In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

יש חשיבות מיוחדת לחשוף את רשת האינטראקציה של מולקולות בתאים חיים כדי להבין את המנגנונים המווסתים את חילוף החומרים והתפקוד של התא. מספר הולך וגדל של מתודולוגיות המספקות מידע איכותי וכמותי הן הכוח המניע בדרכנו לקבלת תמונות הוליסטיות של תפקוד התא. Co ip, תג TAP או מאמרי קישור צולבים לתמונות מאפשרים טיהור של מולקולות מוקדמות במבחנה.

בנוסף, תוכננו מספר גישות לניתוח אינטראקציות חלבונים בתא החי. אלה כוללים שני מסכים היברידיים או מאמרי השלמה של חלבונים פלואורסצנטיים. יתר על כן, כמה גישות ספקטרוסקופיות כמו שריג או FCS וגם שיטות לא ספקטרוסקופיות הוקמו כדי לענות על שאלה זו.

הטכניקות שהוזכרו לעיל פותחו לרישום אוכלוסיות גדולות של תאים אך סובלות מהיותן עקיפות למדי ולכן כמעט ולא כמותיות. לעומת זאת, הוצגו כמה גישות כמותיות מתקדמות. עם זאת, קשה לשלב יכולות תפוקה גבוהות עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

לאחרונה פיתחנו קונספט חדש לזיהוי אינטראקציות חלבון חלבון. טכניקת המיקרו-פאטרינג כאן היא המחשה סכמטית של רשתות ה-SA המיקרו-פאטרינג של BSA Sci 5 מודפסות על פתקי כיסוי זכוכית פונקציונליים ומרווחים מתמלאים בסטרפטווידין, ואחריהם ליגנדים ביוטיניליים. ברוב המקרים, נוגדנים נגד הממברנה.

פיתיון חלבון בתאים הגדלים על שבבי מיקרוביום כאלה. הפיתיון יהיה מסודר בקרום הפלזמה על פי דפוס המיקרו של הנוגדנים. אינטראקציות עם טרף חלבון שני המסומן באופן פלואורסצנטי נבדקות על ידי מדידת מידת ה-co-pattering באמצעות חותמת PD MS מאסטר סיליקון עם מערך ריבועים עם גודל ועומק תכונה.

שלושת המיקרומטר מיוצרים מג'ל וחותכים. הבולים נשטפים ב-100% אתנול ומים מזוקקים כפולים ומייבשים בחנקן לפני כן. הם מודגרים עם 0.67 מיליגרם למיליליטר מדע בדיוני.

תמיסת BSA מסומנת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במהלך הדגירה, מנקים את החלקות כיסוי הזכוכית שהשתנו באפוקסי באותו אופן. באותו אופן לאחר הדיו, החותמות נשטפות ב-PBS ומים. עבור BSA sci חמש העברה.

חותמת מיובשת על ידי חנקן ומיד לאחר מכן מונחת תחת משקלה מתחת לכיסוי זכוכית למשך 30 דקות. המיקום של שדה דפוס המיקרו מסומן בצד האחורי של החלקת הכיסוי. עם הסרת החותמות, פתקי הכיסוי נאטמים במסכות סיליקון דביקות.

התאים נטענים בתמיסת סטרפטווידין של 50 מיקרוגרם למיליליטר מודגרת למשך שעה ונשטפת במיליליטר PBS לאחר מכן. לאחר מכן, דפוסי הסטרפטווידין מודגרים עם 10 מיקרוגרם למיליליטר נוגדן ביוטיניל למשך שעה ולאחר שטיפה עם תאי PBS נטענים לתא. כאשר התאים נצמדו לפני השטח, הדגימה מוכנה למדידות.

הדרישה היחידה לקריאה היא מיקרוסקופ פלואורסצנטי המסוגל להאיר את הדגימה בתצורת השתקפות פנימית כוללת. מערכות כאלה זמינות מסחרית מספקים שונים והפכו קלות לטיפול עבור המשתמש במהלך השנים האחרונות. מערכת הגילוי שלנו מוגדרת על מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי.

לייזרי יונים ארגון וקריפטון משמשים לעירור פלואורסצנטי סלקטיבי של ארבע הפלואורו המשומשות דגימות מוארות בתצורת השתקפות פנימית כוללת מבוססת מטרה באמצעות יעד טבילת שמן NA גבוה בהגדלה פי 100. לאחר סינון מתאים באמצעות ערכות מסננים סטנדרטיות, הקרינה מצולמת על גבי מצלמת CCD מוארת אחורית הקריאה מתבצעת בעיכוב זמן ובמצב אינטגרציה, המאפשר סריקה של אזורי דגימה גדולים. לשם כך, הדגימות מוזזות באמצעות שלב XY ממונע המסונכרן עם הזזת הקו של המצלמה.

קרן הלייזר המוחזרת האחורית מצולמת על דיודת צילום דו-מקטעים והאות הדיפרנציאלי משמש לשליטה בפיזו Z למיקוד מחדש מהיר. הקורא מצויד במערכת החזקת מיקוד אוטומטית הפועלת במהלך תהליך הסריקה עם סריקה אחת ב-488 ננומטר לעירור סלקטיבי של GFP, הסריקה השנייה ב-647 ננומטר לעירור סלקטיבי של PS Five. לניתוח נתונים, אנו משתמשים בתוכנית חישוב ניגודיות שנכתבה ב-MATLAB בהתבסס על עוצמת הקרינה בתוך ומחוץ לאזור הנוגדנים שנלכד.

רמת הניגודיות ובכך מידת האינטראקציה של החלבון מנותחת לניתוח מהיר של מספר רב של תאים. כמו כן, ניתן להשתמש בתוכנה אוטומטית זמינה מסחרית. לדוגמה, תוכנת ההדמיה scan R המוצעת על ידי אולימפוס נבדקה בהצלחה להערכת ניגודיות של ניסויי מיקרו פאטרינג.

אנו מנתחים את האינטראקציה הידועה של CD 4 ו-LCK לחלבונים באיתות מוקדם של תאי T כפי שמוצג כאן. פלואורסצנטי LCK מפיץ מחדש בבירור על גבי CD ארבעה אזורים מצופים נוגדנים. שיבוש במבנה אבזם האבץ, המהווה אתר אינטראקציה עיקרי של שני חלבונים אלה על ידי הוספת תא אבץ מפחית מאוחר יותר את הניגודיות של דפוסי המיקרו של LCK.

לסיכום, היתרונות העיקריים של טכניקת דפוס המיקרו הם כדלקמן, כימות אינטראקציות חלבון מקומיות שנפתרו מרחבית. יתר על כן, איתור אינטראקציות חלשות גם בקרום הפלזמה של תאים חיים, זיהוי אינטראקציות טרף פיתיון מווסות, ניתוח מצב המנוחה וישימות הגישה לתפוקה גבוהה.