איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של beta malters ברקמה קורטיקלית אנושית. ראשית, רקמה הומוגניזית עוברת סוניקציה באמצעות פרובה והבהרה באמצעות סנטריפוגציה במהירות נמוכה. לאחר מכן, דגימות שעברו רדוקציה הורתחו בבופר SDS ונערמו על poly acrylamide.

חלבוני הג'ל מועברים לממברנת ניטרוסלולוז והממברנה מחוממת באדים בתוך תמיסת phosphate buffered saline. לבסוף, במנער אורביטלי, הממברנה מדגרת למשך לילה עם נוגדן ראשוני, לאחר מכן עם נוגדן משני המצומד ל-HRP, ולבsequently עם ריאגנט luminal peroxide לפני החשיפה לסרט רנטגן. שלום, אני רבקה רוזן מהמעבדה של לארי ווקר במחלקה למדעי העצבים במרכז ירקס הלאומי למחקר פרימטים באוניברסיטת אמורי.

היום נראה לכם כיצד לזהות מולטימרים של Abeta והומוגנאט קורטיקלי באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל SDS ו-immuno blotting עם שחזור אנטיגנים מושרה בחום. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את הרמות וההפצה של מולטימרים מובחנים של Abeta ברקמות קורטיקליות שאינן מקובעות מבני אדם עם מחלת אלצהיימר ומפרימטים שאינם אנושיים מזדקנים. אז בואו נתחיל.

התחילו עם כמאה מיליגרם של רקמת קורטקס שאינה מקובעת והומוגניזו אותה בכ-400 מיקרוליטר של באפר קר מאוד עם כ-30 תנועות אחידות של הפסטל. עבור 20% משקל לנפח, היחס בין משקל הרקמה לנפח הבאפר צריך להיות מיליגרם אחד לארבעה מיקרוליטרים. לאחר ההומוגניזציה, העבירו את ההומוגנאטים לשפופרת פוליפרופילן של ארבעה מיליליטר ובצעו סוניקציה באמצעות פרוב שלוש פעמים למשך חמש שניות בעוצמה 5.

לאחר הסוניקציה, העבירו את ההומוגנאטים למבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter וסובבו במשך חמש דקות ב-3000 G. הסירו בזהירות את הסופרנאטנטים המזוקקים ואחסנו מנות (aliquots) של 50 microliter מתמציות אלו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד לשימוש. לאחר מכן, קבעו את ריכוז החלבון הכולל עבור מנות שהופשרו acabado של הומוגנאטים מזוקקים באמצעות בדיקת חומצה ביוריאית או BCA בהתאם להוראות היצרן. להומוגנאטים קורטיקליים מזוקקים בריכוז 20% צריך להיות ריכוז חלבון הגבוה מ-five micrograms per microliter, ולכן ניתן לדלל אותם ביחס של 1:10 כדי שיהיו בטווח הקריאה של קורא הלוחיות. עבור בדיקת ה-BCA, הכינו תגובות דגימה דנטורטיביות עם אותן מנות של הומוגנאטים מזוקקים.

השתמש בכ-50 עד 60 מיקרוגרם של חלבון כולל והתאם את נפח ההומוגנאטים של הקורטקס בהתאם, כך שכל דגימה תכיל את אותה כמות של חלבון כולל. הכן דגימות לנפח כולל של 25 מיקרוליטר עבור כל ג'ל טריסין בריכוז 10% עד 20% שיורץ. עבור כל ג'ל, הכן בקרת חיובית של 10 עד 100 ננוגרם של פפטיד סינתטי a beta 40 או a beta 42 המדולל ב-1X PBS לנפח של 10 מיקרוליטר, עם 12.5 מיקרוליטר של באפר דגימה 2X SDS ו-2.5 מיקרוליטר של חומר מחזר 10x.

לאחר הכנת כל הדגימות, כולל ביקורת בטא, ערבבו במערבל Vortex למשך חמישה עד 10 שניות וחממו במקלח יבש בטמפרטורה של 100 degrees Celsius למשך חמש דקות, ולאחר מכן סובבו במהירות את כל המבחנות כדי להסיר עיבוי מהמכסה. טענו את הדגימות על ג'ל טבול ב-trice SDS running buffer בתוך תיבת ג'ל, וטענו לפחות באבור אחת 10 microliters של סממן משקל מולקולרי לא מדולל. הריצו את הג'ל במתח קבוע של 125 volts למשך כ-90 דקות או עד שסמן ה-four kilo Dalton נמצא במרחק של כסנטימטר אחד מתחתית הג'ל.

הוציאו בזהירות את הג'לים מהמסגרות הפלסטיקיות והרכיבו את "סנדוויץ'" ההעברה בהתאם להוראות היצרן. הרטיבו מראש את רפידות הספיגה ואת ממбраנות הניטרוצלולוז בעלות נקבוביות של מיקרומטר באמצעות בופר העברה של tris glycine. הסירו בועות אוויר מרפידות הספיגה או ממבנה הסנדוויץ' של נייר הסינון והממбраנה.

מלאו את התא הפנימי של מכשיר ההעברה בבופר העברה ומלאו את התא החיצוני במים מזוקקים. הפעילו את ההעברה למשך שעתיים עד שלוש שעות בזרם קבוע של 25 milliamps. עם סיום ההעברה, פרקו את ה"סנדוויץ'" והניחו את הג'לים בכלי מלא במים מזוקקים ואת הממברנות בכלי מלא ב-1X PBS לכל שלבי הפרוטוקול.

ודאו שהג'לים והממברנות מכוסים לחלוטין בנוזל כדי למנוע התייבשות. כדי להמחיש את יעילות העברת החלבונים, צבעו את הג'לים בצבע Simple Blue Safe לא מדולל למשך זמן דגירה של כשעה, ואת הממברנות בצבע 1x PON S red למשך כחמש דקות. זמן הדגירה הוא בהתאם להוראות היצרן; צביעה זו לא תפריע לתהליך ה-immuno blotting.

אם הצביעה מעידה על העברה לא יעילה של חלבונים, יש לשנות את זמן ההעברה בשלב שלוש לצורך שחזור אנטיגן. בתוך מכשיר אידוי (steamer), חתמו בחום את הממברנה בתוך שקית פלסטיק עמידה של CapEx המולאה בכ-50 milliliters של 1x PBS בטמפרטורת החדר. הניחו את השקית בצורה שטוחה במכשיר אידוי שחומם מראש ל-100 degrees Celsius; ברגע שהשקית מתחילה להתרחב, הדגרו למשך 15 דקות נוספות לפני ההוצאה ממכשיר האידוי.

יש לאפשר לממברנה להתקרר לאט לפני הוצאתה מהנרתיק כדי למנוע קמטות מרובות בטמפרטורת החדר. הוצא את הממברנה בזהירות מהנרתיק ושטוף אותה במשך חמש דקות ב-XPBS על שייקר אורביטלי, ולאחר מכן בשטיפה של חמש דקות ב-TBST על שייקר אורביטלי. לאחר מכן, הדגר את הממברנה בתמיסת חסימה למשך שעה על שייקר אורביטלי ללא שטיפה, והעבר את הממברנה לצלחית המכילה את הנוגדן הראשוני six E 10, הספציפי לאזור ה-A beta והטרמינלי, בדילול של 1:1,000 עד 1:5,000 בתמיסת חסימה.

דגרו על נקנער מסובב בטמפרטורת החדר למשך שעה, ולאחר מכן למשך 24 עד 48 שעות עם ניעור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה מהירה אחת, שטפו את הממברנה למשך 30 דקות ב-TBST, ולאחר מכן בצעו שלושה שטיפות של 10 דקות כל אחת על נקנער מסובב.

דגרו את הממברנה בנוגדן משני המצומד ל-HRP, המדולל ביחס של 1 ל-10,000 בתמיסת החסימה, למשך 90 דקות על השייקר בטמפרטורת החדר. בפרוטוקול זה אנו משתמשים בנוגדן sheep anti-US. שטפו שוב את הממברנה למשך 30 דקות ב-TBST, החל משטיפה מהירה אחת ולאחריה שלושה שטיפות של 10 דקות על שייקר אורביטלי.

לאחר השטיפה האחרונה, דגרו את הממברנה בריאגנטים super signal West Pico ECL לא מדוללים שהוכנו acabado למשך חמש דקות. בשלב זה, בתוך השייקר במהירות גבוהה (RPM), הוציאו את הממברנה וסננו את עודפי הריאגנט. בעזרת נייר סינון נטול סיבים או מגבוטי Kim wipes, הניחו את הממברנה בקסטה לסרט בין דפי הגנה מפלסטיק, וספגו שאריות נוספות של ריאגנט super signal באמצעות Kim wipes נטולי אבק.

במידת הצורך, חשפו לסרט Kodak Biomax MR.Film במרווחי זמן של 30 שניות, עד ל-30 דקות, ופתח הצילום במפתח סרטים. לאחר חמש דקות, סרטי המonomer של A beta יהיו ככל הנראה רוויים בניסוי זה. הומוגנאטים מזוקקים המכילים 50 µg של חלבון כולל משבעה נבדקים אנושיים נותחו כדי לבדוק נוכחות של beta amyloid מולטימרי או a beta וחלבון מקור בטא-עמילואיד או a PP, החלבון הטרנס-ממברנלי ממנו מנובק הפפטיד A beta.

כאן אנו מציגים תמונות מייצגות מניסוי western blot של A beta ו-a PP בחשיפה של 30 דקות וחמש דקות. חשיפה של 30 דקות מאפשרת ויזואליזציה של הדימר, הטרימר, הטטראמר והפסים בעלי המשקל המולקולרי הגבוה יותר או הליגמנט של Abeta, שהם בהירים בהרבה, אך גורמת לחשיפת יתר של הנתיבים האחרים בזמן חשיפה של חמש דקות. אותו פס טטראמר קיים אך הוא חלש, מה שמאפשר ויזואליזציה ברורה של נתיבים אחרים.

הומוגנאטים קורטיקליים מנבדקים עם מחלת אלצהיימר או AD נראים בנתיבים אחת עד שלוש, נבדק אנושי המאובחן עם דמנציה עם גופי לוי או DLB ומחלת אלצהיימר נראה בנתיב ארבע, מקרים של דמנציה עם גופי לוי נראים בנתיבים חמישה ושש, ומקרה ביקורת אנושי מבוגר ללא דמנציה נראה בנתיב שבעה. אימונו-בלוטינג עם הנוגדן 6C10 חשף מונומרים, דימרים, טרימרים, טטראמרים ו-APP של אמיליד בטא בכל מקרי אלצהיימר, כמו גם שפע של אמיליד בטא בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר בשני מקרי AD, דבר המעיד על ההטרוגניות של ה-a beta-ization בין נבדקים אנושיים סינתטיים.

נוגדן beta 40 בנתיב הימני מאשר את זהותם של הפסים בעלי המשקל המולקולרי הנמוך. הרגע הצגנו בפניכם ניסוי Western blot ב-SDS-PAGE לזיהוי מולטימרים של beta ברקמות הומוגנאט לא מקובעות ממוחות של בני אדם עם מחלות ניווניות של מערכת העצבים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להכין הומוגנאט קורטיקלי בריכוז גבוה להפרדה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל, וזאת כדי לחשוף מולטימרים של Abeta בשכיחות נמוכה יותר.

חשוב גם לבצע שחזור אפיטופים של אנטיגנים המושרה בחום לפני ביצוע אימונו-בלוטינג (immuno blotting) באמצעות נוגדן לפפטיד Abeta. שחזור האנטיגן מסייע בחשיפת אפיטופים מסותרים של Abeta לקשירה אופטימלית של הנוגדן במהלך האימונו-בלוטינג. כל מכשיר אידוי, מיקרוגל או מקלח מים השומר על 100 °C יספיקו.

זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.