In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

חשוב במיוחד לפענח את רשת האינטראקציות של מולקולות בתאים חיים כדי להבין את המנגנונים המווסתים את חילוף החומרים ותפקוד התא. מספר גדל והולך של מתודולוגיות המספקות מידע איכותני וכמותי מהווה את הכוח המניע בדרכנו להשגת תמונות הוליסטיות של תפקוד התא. בדיקות Co ip, TAP tag או photo cross linking מאפשרות ניקוי של מולקולות קדם in vitro.

בנוסף, תוכננו מספר גישות לניתוח אינטראקציות של חלבונים בתא חי. אלו כוללות שני סרקי היבריד או בדיקות השלמה של חלבונים פלואורסצנטיים. יתרה מכך, הוכנסו לשימוש גישות ספקטרוסקופיות כגון fret או FCS וכן שיטות שאינן ספקטרוסקופיות כדי להתמודד עם שאלה זו.

הטכניקות שהוזכרו לעיל פותחו להקלטה של אוכלוסיות תאים גדולות, אך הן סובלות מכך שהן עקיפות למדי ולפיכך בקושי כמותיות. לעומת זאת, הוצגו מספר גישות כמותיות מתקדמות. עם זאת, קשה לשלב יכולות של תפוקה גבוהה עם האפשרות להפקת מידע כמותי.

פיתחנו לאחרונה קונספט חדש לזיהוי אינטראקציות בין חלבונים. טכניקת המיקרו-תבנית המוצגת כאן היא איור סכימטי של רשתות SA במיקרו-תבנית של BSA Sci five המודפסות על לוחות כיסוי מזכוכית פונקציונלית, כאשר הרווחים ביניהן ממולאים בסטריפטאווידין, ולאחריו ליגנדים בביוטיניציה. ברוב המקרים, מדובר בנוגדנים נגד הממברנה.

חלבון פיתיון בתאים הגדלים על שבבי מיקרוביום כאלה. הפיתיון יסודר בממברנה הפלזמית בהתאם לתבנית המיקרו של הנוגדן. אינטראקציות עם חלבון טרף שני המסומן פלואורסצנטית נבדקות על ידי מדידת מידת התבניות המשותפות (co pattering), באמצעות חותמת PD MS של מאסטר סיליקון עם מערך של ריבועים בעלי גודל ומעמקי מאפיין.

שלושת המיקרומטרים מופקים מגל ונגזרים ממנו. החותמות נשטפות עם 100% ethanol ומים מזוקקים פעמיים, ואחר כך יובשו בעזרת חנקן. הן מודגרות עם 0.67 milligrams per milliliter של sci-fi.

תמיסת BSA מסומנת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במהלך הדגירה; זכוכית כיסויים למשטח המערכת המודבקת באפוקסי מנוקת באופן דומה. באופן דומה לאחר הדיוור, החותמות נשטפות ב-PBS ובמים. עבור BSA sci five העברה.

מייבשים את החותמת באמצעות חנקן, ומיד לאחר מכן מניחים אותה תחת משקלה העצמי מתחת לזכוכית כיסוי למשך 30 Minutes. מיקומו של שדה התבנית המיקרוסקופית מסומן בחלקו האחורי של זכוכית הכיסוי. לאחר הסרת החותמות, אוטמים את זכוכיות הכיסוי באמצעות מסכות סיליקון דביקות.

טוענים את התאים בתמיסת Streptavidin בריכוז 50 microgram per milliliter, מדגירים למשך שעה ושוטפים לאחר מכן ב-1 milliliter PBS. לאחר מכן, מדגירים את תבניות ה-streptavidin עם נוגדן biotinylated בריכוז 10 micrograms per milliliter למשך שעה, ולאחר שטיפה ב-PBS טוענים תאים לתוך התא. כאשר התאים נצמדים למשטח, הדגימה מוכנה למדידות.

הדרישה היחידה עבור הקריאה היא מיקרוסקופ פלואורסצנציה המסוגל להאיר את הדגימה בתצורת השתקפות פנימית מלאה (total internal reflection). מערכות כאלו זמינות מסחרית מספקים שונים והפכו לקלות לתפעול עבור המשתמש במהלך השנים האחרונות. מערכת הזיהוי שלנו מורכבת על מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence microscope).

לייזרים של יוני ארגון וקריפטון משמשים לעירור פלואורסצנציה סלקטיבי של הפלואורופורים שבהם נעשה שימוש; הדגימות מוארות בתצורת הח reflection פנימי מלא (TIR) מבוססת עדשה, באמצעות עדשת שמן עם הגבהה גבוהה (high NA) והגדלה של 100. לאחר סינון מתאים באמצעות סטים של מסננים סטנדרטיים, הפלואורסצנציה מודמיינת על גבי מצלמת CCD עם תאורה אחורית. הקריאה מבוצעת במצב השהיית זמן ואינטגרציה (time delay and integration), המאפשר סריקה של שטחי דגימה גדולים. לשם כך, הדגימות מוזזות באמצעות במה מוטורית XY המסונכרנת להזזת השורות של המצלמה.

קרן הלייזר המוחזרת ממופה על פוטודיודה בעלת שני סגמנטים, והאות הדיפרנציאלי משמש לשליטה ב-Z pizo לצורך מיקוד מחדש מהיר. הקורא מצויד במערכת אוטומטית לשמירה על המיקוד הפועלת במהלך תהליך הסריקה, כאשר סריקה אחת מתבצעת ב-488 nanometer לעירור סלקטיבי של GFP, והסריקה השנייה ב-647 nanometer לעירור סלקטיבי של PS Five. לצורך ניתוח הנתונים, אנו משתמשים בתוכנה לחישוב ניגודיות שנכתבה ב-MATLAB, המבוססת על עוצמת הפלואורסצנציה בתוך ומחוץ לאזור הנוגדן שנלכד.

רמת הניגודיות, ובכך מידת האינטראקציה של החלבונים, מנותחת לצורך ניתוח מהיר של מספר רב של תאים. ניתן להשתמש גם בתוכנות אוטומטיות זמינות מסחרית. לדוגמה, תוכנת הדימיג scan R המוצעת על ידי Olympus נבחנה בהצלחה להערכת הניגודיות בניסויי מיקרו-דפוס (micro pattering).

אנו מנתחים את האינטראקציה הידועה של CD4 ו-LCK, חלבונים בשבילי אות תאי T מוקדמים, כפי שמוצג כאן. LCK פלואורסצנטי מתעדכן בבירור על אזורים מצופים בנוגדן CD4. שיבוש של מבנה ה-zinc clasp, המהווה אתר אינטראקציה מרכזי של שני חלבונים אלו, על ידי הוספת chelator של אבץ, מפחית מאוחר יותר את הניגודיות של מיקרו-דפוסים של LCK.

לסיכום, היתרונות העיקריים של טכניקת המיקרו-דפוס (micro patterning) הם כדלקמן: כימות של אינטראקציות חלבונים מקומיות בעלות רזולוציה מרחבית. יתרה מכך, גילוי של אינטראקציות חלשות גם בממברנה הפלזמית של תאים חיים, גילוי של אינטראקציות bait-prey מודולות, ניתוח של מצב מנוחה, והתאמת הגישה לסריקה בקיבולת גבוהה (high throughput).