Name: כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: למד כיצד לכמת מוקדי γH2AX בתגובה לקרינה גמא בתאי אדם באמצעות שיטת אימונופלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת לעקוב אחר נזק DNA ראשוני ותהליכי תיקון, ולהעריך את יעילות תרכובות משנות קרינה כגון רדיו-סנסיטייזרים ורדיו-פרוטקטורים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). LM נתמך על ידי מלבורן מחקר (אוניברסיטת מלבורן) ו ביו הדמיה מלגות CRC משלים. התמיכה של מונש Micro Imaging (ד&quot;ר סטיבן קודי ואת היתר קרמייקל) היה שלא יסולא בפז עבור עבודה זו.

תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרטינוציטים האדם (FEP-1811) גדלו בינוני keratinocyte-סרום חינם (K-SFM; Invitrogen) בתוספת גורם הגדילה באפידרמיס, תמצית בלוטת יותרת המוח שור ו 20 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין, בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה תא בודד הוכן על ידי ניתוק עם טריפסין-EDTA (0.05% v / v) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים היו זורעים ב 8-Tek גם מעבדה שקופיות II microchamber (10,000 תאים / טוב) ושקופיות הודגרו במשך 3 ימים ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> הקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים היו מוקרן על הקרח עם 2 Gy באמצעות מקור 137 Cs (Gammacell 1000 irradiator עלית; Nordion הבינלאומי, קנדה, 20.6 שניות / Gy) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השליטה Unirradiated ו 2 Gy תאים מוקרן הודגרו במשך שעה 1 ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> Immunofluorescence מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה הדליפו את ותאי נשטפו עם 300μl של PBS (w / o Ca 2 + או 2 + Mg) לכל היטב היו מסובבים על מערבל מסלולית במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המאגר היה מוטה לסירוגין 100μl של 4% המוכן טרי (v / v) paraformaldehyde נוספה גם כל השקופיות הודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. Incubations כל בוצעו שוקת מכתים humidified </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפו אז עם PBS (w / o Ca 2 + או Mg 2 +). שקופיות הונחו בתוך צנצנת Coplin וסובב על מערבל מסלולית במשך 5 דקות. צעד זה לשטוף חזר על עצמו עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המאגר היה היטה את עודף ו PBS בעדינות מחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים היו permeabilized באמצעות 100 מ"ל טריטון X-100 (0.1% v / v) לכל היטב הדגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca 2 + או Mg 2 +) כמתואר שלבים 3 ו -4 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא חלבון מסוים מחייב נסתם 100 מ"ל של BSA (1% v / v) לכל היטב הדגירה 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BSA עודף היה מוטה לסירוגין 100μl של נוגדנים חד שבטיים העיקרי עכבר היסטון-H2AX אנטי phospho (מדולל 1:500, ב BSA 1%; Millipore), נוספה גם עבור כל הדגירה 1 שעה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca 2 + או Mg 2 +) כמתואר שלבים 3 ו -4 לעיל מודגרות עם 100μl של נוגדנים משני (אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר IgG מדולל 1:500, ב BSA 1% ; Invitrogen) לכל היטב במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. (נוגדן מדולל הוחזק בחושך לאורך ההליך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca 2 + או Mg 2 +) כמתואר שלבים 3 ו -4 לעיל. עם זאת, החשיפה לאור היה ממוזער שימוש בנייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstaining גרעיני בוצעה עם 100 מ"ל TOPRO3 (מדולל 1:500; Invitrogen) לכל היטב הדגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca 2 + או Mg 2 +) כמתואר בשלב 10 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדרי הוסרו בקפידה השקופיות, לחות עודפת נמחק ומחליק הורשו אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפה אחת של זהב להאריך פתרון אנטי לדעוך (Invitrogen) התווספה לכל היטב שקופיות היו רכוב (22x50 מ"מ coverslip) וכל נוזל עודף מסביב לקצוות של שקופיות נמחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות הוחזקו בחושך במשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר לפני איטום עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופיות היו מאוחסנים לילה בשעה 4 ° C בחושך לפני ניתוח. </li></ol> מיקרוסקופית / ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscpe נהג לרכוש תמונות באמצעות תקן ה-GFP (עבור γH2AX - Alexa פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר IgG) ולייזרים אדום רחוק (עבור TOPRO-3). בדרך כלל, 63 x טבילה שמן העדשה משמש מטרה. תמונות נרכשים דפוס Z-סדרה עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטר. גודל הצעד של 0.5 מיקרומטר נבחרה כדי להקטין את איבוד של ההווה מוקדים במטוסים שונים הגרעינים. במהלך הניתוח, מטוסים בודדים deconvoluted וערמה לייצר תמונה מוקרנת מרבי כדי לצמצם את החפיפה של מוקדים (Top-כובע מסנן מוחל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Metamorph (התקנים מולקולריים, ארה"ב) שימש לנתח מספר מוקדים. התוכנית quantitates מספר מוקדים בכל תא אחרי סף הוחל לכלול רקע. המידע נרשם גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel לניתוח נוסף. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. להדמיה immunofluorescence של γH2AX מוקדים (ירוק) ב קרטינוציטים האנושי בתאים שלא טופלו ו מוקרן עם 2 Gy וטופחו שעה נוספת בבית 1 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. ה-DNA היה מוכתם TOPRO-3 (כחול). תמונות נרכשו באמצעות LSM Zeiss 510 מיקרוסקופ Meta Confocal. בר = 10 מיקרומטר. e_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> איור 2. להדמיה immunofluorescence של γH2AX מוקדים (ירוק) ב קרטינוציטים האנושי בתאים מוקרן עם 2 Gy וטופחו שעה נוספת בבית 1 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תמונות נרכשו באמצעות LSM Zeiss 510 מיקרוסקופ Confocal באמצעות Meta 0.5 מיקרומטר Z-חתך (1-9) כדי להבטיח את כל מוקדי נרכשו. התמונות נערם ואז quantitation באמצעות Metamorph. ה-DNA היה מוכתם TOPRO-3 (כחול). ΓH2AX מוערמים ותמונות כחול נערמו להדמיה. בר = 10 מיקרומטר.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בעקבות חשיפה לקרינה מייננת (קרני ה-γ), γH2AX טופס מוקדים במהירות ומספרי מוקדים להגיע למקסימום בין 30-60 דקות 2. לכן, 1 שלנו שלאחר הקרנת שעה נקודת זמן משקפת הראשונית היווצרות DSB. השתמשנו הקרינה רלוונטיות קלינית של 2 Gy לצורך הניסוי שלנו. עם זאת, השיטה ניתן להשתמש במינון קרינה עד 4 Gy לגילוי של היווצרות DSB הראשונית; חפיפה משמעותית של מוקדים מונע quantitation מדויק במינונים גבוהים. מנות קרינה גבוהה ניתן להשתמש שלאחר הקרנה פעמים יותר הדגירה, כמו γH2AX מוקדים אובדים בשל הת...

<table><tbody><tr><td>מצע לתרבית קרטינוציטים ללא סרום (K-SFM)</td><td>מדיה</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>מדיה לקרטינוציטים מועשרת ב-Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53) רקומביננטי אנושי, וב-Bovine Pituitary Extract (BPE).</td></tr><tr><td>שקפי תאים Lab Tek lI (8 בארות)</td><td>שקפי תאים</td><td>Nalge Nunc international</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי (22x50mm)</td><td>זכוכית כיסוי</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>אלבמין מנתו של בקר (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1%) משמש לחסימת קישור לא ספציפי של נוגדנים. נוגדנים ראשוניים ושניוניים מדוללים ב-BSA.</td></tr><tr><td>PBS (ללא Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; ו-Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Trypsin-EDTA (0.05%) משמש לניתוק תאים מבקבוקי תרבית.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0.1%) משמש להחדרה (permeabilisation) של התאים.</td></tr><tr><td>פראפורמלהיד</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>פראפורמלהיד (4%) משמש לקיבוע תאים.</td></tr><tr><td>נוגדן מונוקלונלי לעכבר נגד phospho histone-H2AX</td><td>נוגדן ראשוני</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>דילול של נוגדן ראשוני (1:500), ב-1% BSA.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>נוגדן שניוני</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>דילול של נוגדן שניוני (1:500), ב-1% BSA.</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>צבע לדנ"א</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>צבע דנ"א נפוץ בשימוש: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). ניתן להשתמש רק עם מיקרוסקופים בעלי לייזר עירור מתאים.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>תמיסת אנטי-פייד (Anti-fade)</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>מקדם שבירה של 1.42 ב-20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>בקבוק לתרבית רקמה, פקק מאוורר</td><td>בקבוק תרבית</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>צלחת לתרבית רקמה (150x25mm)</td><td>צלחת פטרי</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת קופלין, זכוכית</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>אמבטיית צביעה</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>מקרין Gammacell 1000 Elite</td><td>מקרין גמא</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td>מיקרוסקופ קונפוקאלי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>תוכנה לניתוח תמונות</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

כימות γh2ax מוקדים בתגובה קרינה ionising

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

גדיל הדנ&quot;א הכפול הפסקות (DSBs), אשר המושרה על ידי או תהליכים מטבוליים אנדוגני או על ידי מקורות חיצוניים, הם אחד נגעים DNA הקריטי ביותר מבחינת הישרדות ושמירה על שלמות הגנומי. תגובה מוקדמת לזירוז של DSBs הוא זירחון של הגרסה H2A היסטון, H2AX, על שאריות סרין-139, את מוטיב שמור ביותר SQEY בטרמינל C-, להרכיב γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. בעקבות אינדוקציה של DSBs, H2AX הוא phosphorylated במהירות על ידי phosphatidyl inosito-3-kinase (PIKK) משפחה של חלבונים, אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM), ה-DNA למקטע החלבון קינאז קטליטי ATM ו RAD3 הקשורות (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. בדרך כלל, רק מעטים בסיס זוגות (נ&quot;ב) הם מעורבים DSB, לעומת זאת, יש הגברה איתות משמעותי, לאור החשיבות של שינויים הכרומטין איתות DNA נזק ותיקון. זירחון של H2AX מתווכת בעיקר באמצעות כספומט מתפשטת באזורים סמוכים של הכרומטין, המשפיעים על כ 0.03% בסך הכל סלולרי H2AX לכל DSB<sup&gt; 2,3</sup&gt;. זה מתאים זירחון של כ 2000 מולקולות H2AX פורש ~ 2 אזורים MBP של הכרומטין סביב האתר של DSB והתוצאות היווצרות של בדידות γH2AX מוקדים אשר ניתן דמיינו בקלות ונרשמת ידי מיקרוסקופית immunofluorescence<sup&gt; 2</sup&gt;. אובדן γH2AX ב DSB משקף לתקן זאת, קיימת מחלוקת מסוימת לגבי מה מגדיר תיקון מלא של DSBs, הוצע כי הצטרפותו המחודשת של שני גדילי הדנ&quot;א היא נאותה עם זאת, יש גם הציע מחדש instatement של מצב הכרומטין המקורי של הדחיסה הוא הכרחי<sup&gt; 4-8</sup&gt;. Disappearence של γH2AX כוללת לפחות בחלקה, על ידי dephosphorylation phosphatases, phosphatase 2A ו phosphatase 4C<sup&gt; 5,6</sup&gt;. יתרה מזאת, הסרת γH2AX על ידי חלוקה מחדש מעורבים חילופי היסטון עם H2A.Z היה מעורב<sup&gt; 7,8</sup&gt;. חשוב לציין כי ניתוח כמותי של מוקדי γH2AX הובילה למגוון רחב של יישומים בתחום המחקר הרפואי גרעיני. הנה, אנחנו מדגימים את השיטה immunofluorescence הנפוץ ביותר להערכת נזק לדנ&quot;א הראשוני על ידי איתור של quantitation γH2AX מוקדים ב-γ מוקרן קרטינוציטים אדם חסיד<sup&gt; 9</sup&gt;.

כימות של גדיל הדנ&quot;א הכפול פסים באמצעות היווצרות γH2AX כסמן המולקולרית הפכה כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור כימות γH2AX מוקדים לאחר חשיפה לקרינה של תאים.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

שברים דו-גדיליים של ה-DNA (DSBs), המוּשארים על ידי תהליכים מטבוליים אנדוגניים או על ידי מקורות אקסוגניים, הם מהסוגים הקריטיים ביותר של...

שלום, אני איאן מא מהמעבדה לרפואה אפיגנומית בראשות ד"ר טום קריס במכון בייקר לעין, לב וסוכרת. אני כעת במהלך לימודי הדוקטורט שלי, המתמקדים במידה רבה בהשפעות של קרינה על Gamma H2AX, המהווה סמן מולקולרי לשבירה של רצפי DNA דו-גדיליים. היום אדגים ניסוי לכימות של Gamma H2AX בתגובה לקרינת גמא בתאי אדם.ניתן להשתמש בפרוטוקול צביעה אימונוהיסטוכימית זה כדי לנטר הן נזק ראשוני ל-DNA והן תיקון DNA. שיטה זו שימושית גם להערכת היעילות של תרכובות פוטנציאליות למשני קרינה. לדוגמה, רדיו-סנסטיזטורים (radio sensitizers), מהם מצופה כי יגבירו את הנזק ל-DNA, יביאו למספר גבוה יותר של foci של gamma H2AX, בעוד שרדיו-פרוטקטורים (radio protectors) יביאו לאפקט הפוך עם מספר נמוך יותר של foci שזוהו, בשל הפחתה בשברים דו-גדיליים של ה-DNA.כעת נתחיל בניסוי. התאים המשמשים בניסוי זה הם תאי cytes אנושיים, אשר מוכנים על שקופיות תאיים (chamber slides) עם 10,000 תאים בכל באר. השקופיות מדגירות בטמפרטורה של 37 °C בריכוז של 5% carbon dioxide למשך שלושה ימים לפני ההקרנה.הקפיאו את משגר ההקרנה הדו-ממדית על קרח, ולאחר מכן הקרינו במינון של two gray בעוד שהשקופיות שמשמשות כביקורת נשארות ללא הקרה. לאחר ההקרנה, החזירו את השקופיות לאינקובטור למשך שעה אחת; תקופת דגירה זו מאפשרת לבחון את הנזק הראשוני ל-DNA. השלב הבא הוא הצביעה.ראשית יש להכי

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Quantitation של גדיל הדנ"א הכפול נשבר על בסיס γH2AX מוקדים הפך כלי רב ערך, במיוחד בביולוגיה קרינה, להערכת radiosensitivity רקמות ההשפעות של תרכובות קרינה שינוי. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

ניתוח מיקרוסקופי של γH2AX מוקדים, אשר הטופס הבא זירחון של H2AX ב Ser-139 בתגובה פעמיים גדיל הדנ"א נשבר, הפך להיות כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן השתמשנו נוגדנים מונו מפוגל היסטון H3 ב ליזין 4 כסמן epigenetic של euchromatin פעיל לתעתוק, כדי להעריך את הפריסה המרחבית של היווצרות γH2AX קרינה הנגרמת בתוך הגרעין.

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

פרוטוקול להערכת שינויים ברמות הנזק ל-DNA וביכולת תיקון ה-DNA שעלולים להיגרם על ידי הקרנה כרונית במינון נמוך in vivo בלימפוציטים של טחול עכבר, על ידי מדידת היסטון זרחני H2AX, מוצג סמן לשבירות דו-גדיליות של DNA, באמצעות זרימה ציטומטרית.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

השיטה המוצגת משלבת את הניתוח הכמותי של מעברי ה-DNA כפול סטרנד (DSBs), מחזור התא הפצה ו אפופטוזיס כדי לאפשר מחזור התא הערכה ספציפית של האינדוקציה DSBS ותיקון, כמו גם את ההשלכות של כשל בתיקון.

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא הוקמה במלואה. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לזהות וקדי המושרה קרינה (רי ' ף) של תיקון חלבונים על ידי immunofluorescence כתמים של סרטן המעי הגס האנושי התאים לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

פרוטוקול זה מציג את הכנת השקופית ואת הניקוד האוטומטי של γ-H2AX foci בדיקה על לימפוציטים דם היקפיים. כדי להמחיש את השיטה והרגישות של ההסתה, לימפוציטים מבודדים היו מוקרן במבחנה. שיטה אוטומטית זו של זיהוי DNA DSB שימושית עבור יישומי dosimetry ביולוגיים מהירים ותפוקה גבוהה.

שיטת ניקוד מיקרוסקופית אוטומטית לבדיקת מוקדי γ-H2AX בלימפוציטים אנושיים היקפיים

פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרות ותיקון של פריצות דו-גדילי DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעינים בין-פאזיים של לימפוציטים היקפיים אנושיים שטופלו בבלומיצין.

אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומהיר לזיהוי אינטראקציה של חלבונים באתרי נזק לדנ"א.

בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

למד כיצד לכמת מוקדי γH2AX בתגובה לקרינה גמא בתאי אדם באמצעות שיטת אימונופלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת לעקוב אחר נזק DNA ראשוני ותהליכי תיקון, ולהעריך את יעילות תרכובות משנות קרינה כגון רדיו-סנסיטייזרים ורדיו-פרוטקטורים.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

גלה סרטונים נוספים