פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.
24 ביוני 2010
אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.
בסרטון זה, מבוצעת הקרנת תוכן גבוה מבוססת תמונה כדי להעריך אפנון מבוסס מולקולות קטנות של גורם הגדילה הפיברובלסטים, מסלול קינאז של מפת Rasm בעוברי דג זברה, זכר טרנסגני ונקבה מסוג בר מזדווגים בכלוב רבייה. ביצים מופרות נופלות בתחתית ונאספות ומועברות לצלחת פטרי. העוברים מודגרים למשך הלילה, ואז מכניסים אותם לבארות בודדות של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות.
המולקולה הקטנה BCI מתווספת לאיתות FGF היפר-אקטיבי והצלחת מודגרת למשך שש שעות. תמונות מכל צוואה נלכדות באמצעות קורא לוחות קונפוקלי ומנותחות באמצעות אלגוריתם שתוכנן בעצמו המדווח על עוצמות פלואורסצנטיות במבנים עובריים ספציפיים. היי, אני היבה קאדו מהמעבדה של ד"ר מייקל צ'אנג במחלקה למיקרוביולוגיה וגנטיקה מולקולרית באוניברסיטת פיטסבורג.
היי, אני אנדריאה ספוק מהמכון לגילוי תרופות באוניברסיטת פיטסבורג. היום נראה לכם את הליך הרבייה, הבחירה והסידור של עוברי דגי זברה לטיפול כימי. בצלחת של 96 בארות, נשתמש בעוברים טרנסגניים המדווחים על פעילויות גורם גדילה מפיברגלס ומטופלים במולקולה שמפעילה יתר על המידה את הלבן האחרון.
אנו נראה לך כיצד אנו משתמשים במתודולוגיית סינון תוכן גבוה כדי לרכוש, לנתח ולכמת באופן אוטומטי את פעילות גורם הגדילה הפיברובלסטים בעוברי דגי זברה מהונדסים. הליך זה ידגיש את טכנולוגיית הפלטפורמה לניצול דגי זברה טרנסגניים ומסכים כימיים בעלי תפוקה גבוהה. אז בואו נתחיל.
יומיים לפני הטיפול, זהו דגי זברה טרנסגניים זכרים הומוזיגוטיים והניחו אותם במיכלי הזדווגות בודדים. הוסף מפרידים למיכלים, ואז הוסף דג נקבה מסוג בר לכל אקווריום והשאיר את הדגים בכלובי ההזדווגות למשך הלילה ב-28 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, הסר את המפריד לאחר שעה, העבירו את הדג למיכל חדש ושפכו את העוברים למסננת פלסטיק.
מעבירים את העוברים לתבשילים של 100 מילימטר עם תמיסת E 3 ודוגרים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך שש עד שמונה שעות. לאחר הדגירה יש לבחון את העוברים במיקרוסקופ סטריאו. עוברים המתאימים לניסויים יעברו גזים.
בשלב זה, הסר את כל העוברים הלא מופרים, שיישארו בשלב התא הבודד. כמו כן, הסר עוברים שאינם ברי קיימא שנראים אטומים או מעוותים. לאחר מכן מוסיפים תמיסת E 3 טרייה ודוגרים למשך הלילה בחום של 28 מעלות צלזיוס.
למחרת, הניחו את העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי כדי למיין את העוברים הטרנסגניים לשלב דומה ואחיד. ביטוי GFP 24 עוברי HPF מראים גבול מוח אחורי גלוי עם ביטוי GFP אינטנסיבי ועיניים מעוצבות היטב עם רשתית גב חיובית GFP. עוברים אלה פעילים וינועו ויתנדנדו בקוריון שלהם באמצעות פיפטת מרעה מפלסטיק.
העבירו את 24 עוברי ה-HPF בזה אחר זה לבארות בודדות של צלחת של 96 בארות. בעזרת מיקרו פיפטה, הסר את כל תמיסת E 3 העודפת מהבארות. לאחר מכן בעזרת צינור רב ערוצי, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת E שלוש לכל באר.
לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של DMSO לכל הבארות בעמודות 1 ו-12. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטרים של BCL שהוכנו ב-DMSO כדלקמן, אחד, מיקרו-טוחנת לעמודות שתיים ושבע. חמש מיקרומולר לשלוש ושמונה, 10 מיקרומולר לארבע ותשע 20.
מיקרוטולר לעמודות 5 ו-10. ולבסוף 25 מיקרומולר לעמודה 6 ו-11. כעת מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדגרים אותה במשך שש שעות בחום של 28 מעלות צלזיוס.
הוסף 10 מיקרוליטר טריקה לכל באר כדי להרדים את 30 עוברי HPF. לאחר מכן טען את הצלחת לתוך מכשירים מולקולריים תמונה אקספרס פתוחה במיוחד של תוכנת מטא אקספרס. בחר תצורה עם מטרת מט"ח וקוטר חור מקסימלי.
הגדר את המיקוד האוטומטי של הלייזר כדי לזהות את תחתית הצלחת ולהשתמש בהיסט Z אופטימלי שנקבע מראש. כדי לזהות את אזורי העניין, הגדר את אזור הסריקה כאתר יחיד של 2000 על 2000 פיקסלים ללא benning. בחר את סוג הצלחת המתאים ואת לייזר הארגון של 488 ננומטר בעירור על פני אורכי גל פליטה של 488 על פני 525 ננומטר.
לאחר מכן בחר באר המכילה עובר שטופל ברכב ולחץ על מצא דגימה. המכשיר יבצע סריקת פוקוס אוטומטי וירכוש תמונה בודדת כדי לאשר רכישת תמונה תקינה. בחר באופן אקראי רכב שטופל היטב ורכוש תמונה.
אם התמונה ממוקדת ומציגה ביטוי GFP בראש. מקם את הסמן מעל האזורים הבהירים ביותר וודא שעוצמת הקרינה נמצאת בטווח של מצלמת 16 סיביות. פחות מ-65,000 יחידות.
חזור על שלבים אלה עם בקרת רכב נוספת וכמה בארות שטופלו במתחם. במידת הצורך, כוונן את עוצמת הלייזר והרווח כך שהאזורים הבהירים ביותר בתמונות הבקרה החיוביות לא יהיו רוויים. לאחר מכן בחלון רכישת הצלחת והבקרה, בחר רכוש צלחת כדי להתחיל בסריקת צלחות.
המכשיר ירכוש אוטומטית תמונה אחת לכל באר עבור כל המיקרו-לוח ויאחסן אותם בארכיון במסד נתונים של שרת SQL. לאחר סיום הסריקה, העלה את התמונות להגדרות D. מפתח על ידי פתיחת מפתח עם אפשרות הקלע מופעלת.
צור סביבת עבודה חדשה. לאחר מכן, מתפריט הקובץ, בחר ייבוא מותאם אישית. לאחר מכן, נווט לתיקיה המכילה את התמונות ופתח קובץ לדוגמה.
בחרו מסנן ייבוא שמזהה את פורמט התמונה ואת מבנה הקובץ שנוצרו על-ידי פלטפורמת Molecular Devices Image Express Ultra. כעת כדי לעבד את התמונות, פתח תמונת בקרה וטען את טכנולוגיית רשת הקוגניציה הרצויה או אלגוריתם CNT או ערכת הכללים. האלגוריתם המותאם אישית המשמש כאן נועד לזהות באופן אוטומטי עובר, חלמון וראש ולכמת את הבהירות והשטח של מבני ראש המבטאים GFP, לבצע את הכללים שנקבעו לשלב זיהוי הראש והחלמון.
כדי להבטיח הקצאה נכונה של שק החלמון והראש, שנה את ערכת הכללים כדי להתאים את סף זיהוי החלמון אם החלמון גדול מדי או קטן מדי. לאחר מכן, בצע את הכלל שנקבע לשלב זיהוי מבני ראש בהיר. כדי להבטיח הקצאה נכונה של אזורי ביטוי GFP בראש, שנה את ערכת הכללים כדי להתאים את סף זיהוי מבני הראש ככפולות של עוצמה נמוכה עד שזיהוי מבני ראש בהירים תואם תצפית חזותית.
לאחר מכן, בצע את כל ערכת הכללים באופן ידני על מספר תמונות שנבחרו באקראי שנוצרו מעוברים שטופלו ברכב ותמונות בקרה חיוביות מעוברים שטופלו ב-PCI. להפעלת האלגוריתם בכל תמונות הלוחות, בחרו בלוחות לניתוח ולבחירה. נתח ולאחר מכן נווט אל ערכת הכללים הממוטבת ונתח את כל הבארות.
באמצעות מתזמן המשימות המשולב, בארות ריקות או תמונות מעורפלות לא ייכללו אוטומטית בניתוח במהלך הסריקה. מוצגת מפת שמירה המתעדכנת ללא הרף. גם הנתונים וגם התמונות נגישים במהלך הריצה לבדיקה חזותית.
הנתונים המספריים והתמונות המעובדות נשמרים אוטומטית. לאחר ניתוח כל התמונות, ניתן לייצא את הנתונים לתוכנות צד שלישי כגון Excel, GraphPad או פריזמה. איור זה מציג תמונות סריקה בארכיון מרכב שטופל ו-BCI שטופל היטב עם ובלי ניתוח CNT.
חלבון פלואורסצנטי ירוק מיושם או GFP מזוהה בעין, בגבול המוח האחורי האמצעי ובגרעינים הטריגמינליים של עוברים טרנסגניים. שים לב שגם עוצמת ה-GFP וגם תחומי הביטוי מורחבים. בעוברים שטופלו ב-BCI כאן, נראית השפעה תלוית מינון של BCI על ביטוי הגנים של מדווח GFP בעוברים טרנסגניים.
הריכוז הנדרש כדי לעורר תגובה חצי מקסימלית או EC 50 היה כ-12 מיקרומולר. זה עתה הראינו לכם כיצד לגדל, לאסוף ולסדר עוברי דגי זברה מהונדסים ל-96 צלחות באר. הוספנו ריכוז הולך וגדל של PCI במפעיל עצמו של מסלול האיתות.
הראינו גם כיצד להפוך את ההדמיה של עוברים טרנסגניים לאוטומטית וניתחנו את התמונות באמצעות אלגוריתם מותאם אישית המבוסס על טכנולוגיית רשת קוגניציה. בגישה זו, הצלחנו למדוד כמותית בצורה מדורגת את ההשפעות של מפעיל מולקולה קטנה של איתות גורם גדילה פיברובלסטים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבחור בקפידה עוברים כדי למזער את השונות בין הדגימות.
זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מערכת לדימות וניתוח אוטומטיים של עוברים טרנסגניים של דגי זברא (zebrafish) בלוחיות מולטי-וול (multiwell plates). הוא מדגים את היכולת למדוד השפעות תלויות-מינון של המולקולה הקטנה BCI על ביטוי גן ד reporter של גורם גידול פיברובלסטים (Fibroblast Growth Factor), ובכך מסייע לביצוע סריקות כימיות בעלות תפוקה גבוהה בדגי זברא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה התפתחותית
- סריקה בשפיעות גבוהה
רקע
- דגי זברה משמשים נפוצה כאורגניזם מודל בביולוגיה של ההתפתחות.
- דגי זברה טרנסגניים יכולים לבטא חלבונים פלואורסצנטיים, מה שמאפשר ויזואליזציה של ביטוי גנים.
- סריקה בעלת תוכן גבוה (High-content screening) מאפשרת ניתוח של מספר דגימות בו-זמנית.
- ש 이는 של גורם גדילה של פיברובלסטים (FGF) חיונית לתהליכי התפתחות שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת דימוי בתפוקה גבוהה עבור עוברים של דגי זברה.
- הערכת ההשפעות של מולקולות קטנות על סיגנל FGF.
- אוטומציה של ניתוח ביטוי גנים בדגי זברה טרנסגניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכשרה של דגי זברפיש טרנסגניים ואיסוף עוברים.
- דגירה של עוברים בפלטות רב-בארים עם ריכוזים משתנים של BCI.
- דימוג אוטומטי באמצעות קורא פלטות קונפוקאלי.
- ניתוח עצימויות פלואורסצנציה באמצעות אלגוריתם ייעודי.
תוצאות עיקריות
- דימוי וניתוח מוצלחים של עוברי דגי zebrafish בפורמט של סריקה רב-דגימתית (high-throughput).
- הדגמה של השפעות תלויות-מינון של BCI על סיגנל FGF.
- ניתוח אוטומטי סיפק כימות מהימן של ביטוי גנים.
- ביסוס פלטפורמה לסריקה כימית עתידית בדגי zebrafish.
מסקנות
- המערכת שפותחה משפרת את היעילות של סריקות כימיות בדגי זהב (zebrafish).
- היא מספקת כלי בעל ערך לחקר אותיות FGF במהלך ההתפתחות.
- ניתן להחיל מתודולוגיה זו על מולקולות קטנות ונתיבי סיגנל אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות ואנליזה אוטומטיים של עוברים של דג הזברה מאפשרים הערכה רחבה של מודולציה של מסלולי איתות in vivo, ובכך תומכים בתיקוף מוקדם של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי. גישה זו מספקת מדדים כמותיים התלויים במינון, המשפרים את הביטחון החזוי בהשפעות של תרכובות על פעילות מסלול ה-FGF/RAS/MAPK. דבר זה ממתג את השיטה כגשר תרגומי בין סריקה פנוטיפית לזיהוי מובילים (lead identification) במחקר ופיתוח בביו-פארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מודולציה של שסורב FGF במערכת חולייתית רלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות אוטומטי של ביטוי רפורטר GFP במבני ראש עובריים.
- ערך ניבוי: מייצר נתוני EC50 (כ-12 micromolar עבור BCI) לצורך הנחיית קשרי מבנה-פעילות ומיון תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר תוצאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של עוצמה פלואורסצנטית מפורמטים של פלטות בעלות 96 בארות, התואמים לזרימות עבודה של סריקה רחבה (high-throughput).
- יכולת הרחבה: מאפשר סידור של עוברים טרנסגניים בגיל 24 hpf לטיפול בתרכובות ובדימות אוטומטית באמצעות קוראי HCS קונפוקליים.
- תועלת האלגוריתם: אלגוריתם Cognition Network Technology מותאם אישית מזהה ומכמת ביטוי של GFP באזורים עובריים מוגדרים, מה שמאפשר הערכה מהימנה של התרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: שימוש בעוברי דג זברה בגיל 24-48 hpf, שלב התפתחותי שבו האיברים כבר נוצרו והרקמות שקופות, מה שתומך בהסברה (extrapolation) ממודלים של in vivo לשלב הפרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מדידת תגובות ספציפיות למסלול (אקטיבציה של FGF) כדי להבחין בין השפעות של תרכובות על המטרה (on-target) לבין השפעות חוץ-מטרה (off-target).
- הלימה של סמנים ביולוגיים: ביטוי של GFP reporter משמש כסמן ביולוגי תרגומי למודולציה של מסלול ה-FGF, הניתן לגילוי באמצעות ניתוח תמונות אוטומטי.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, תומכת בבדיקת השערות בתהליכי תיקוף מטרה (target validation) ומאפשרת פיתוח סקלאבילי של בדיקות (assays) עבור קמפיינים לזיהוי מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: מסייע להבהרת מסלולים ולביסוס הביטחון במטרה באמצעות ניתוח תגובה למניה של מודולציה של איתות FGF.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות רכישת תמונות וניתוח אוטומטיים, המבטיחים הדירות בין ריכוזי תרכובות שונים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (עוצמת GFP ושטח) המאפשרות השוואה בין עוצמה ויעילות של תרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי שימוש בעוברים של חולייתנים בעלי מסלולי איתות שמורים ואורגנוגנזה נראית לעין.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לסריקה של מולקולות קטנות ומסלולי איתות מרובים באמצעות רפורטרים טרנסגניים ניתנים להחלפה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במודולציה של המטרה ומפחית עמימות מכניסטית בשלבי סריקה מוקדמים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות דימות אוטומטי וניתוח מבוסס אלגוריתם.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקה של התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים ותלויים במינון על פעילות המסלול.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף של תרכובות מותאם סיכון בהתבסס על EC50 ומדדי תגובה מקסימלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול דגי zebrafish, טיפול בעוברים טרנסגניים ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי במכשור לסריקה בעלת תוכן גבוה במיקרוסקופ קונפוקאלי (למשל, Molecular Devices ImageXpress Ultra) ובתוכנה לניתוח תמונות (Definiens Developer).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור שלבי התפתחות העובר, הכנת תרכיבים ופרמטרים של רכישת תמונות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום האלגוריתם עבור רפורטרים טרנסגניים שונים או מבנים עובריים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בין העוברים ואת הצורך בבחירה קפדנית של הדגימות כדי למזער רעשים, כפי שצוין בפרוטוקול.
