבוה (High-content screening) מאפשרת ניתוח של מספר דגימות בו-זמנית.
- ש 이는 של גורם גדילה של פיברובלסטים (FGF) חיונית לתהליכי התפתחות שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת דימוי בתפוקה גבוהה עבור עוברים של דגי זברה.
- הערכת ההשפעות של מולקולות קטנות על סיגנל FGF.
- אוטומציה של ניתוח ביטוי גנים בדגי זברה טרנסגניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכשרה של דגי זברפיש טרנסגניים ואיסוף עוברים.
- דגירה של עוברים בפלטות רב-בארים עם ריכוזים משתנים של BCI.
- דימוג אוטומטי באמצעות קורא פלטות קונפוקאלי.
- ניתוח עצימויות פלואורסצנציה באמצעות אלגוריתם ייעודי.
תוצאות עיקריות
- דימוי וניתוח מוצלחים של עוברי דגי zebrafish בפורמט של סריקה רב-דגימתית (high-throughput).
- הדגמה של השפעות תלויות-מינון של BCI על סיגנל FGF.
- ניתוח אוטומטי סיפק כימות מהימן של ביטוי גנים.
- ביסוס פלטפורמה לסריקה כימית עתידית בדגי zebrafish.
מסקנות
- המערכת שפותחה משפרת את היעילות של סריקות כימיות בדגי זהב (zebrafish).
- היא מספקת כלי בעל ערך לחקר אותיות FGF במהלך ההתפתחות.
- ניתן להחיל מתודולוגיה זו על מולקולות קטנות ונתיבי סיגנל אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות ואנליזה אוטומטיים של עוברים של דג הזברה מאפשרים הערכה רחבה של מודולציה של מסלולי איתות in vivo, ובכך תומכים בתיקוף מוקדם של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי. גישה זו מספקת מדדים כמותיים התלויים במינון, המשפרים את הביטחון החזוי בהשפעות של תרכובות על פעילות מסלול ה-FGF/RAS/MAPK. דבר זה ממתג את השיטה כגשר תרגומי בין סריקה פנוטיפית לזיהוי מובילים (lead identification) במחקר ופיתוח בביו-פארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מודולציה של שסורב FGF במערכת חולייתית רלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות אוטומטי של ביטוי רפורטר GFP במבני ראש עובריים.
- ערך ניבוי: מייצר נתוני EC50 (כ-12 micromolar עבור BCI) לצורך הנחיית קשרי מבנה-פעילות ומיון תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר תוצאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של עוצמה פלואורסצנטית מפורמטים של פלטות בעלות 96 בארות, התואמים לזרימות עבודה של סריקה רחבה (high-throughput).
- יכולת הרחבה: מאפשר סידור של עוברים טרנסגניים בגיל 24 hpf לטיפול בתרכובות ובדימות אוטומטית באמצעות קוראי HCS קונפוקליים.
- תועלת האלגוריתם: אלגוריתם Cognition Network Technology מותאם אישית מזהה ומכמת ביטוי של GFP באזורים עובריים מוגדרים, מה שמאפשר הערכה מהימנה של התרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: שימוש בעוברי דג זברה בגיל 24-48 hpf, שלב התפתחותי שבו האיברים כבר נוצרו והרקמות שקופות, מה שתומך בהסברה (extrapolation) ממודלים של in vivo לשלב הפרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מדידת תגובות ספציפיות למסלול (אקטיבציה של FGF) כדי להבחין בין השפעות של תרכובות על המטרה (on-target) לבין השפעות חוץ-מטרה (off-target).
- הלימה של סמנים ביולוגיים: ביטוי של GFP reporter משמש כסמן ביולוגי תרגומי למודולציה של מסלול ה-FGF, הניתן לגילוי באמצעות ניתוח תמונות אוטומטי.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, תומכת בבדיקת השערות בתהליכי תיקוף מטרה (target validation) ומאפשרת פיתוח סקלאבילי של בדיקות (assays) עבור קמפיינים לזיהוי מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: מסייע להבהרת מסלולים ולביסוס הביטחון במטרה באמצעות ניתוח תגובה למניה של מודולציה של איתות FGF.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות רכישת תמונות וניתוח אוטומטיים, המבטיחים הדירות בין ריכוזי תרכובות שונים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (עוצמת GFP ושטח) המאפשרות השוואה בין עוצמה ויעילות של תרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי שימוש בעוברים של חולייתנים בעלי מסלולי איתות שמורים ואורגנוגנזה נראית לעין.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לסריקה של מולקולות קטנות ומסלולי איתות מרובים באמצעות רפורטרים טרנסגניים ניתנים להחלפה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במודולציה של המטרה ומפחית עמימות מכניסטית בשלבי סריקה מוקדמים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות דימות אוטומטי וניתוח מבוסס אלגוריתם.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקה של התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים ותלויים במינון על פעילות המסלול.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף של תרכובות מותאם סיכון בהתבסס על EC50 ומדדי תגובה מקסימלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול דגי zebrafish, טיפול בעוברים טרנסגניים ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי במכשור לסריקה בעלת תוכן גבוה במיקרוסקופ קונפוקאלי (למשל, Molecular Devices ImageXpress Ultra) ובתוכנה לניתוח תמונות (Definiens Developer).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור שלבי התפתחות העובר, הכנת תרכיבים ופרמטרים של רכישת תמונות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום האלגוריתם עבור רפורטרים טרנסגניים שונים או מבנים עובריים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בין העוברים ואת הצורך בבחירה קפדנית של הדגימות כדי למזער רעשים, כפי שצוין בפרוטוקול.
