Name: In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: גלה אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים חיים באמצעות טכניקת מיקרו-דפוס. שיטה זו מאפשרת זיהוי אינטראקציות חלשות וניתוח כמותי ברזולוציה מרחבית לחקר תהליכים תאיים דינמיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות Quentina ביטי, אוניברסיטת לינץ, אוסטריה, על עזרתה האדיבה, קתרינה Strub, אוניברסיטת ג&#39;נבה, שוויץ, עבור הקמת hCD71-GFP, ודניאל Legler, אוניברסיטת קונסטנץ, שוויץ, עבור ה-GPI-GFP DAF-לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF; פרויקט Y250-B03) ואת פרויקט GEN-AU משרד האוסטרי למדע ומחקר.

Microcontact הדפסה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור שדה micropattern של הבול PDMS באמצעות אזמל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השדה המכיל את micropattern על ידי שטיפה זה עם אתנול (100%) ומים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש חותמת PDMS עם חנקן או גז ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl-BSA Cy5 פתרון עבודה (0.67 מ"ג / מ"ל) על הבול PDMS כך שהשדה כולו micropattern מכוסה פתרון. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השדה micropattern על ידי שטיפה עם בופר פוספט (PBS) ומים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש PDMS עם חנקן או גז ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החותמת PDMS תחת כובד משקלו על גבי באמצע coverslip אפוקסי מצופה אחד דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל את המיקום של החותמת PDMS על הישבן של coverslip לבין הרצועה החותמת משקופית עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stick Secure חותם הכלאה קאמרית מעל שדה microcontact מודפס על coverslip. התווית עוזר למקם את מרכז השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 60 streptavidin μl עבודה פתרון (50 מיקרוגרם / מ"ל) לתוך תא התגובה דגירה המדגם עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם עם 1 מ"ל PBS על ידי הוספת מאגר ליציאת אחד של החדר ואת הסרתו בו זמנית בנמל השני עם משאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 60 עובדים μl biotinylated פתרון נוגדן (10 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS בתוספת 0.1% Tween 20: "PBST") לתוך תא התגובה דגירה של 60 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם עם 1 מ"ל PBST ולאחר מכן 1 מ"ל PBS על ידי הוספת מאגר ליציאת אחד של החדר והסרת אותו שוב בנמל השני עם משאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות משטחי micropatterned ב PBS בחושך בטמפרטורת החדר עד תאים מוכנים זריעה. </li></ol> דגירה של תאים על פני השטח micropatterned: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים חסיד אל מפגש 50% צלחת 3 רקמות ס"מ תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק התאים לבטא הפיתיון טרף חלבונים עניין עם פתרון Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) חומצה צנטריפוגות 5 דקות ב 1000 סל"ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו לפזר את התא גלולה במדיום הגידול פי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 סל"ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו לפזר את התא גלולה במדיום הגידול המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבורסה PBS מהאולם תגובה על ידי coverslip micropatterned μl 60 השעיה של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תא humidified על ידי השריית משטח סטרילי במים מזוקקים ומכניסים אותו לתוך צלחת פטרי כדי למנוע מדגם ריצה יבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים על פני הלילה בשעה 37 ° C באווירה 5% CO 2 על משטחים micropatterned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח תאים במיקרוסקופ, חילופי בינוני שנאגרו על ידי פתרון של האנק מלח כולל Ca 2 + ו - Mg 2 +. </li></ol> מיקרוסקופית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip ממוקם על הר מתאימים את המורפולוגיה התא נבדק תחת אור לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האיכות של ה-BSA Cy5 דפוסי נבדק על ידי עירור ב 647 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropatterns של חלבון פלואורסצנטי טרף (GFP או YFP) נרשמות 488 או 514 ננומטר תחת סך עירור פנימית השתקפות (TIR). </li></ol> נציג התוצאות: אם יש אינטראקציה בין חלבונים בתאים היעד גדל על משטח micropatterned, הטרף יעברו חלוקה מחדש הפיתיון. Micropattern וכתוצאה מכך ניתן דמיינו לפי תווית של חלבון פלואורסצנטי את הטרף. חשוב לציין את הניגוד המתקבל מספק מדידה ישירה של כוח האינטראקציה (ראה איור 1). לכן הערכה פשוטה של ​​אינטראקציה של שני חלבונים הופך אפשרי - ללא צורך להמשיך ולעבד את הנתונים העיקריים שנמדדו. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סידור מחדש של הפיתיון בתוך קרום התא פלזמה לחיות בעוצמות אינטראקציה שונה. תמונות TIR של תאים T24 transfected עם (א) CD71-GFP על נוגדן CD71, (ב) ו - CD4 YFP cytosolic על נוגדנים CD4 ו - (ג) GPI-GFP-DAF-CD59 על נוגדן microbiochips מוצגים. נתונים אופייניים עבור חזקה (א), לא (ב) או אינטראקציה חלשה (ג). (א) מובא מן (Weghuber et al., In press), (ב) מ - (Schwarzenbacher et al. 2008).

<ol><li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+%22Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li>
<li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li>
<li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+screening%3A+a+technology+in+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li>
<li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li>
<li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

הסרטון מכיל תמונות סופקו על ידי אולימפוס, שנלקחו הבית של מעבדת המחקר של ויזואליזציה, אוניברסיטת בראון או לשכפל מ (Kim et al., 2003).

הסרטון מלווה מדגים שיטה לאיתור חלבונים אינטראקציות קרום הפלזמה של תאים חיים (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). בעיקרון, כל פלטפורמה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF יכול לשמש כמערכת readout. רק כאשר רגישות גבוהה הוא הרצוי (למשל לצורך זיהוי של מולקולות בודדות), מיקרוסקופים מתקדמים יידרש. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר בנקודות קריטיות הבאה במהלך תהליך ההכנה דורש תשומת לב מיוחדת: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cy5 מניות חנות פתרון בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore ולהכין את BSA-Cy5 פתרון לעבוד טרי לפני הדפסת microcontact. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהר שלא לשרוט את micropattern על PDMS עם קצה פיפטה ו דגירה המדגם בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את coverslip על משטח סטרילי כדי למנוע הידבקות של שקופיות הזכוכית כדי בצלחת פטרי. לאחר חותמת PDMS דבק כדי להחליק את הזכוכית, לא להזיז אותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע בועות אוויר בתא התגובה דגירה המדגם בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תתנו המדגם יבש במשך יותר מ 2 דקות, כדי למנוע היווצרות של גבישי מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניתוק של התאים לא משתמשים טריפסין כפי לדבוק הרצון תחום תאי של חלבונים בממברנה ביטוי עד כה. הימנעות טריפסין יהיה מועיל חלבונים עם תחלופה נמוכה כדי ליצור micropatterns מיד לאחר ההתקשרות של תאים על פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיקוח על מספר התאים מודגרות במיקרוסקופ ולוודא כי התאים אינם מגיעים יותר מ 30-50 מפגש%. ודא כי תאים מופרזת יוסרו לאלתר בשל המצורף מהירה של תאים על פני השטח נוגדן מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות רק עם איכות גבוהה-BSA Cy5 דפוסי ניתן להשתמש לצורך ניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביטוי יציבה של חלבון פלואורסצנטי טרף עדיפה בשל מספר גדול יותר של תאים ניתן לנתח לכל סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמה נאותה TIRF היא הכרחית כדי להמחיש דפוסי בשל הרקע cytosolic. </li></ol> הטכניקה מיקרו דפוסים מציע מספר אפשרויות לניתוח אינטראקציות בין חלבונים. ראשית, יחד עם כימות של המקומיים, חלבונים אינטראקציות החליט מרחבית גם זיהוי של אינטראקציות חלשות או עקיף אפשרי בלי החיסרון של מתן מספר גבוה של תוצאות חיוביות או שליליות שגויות. שנית, היא מאפשרת לנתח חוקר חלבונים אינטראקציות קרום הפלזמה של תאים חיים, אשר קשה להשיג באמצעות גישות ביוכימיות כמו מסך 2-היברידית. שלישית הגישה מאפשרת זיהוי של הפיתיון טרף אינטראקציות כי הם מווסתת על ידי שינויים סביבתיים כמו טמפרטורה, נוכחות של חלבונים שונים או מולקולות אחרות או שלאחר translational שינויים. לפיכך assay מאפשר מאפננים ההקרנה של זוג אינטראקציה נתון בהקשר של תאים חיים. יתר על כן, על ידי הקטנת צפיפות השטח של ליגנד ללכוד או שימוש ligands חד ערכי, ניתוח של מצב המנוחה הופך אפשרי. לבסוף, אם פלטפורמות סריקה נאותה משמשים, את מספר התאים ניתח גבוה מספיק כדי להתאים לדרישות תפוקה גבוהה של חברות התרופות להקרנה סמים (Ramm, 2005).

in-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

להתיר את רשת אינטראקציה של מולקולות<em&gt; ב-vivo</em&gt; היא המפתח להבנת המנגנונים המווסתים את תפקוד התא וחילוף חומרים. שפע של אפשרויות מתודולוגי לטיפול אינטראקציות מולקולריות בתאים פותחו, אבל רוב השיטות האלה סובלים להיות עקיפה ולא כמותית ולכן בקושי. להיפך, כמה-high-end גישות כמותיות הוכנסו, אשר עם זאת קשה להאריך תפוקה גבוהה. כדי לשלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי, אנו לאחרונה פיתחו תפיסה חדשה לזיהוי חלבונים אינטראקציות (Schwarzenbacher<em&gt; ואח&#39;</em&gt;. 2008). כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתכנון ובנייה של מערכת זו אשר מאפשרת לניתוח אינטראקציות בין חלבון-fluorophore שכותרתו (&quot;טרף&quot;) לבין חלבון קרום (&quot;פיתיון&quot;)<em&gt; ב-vivo</em&gt;. תאים הם מצופה על משטחים micropatterned פונקציונליות עם נוגדנים כנגד תחום exoplasmic את הפיתיון. Bait-טרף אינטראקציות הם assayed באמצעות חלוקה מחדש של הטרף ניאון. השיטה מתאפיינת ברגישות גבוהה עד לרמה של מולקולות בודדות, את היכולת לזהות אינטראקציות חלשות, יכולת תפוקה גבוהה, מה שהופך אותו רלוונטי ככלי מיון.

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

פענוח רשת האינטראקציות של מולקולות in-vivo הוא המפתח להבנת המנגנוים המווסתים את תפקוד התא ואת המטבוליזם. שפע של...

חשוב במיוחד לפענח את רשת האינטראקציות של מולקולות בתאים חיים כדי להבין את המנגנונים המווסתים את חילוף החומרים ותפקוד התא. מספר גדל והולך של מתודולוגיות המספקות מידע איכותני וכמותי מהווה את הכוח המניע בדרכנו להשגת תמונות הוליסטיות של תפקוד התא. בדיקות Co ip, TAP tag או photo cross linking מאפשרות ניקוי של מולקולות קדם in vitro.בנוסף, תוכננו מספר גישות לניתוח אינטראקציות של חלבונים בתא חי. אלו כוללות שני סרקי היבריד או בדיקות השלמה של חלבונים פלואורסצנטיים. יתרה מכך, הוכנסו לשימוש גישות ספקטרוסקופיות כגון fret או FCS וכן שיטות שאינן ספקטרוסקופיות כדי להתמודד עם שאלה זו.הטכניקות שהוזכרו לעיל פותחו להקלטה של אוכלוסיות תאים גדולות, אך הן סובלות מכך שהן עקיפות למדי ולפיכך בקושי כמותיות. לעומת זאת, הוצגו מספר גישות כמותיות מתקדמות. עם זאת, קשה לשלב יכולות של תפוקה גבוהה עם האפשרות להפקת מידע כמותי.פיתחנו לאחרונה קונספט חדש לזיהוי אינטראקציות בין חלבונים. טכניקת המיקרו-תבנית המוצגת כאן היא איור סכימטי של רשתות SA במיקרו-תבנית של BSA Sci five המודפסות על לוחות כיסוי מזכוכית פונקציונלית, כאשר הרווחים ביניהן ממולאים בסטריפטאווידין, ולאחריו ליגנדים בביוטיניציה. ברוב המקרים, מדובר בנוגדנים נגד הממברנה.חלבון פיתיון בתאים הגדלים על שבבי מיקרוביום כאלה. הפיתיון יסודר בממברנה הפלזמית בהתאם לתבנית המיקרו של הנוגדן. אינטראקציות עם חלבון טרף שני המסומן פלואורסצנטית נבדקות על ידי מדידת מידת התבניות המשותפות (co pattering), באמצעות חותמת PD MS של מאסטר סיליקון עם מערך של ריבועים בעלי גודל ומעמקי מאפיין.שלושת המיקרומטרים מופקים מגל ונגזרים ממנו. החותמות נשטפות עם 100% ethanol ומים מזוקקים פעמיים, ואחר כך יובשו בעזרת חנקן. הן מודגרות עם 0.67 milligrams per milliliter של sci-fi.תמיסת BSA מסומנת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במהלך הדגירה; זכוכית כיסויים למשטח המערכת המודבקת באפוקסי מנוקת באופן דומה. באופן דומה לאחר הדיוור, החותמות נשטפות ב-PBS ובמים. עבור BSA sci five העברה.מייבשים את החותמת באמצעות חנקן, ומיד לאחר מכן מניחים אותה תחת משקלה העצמי מתחת לזכוכית כיסוי למשך 30 Minutes. מיקומו של שדה התבנית המיקרוסקופית מסומן בחלקו האחורי של זכוכית הכיסוי. לאחר הסרת החותמות, אוטמים את זכוכיות הכיסוי באמצעות מסכות סיליקון דביקות.טוענים את התאים בתמיסת Streptavidin בריכוז 50 microgram per milliliter, מדגירים למשך שעה ושוטפים לאחר מכן ב-1 milliliter PBS. לאחר מכן, מדגירים את תבניות ה-streptavidin עם נוגדן biotinylated בריכוז 10 micrograms per milliliter למשך שעה, ולאחר שטיפה ב-PBS טוענים תאים לתוך התא. כאשר התאים נצמדים למשטח, הדגימה מוכנה למדידות.הדרישה היחידה עבור הקריאה היא מיקרוסקופ פלואורסצנציה המסוגל להאיר את הדגימה בתצורת השתקפות פנימית מלאה (total internal reflection). מערכות כאלו זמינות מסחרית מספקים שונים והפכו לקלות לתפעול עבור המשתמש במהלך השנים האחרונות. מערכת הזיהוי שלנו מורכבת על מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence microscope).לייזרים של יוני ארגון וקריפטון משמשים לעירור פלואורסצנציה סלקטיבי של הפלואורופורים שבהם נעשה שימוש; הדגימות מוארות בתצורת הח reflection פנימי מלא (TIR) מבוססת עדשה, באמצעות עדשת שמן עם הגבהה גבוהה (high NA) והגדלה של 100. לאחר סינון מתאים באמצעות סטים של מסננים סטנדרטיים, הפלואורסצנציה מודמיינת על גבי מצלמת CCD עם תאורה אחורית. הקריאה מבוצעת במצב השהיית זמן ואינטגרציה (time delay and integration), המאפשר סריקה של שטחי דגימה גדולים. לשם כך, הדגימות מוזזות באמצעות במה מוטורית XY המסונכרנת להזזת השורות של המצלמה.קרן הלייזר המוחזרת ממופה על פוטודיודה בעלת שני סגמנטים, והאות הדיפרנציאלי משמש לשליטה ב-Z pizo לצורך מיקוד מחדש מהיר. הקורא מצויד במערכת אוטומטית לשמירה על המיקוד הפועלת במהלך תהליך הסריקה, כאשר סריקה אחת מתבצעת ב-488 nanometer לעירור סלקטיבי של GFP, והסריקה השנייה ב-647 nanometer לעירור סלקטיבי של PS Five. לצורך ניתוח הנתונים, אנו משתמשים בתוכנה לחישוב ניגודיות שנכתבה ב-MATLAB, המבוססת על עוצמת הפלואורסצנציה בתוך ומחוץ לאזור הנוגדן שנלכד.רמת הניגודיות, ובכך מידת האינטראקציה של החלבונים, מנותחת לצורך ניתוח מהיר של מספר רב של תאים. ניתן להשתמש גם בתוכנות אוטומטיות זמינות מסחרית. לדוגמה, תוכנת הדימיג scan R המוצעת על ידי Olympus נבחנה בהצלחה להערכת הניגודיות בניסויי מיקרו-דפוס (micro pattering).אנו מנתחים את האינטראקציה הידועה של CD4 ו-LCK, חלבונים בשבילי אות תאי T מוקדמים, כפי שמוצג כאן. LCK פלואורסצנטי מתעדכן בבירור על אזורים מצופים בנוגדן CD4. שיבוש של מבנה ה-zinc clasp, המהווה אתר אינטראקציה מרכזי של שני חלבונים אלו, על ידי הוספת chelator של אבץ, מפחית מאוחר יותר את הניגודיות של מיקרו-דפוסים של LCK.לסיכום, היתרונות העיקריים של טכניקת המיקרו-דפוס (micro patterning) הם כדלקמן: כימות של אינטראקציות חלבונים מקומיות בעלות רזולוציה מרחבית. יתרה מכך, גילוי של אינטראקציות חלשות גם בממברנה הפלזמית של תאים חיים, גילוי של אינטראקציות bait-prey מודולות, ניתוח של מצב מנוחה, והתאמת הגישה לסריקה בקיבולת גבוהה (high throughput).

in-vivo-detection-protein-protein-interactions-on-micro-patterned

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

בדיקת מערך פפטידים היא בדיקת תפוקה גבוהה לזיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבון לחלבון. זה מאפשר מיפוי אינטראקציות מרובות של חלבון מטרה ויכול לשמש כשיטה לזיהוי אתרים למעכבים המכוונים לחלבון. כאן אנו מתארים פרוטוקול לסינון וניתוח מערכי פפטידים.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

כאן, אנו מראים כיצד להשתמש Assay מצדו קרבה (PLA) כדי להמחיש את MST1/MST2 heterodimerization בתאים קבוע עם רגישות גבוהה.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

המטרה הכללית שלנו היא להבין כיצד תאים התחושה מסחטות רמזים כי להוביל צמיחה סיבי מכוון. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה של adsorption מולקולרית המושרה אור של חלבונים, משמש כדי לייצר מיקרו דפוסים מוגדרים של מטריקס רכיבים מטריצות על מנת ללמוד אירועים ספציפיים השולטים אקסון הצמיחה ואת מציאת.

המושרה באור Adsorption מולקולרית של חלבונים באמצעות מערכת פרימו עבור מיקרו הפנינג כדי ללמוד התגובות לתא מטריצות חלבונים מטריקס

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

הפרוטוקול מציג שיטה להצמדה קוולנטית in vivo של ביוטין לחלבונים על סמך קרבתם לביוטין ליגאז המותך לחלבון מעניין. שינוי זה מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים באמצעות חרוזי סטרפטווידין לפי הצורך במחקרי אינטראקציה עם חלבונים.

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

גלה אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים חיים באמצעות טכניקת מיקרו-דפוס. שיטה זו מאפשרת זיהוי אינטראקציות חלשות וניתוח כמותי ברזולוציה מרחבית לחקר תהליכים תאיים דינמיים.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

גלה סרטונים נוספים