ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאפיין מכלולי חלבונים גדולים באמצעות ספקטרומטריית מסה מבנית. זה מושג על ידי הכנת נימים מצופים זהב ליינון אלקטרו ריסוס בזרימה ננו. כשלב שני, מכינים את הדגימה וספקטרומטר המסה מכויל למדידות מסה גבוהה.

לאחר מכן, תנאי הניסוי מותאמים על מנת לשמור על קומפלקסי חלבון שלמים בשלב הגז. לאחר מכן נרכשות MS ו-Tandem Ms.Spectra. ספקטרום MS הראה מצבי מטען התואמים במסה לקומפלקס השלם בעוד שניסויי טרשת נפוצה טנדם הניבו דפוס אסוציאציה של מונומרים וקומפלקסים מופשטים.

היי, אני נעם קיבא מהמעבדה של מירון במכון וייטמן למדע, ואני אייזק קיי. היום ברצוננו להראות לכם את ההליך הבסיסי לניתוח קומפלקסים גדולים של חלבונים על ידי יישום ספקטרומטריה מבנית, ואנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לאפיין קומפלקסים של חלבונים כדי להגדיר את גיאומטריית המלאי, ההרכב ורשתות האינטראקציה שלכם. אז בואו נתחיל.

ניתוח של קומפלקסים של חלבונים קשורים ללא זרם מתבצע על ידי טכניקת חיסון ריסוס אוויר באמצעות emme plus או qua capillaries. ניתן למשוך את ה-C הנימי הזה לקצה דק בקוטר של מיקרון אחד ואז לצבוע אותו על ידי חומר מוליך כמו זהב. נימים אלה זמינים מסחרית כפי שניתן לראות כאן.

עם זאת, זה הרבה יותר חסכוני לשימוש. נימי הזכוכית, אה, שיכולים להיות קרירים ומצופים לקירור מצב מוכן לשימוש, מבוצעים על מכשיר איגום מחט זה וציפוי במכשיר ציפוי eh זה. כדי להתחיל בהליך זה, חבר שתי רצועות של כרית דבק דו צדדית לתחתית צלחת פטרי, תוך שמירה על הרצועות במרחק של שני סנטימטרים זו מזו.

הניחו מוט זכוכית במרכז אחת הרפידות. כרית ההדבקה מחזיקה את הנימים במקומם ומוט הזכוכית תומך בנימים המוכנים ומונע מהקצות להישבר לנימים. נימי זכוכית בוריס סיליקט משומשים בקוטר חיצוני של מילימטר אחד וקוטר של 0.78 מילימטר

הכנס נימי אחד למחט, הצמיד את הנימים בעדינות למקומו והתאם את מיקומו כך שהוא ישכב במרכז חוט החימום. הדק את המהדקים בעדינות עד שהנימים החזיקו יציב בשני הקצוות. משוך את הנימים באמצעות התוכנית המוגדרת מראש המוצגת כאן.

עם זאת, זכור שתהליך תכנות המושך הוא תהליך של ניסוי וטעייה. עד לקבלת צורת קצה מקובלת, כל נימים שנמשכים מולידים שני נימים בצורת סופית. הסר את הנימים הנמשכים מהמכשיר ובדוק את הקצוות, והשליך את כל המעוותים או השבורים.

השתמש בפינצטה קהה כדי למקם את הנימים בצלחת הפטרי. בסיס הנימים המחוברים לכרית ההדבקה והחלק העליון נשען על מוט הזכוכית עם קצה הפונה כלפי מעלה. המשיכו למשוך את הנימים עד שצלחת הפטרי מלאה.

כ -80 נימים נכנסים לכלי בקוטר 10 סנטימטרים. לאחר מכן, מצפים את הנימים בזהב. הכנס את הצלחת לתוך מעטפת הזהב.

וודאו כי אספקת הגז נבחרה על פי הוראות היצרן והפעל מחזור ציפוי מוגדר מראש. הציפוי חוזר על עצמו שלוש עד שש פעמים עד שהנימים מזהיבים באופן אחיד. לאחר שהנימים מוכנים, המשך לכייל את ספקטרומטר המסה.

רוב הניסויים שנערכו על מתחמי MultiPro מבוצעים על ידי אל אלקטרוספריי זמן מרובע של ספקטרומטר מסת טיסה כזה. Inupt ממים, המותאם למסות גבוהות. לפני טעינת דגימת החלבון, כייל את ספקטרומטר המסה באמצעות צזיום יודיד.

ראשית, הכינו תמיסה של 100 מיליגרם למיליליטר של צזיום במים מטוהרים, צזיום משמש לכיול מסה גבוהה. מכיוון שצבירי המלח הטעונים בודדים משתרעים על פני טווח מסה רחב מ-393 תורן ליחס מטען להרבה יותר מ-10,000. בעזרת פינצטה קהה, קח נימים מצופים מצלחת הפטרי והעמיס שני מיקרוליטר מתמיסת הצזיום לנימים.

שימוש בקצה טעון ג'ל עינור. החלק את התמיסה לכיוון קצה הנימים, באופן ידני או השתמש במתאם סיבוב. הכנס את הנימים למחזיק הנימים והתאם את הנימים בצורה כזו שהקצה יהיה במרחק של כ-10 מילימטרים מקצה המחזיק.

הנח את הנימים מתחת למיקרוסקופ אופטי והשתמש בפינצטה חדה מסוג AA כדי לקצץ את הקצה. חשוב לוודא שאין בועות אוויר בתוך הנימים שעלולות לחסום את הזרימה ושהנימים אינם סתומים. בנוסף, וודאו כי ציפוי הזהב אינו מופשט מהנימים.

אם כן, החלף את הנימים או חתוך את הקצה והסר את החלק הלא מצופה. לאחר מכן, חבר את מחזיק הנימים לממשק ESI של זרימת ננו. סובב את ה-XY, Z stage לאחור כדי למנוע נזק לנימים ולדחוף את ה-stage למצב המופעל שלו.

יש למקם את הנימים במרחק של 1 עד 10 מילימטר מפתח החרוט. הפעל מתח נימי ולחץ זרימת ננו נמוך עד להתחלת הריסוס. לאחר מכן נסה להפחית את לחץ זרימת הננו לערך מינימלי.

בצע אופטימיזציה של עוצמת האות על ידי התאמת המיקום של שלב ה-XYZ, המתח הנימים, לחץ זרימת הננו וזרימת גז המסה. כדי לזהות טווח מסה רחב של סדרות שיא עונתיות, יש לייעל את מתחי ההאצה. הפרמטרים המשמשים כאן הם חרוט דגימה נימי של 1.3 עד 1.7 קילו-וולט 80 עד 150 וולט, חרוט חילוץ, אחד עד שלושה וולט כדי לייעל את ההעברה של יונים בעלי מסה גבוהה, הדורשים תנאי התפלה עדינים.

לחץ הגיבוי מוגבר לחמישה עד שישה מיליבר בשלב הוואקום הראשוני בין המקור למנתח. כדי להעלות את לחץ הגיבוי, הפחת בזהירות את המוליכות של קו הוואקום המקורי למשאבת הגלילה על ידי סגירה חלקית של שסתום הבידוד תוך ניטור ההשפעה על עוצמת האות. בעת השלמת הגדרת ספקטרומטר המסה, אסוף כ-30 סריקות בסריקה אחת לשנייה בטווח יחס טעינה ראשי של בין 1000 ל-15,000 לאחר הרכישה כייל את זמן הטיסה באמצעות טבלת הכיול המתאימה.

כעת, לאחר השלמת הכיול, ניתן לטעון את דגימת החלבון. הדגימה מוכנה לפני כיול ספקטרומטר המסה נדרשים ריכוזים מיקרומולריים נמוכים. במידת הצורך, רכזו את הדגימה באמצעות מכשירי סינון אולטרה צנטריפוגליים.

ודא כי קומפלקס החלבון אינו נספג בקרום המכשיר לפני השימוש. על ידי בדיקת הנפח וספיגת ה-UV, ניתן להשתמש רק בפתרונות נדיפים עבור NESI, מה שהופך את החלפת המאגר להכרחית. ניתן להשתמש בעמודת סינון ג'ל מיקרו צנטריפוגה כדי להסיר את כל עקבות המלחים, מולקולות החיץ או כל תוספות אחרות שאינן נדיפות .

במקום זאת, השעו את הדגימה. תמיסת אמוניום אצטט מימית. שלב קריטי זה קובע את איכות הספקטרום.

חזור על החלפת המאגר עד שלוש פעמים עם דילול מינימלי, פחות מפקטור של 1.3 לכל מכשיר עד להשגת החלפה מקסימלית. אם נדרשים גם ריכוז וגם החלפת חיץ, ניתן לעשות זאת יחד באמצעות סינון אולטרה צנטריפוגלי כפי שמוצג זה עתה בתחילת סעיף זה. לאחר מכן, טען את הדגימה כפי שמוצג לכיול צזיום יודיד והתחל ריסוס.

התחל באופטימיזציה ראשונית של התרסיס עד לזיהוי האות. השתמש במשוואה עבור מצב מטען ממוצע המוצג שבו M היא המסה של הקומפלקס. בדלטון, לעומת זאת, המיקום המדויק של מצבי המטען תלוי בחלבון.

כדי למנוע דיסוציאציה מורכבת, אין לחמם את מקור הברזל. כבה את התנור או שמור על הטמפרטורה מתחת ל-40 מעלות צלזיוס. שנה את מיקום הנימים, חרוט הדגימה ומתחי החולץ.

כדי למקסם את העברת הברזל, נקודת התחלה אפשרית היא מתח חרוט, חרוט חולץ 100 וולט, וולט אחד ומתח נימי 1.5 קילו-וולט. בדוק את השינוי שנוצר בספקטרום. בצע אופטימיזציה של פרמטרים אלה בשילוב עם לחץ זרימת ננו כדי לשפר את האלוהות ולהסיר שאריות מים ורכיבי חיץ.

הגדל את מתח ההטיה בלחץ הגז בתא ההתנגשות. מתחי ממתח אופייניים הם בטווח של 10 עד 100 וולט עם זרימת גז מלכודת של 1 עד 10 מיליליטר לדקה. בצע זאת בזהירות כדי למנוע אסוציאציה של המתחם, להתאים את המלכודת ולהעביר אנרגיות התנגשות.

לעתים קרובות נדרשים מתחים גבוהים יותר, בדרך כלל בטווח של 10 עד 30 וולט, להעברת יונים בעלי מסה גבוהה. בשלב זה, חשוב להימנע מדיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות של הקומפלקס כפי שמוצג כאן. לאחר הגעה לאות יציב, הוא המליץ להפחית את לחץ זרימת הננו ומתח הנימים לערכים מינימליים תוך שמירה על ריסוס יציב.

לאחר איסוף מספר סריקות, המשך לזהות את מרכיבי הקומפלקס על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם. לאחר שהתקבל אות אופטימלי ויציב עבור קומפלקס החלבון, בחר יון מבשר הגדר את מרכז המסה ברוחב בידוד. בדרך כלל רזולוציית מסה נמוכה של 12 ורזולוציית מסה גבוהה של בין 13 ל -15 משתמשים בטווח מסה רחב כדי לזהות את תוצרי הדיסוציאציה של מסה גבוהה במטען נמוך ולאחר מכן להפחית אותו לערכים הרצויים כדי לבצע ms.

MS מנתקים את הברזל המבשר על ידי הגדלת אנרגיית ההתנגשות המקוצרת CE והלחץ על תא ההתנגשות מגדילים את המלכודת או מעבירים CE בהדרגה בשלבים של 10 עד 20 וולט ומעלה את לחץ גז ההתנגשות לאפס עד חמישה מיליליטר לדקה. עקוב אחר שינויים בספקטרום עד להגעה לתנאי הפעלה אופטימליים. אנרגיית הפעלה גבוהה עשויה לגרום לדיסוציאציה של תת-יחידה אחת או יותר מהקומפלקס השלם ולהבהיר את זיקות האינטראקציה של תת-יחידות שונות.

בחר יותר מחיוב אחד עבור ניתוח ms MS. במקרה של רכיבים חופפים, רכישת קבוצה של MS Spectra טנדם מסייעת בפתרון סדרות המטען של האוכלוסיות השונות. יתר על כן, מצבי טעינה גבוהים יותר מתנתקים ביתר קלות בהשוואה למצבי טעינה נמוכים יותר על גבי MS ו-ms.

MS ספקטרום כדי לאמת את הבידוד של יון המבשר שנבחר. בנוסף לאפיון הקומפלקס השלם על ידי MS ו-MS. MS מייצרת תת-קומפלקסים קטנים יותר ותמיסה בתנאי דנטורציה קלים ומאפיינת גם אותם.

ניתוח MS ו-ms MS של תת-קומפלקסים מהווים את הבסיס להגדרת ארכיטקטורת תת-היחידה של המתחם לשיבוש חלקי של אינטראקציות תת-יחידות הוסף בהדרגה ממיסים אורגניים עד לריכוז של 50% או שנה את ה-pH של התמיסה על ידי הוספת אמוניה או חומצה פורמית עד לריכוז של 4%לבסוף, כדי לקבוע את המסות של יחידות המשנה הבודדות המרכיבות את המתחם, חשוב לרכוש ספקטרום בתנאי דנטורציה. ניתן לבצע זאת באמצעות קצה רוכסן C 4 עם יחס אצטו ניטריל של 25 עד 75 מים עם 1% חומצה פורמית כממס האלוסיאני עם כל הנתונים שנאספו מעבדים ומנתחים את התוצאות כמפורט בפרוטוקול הכתוב הנלווה. לפני טעינת דגימת קומפלקס החלבון, ספקטרומטר המסה כייל באמצעות צזיום יודיד.

סדרת הפסגות המסומנות באדום במרווחים שווים משתרעת על פני טווח רחב מיחס מטען ראשי של 393 להרבה יותר מ-10,000. הם מוקצים לטעון בנפרד אשכולות מלח של ההרכב הכללי של קומפלקס הצזיום פלוס. אותות נוספים בין הפסגות העיקריות המסומנות בשחור נגרמים על ידי מיני מטען כפול ומשולש מהסדרה צזיום שתיים פלוס קומפלקס וצזיום שלוש פלוס קומפלקס.

הגדלת הלחץ בשלב הוואקום הראשוני חיונית לאיתור צבירי המסה הגבוהה. השפעת הלחץ על פסגות המסה הגבוהות מודגמת כאן עם קריאת לחץ של 1.2 ו-5.3 מיליבר. ספקטרום המסה של הלחץ הגבוה יותר מוצג כאן מורחב.

הנה דוגמה לספקטרומטריית מסה של קומפלקס וריאנט לקטין המוליד התפלגות מצב מטען בין 3000 ל -5, 000 יחס מטען ראשי. עם זאת, בשל התפלה נאותה של היונים, הפסגות רחבות. הגדלת מתח ההטיה מארבעה וולט ל-15 וולט, מה שמביא לעלייה בתנאי ההאצה, גורם להפשטה של שאריות מים ורכיבי חיץ המניבים ספקטרום ברזולוציה גבוהה, המסה הנמדדת מתאימה לקומפלקס פנטמרי.

לאחר מכן נבחר מצב הטעינה פלוס 15 לניתוח טנדם MS. העלייה באנרגיית ההתנגשות גורמת לשחרור של מונומר טעון מאוד שבמרכזו יחס מטען מאסטר של 1,664 וקומפלקס טטרמרי מופשט בטווח של יחס מטען מסה של 5,000 עד 8,000. קומפלקס וריאנט הלקטין נבדק גם בתנאי דנטורינג שהובילו לקשר מורכב.

באופן זה ניתן לקבוע את המסה המדויקת של יחידות המשנה הבודדות המרכיבות את המתחם. זה עתה הראינו לך כיצד לרכוש MS וטנדם Ms Spectra של יונים בעלי מסה גבוהה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין כראוי את המדגם שלך ולהשתמש רק במאגרי תנודתיות התואמים לספקטרומטריית מסה.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.