Name: המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: למד את שיטת esiRNA לסקרי RNAi בקנה מידה גדולה בתאי יונקים. מאמר זה מדגים אופטימיזציה של תנאי טרנספקציה, הערכה סטטיסטית ואימות תוצאות לזיהוי גנים המעורבים בחלוקת תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לחברי מעבדה בוכהולץ ואת סיגמא אולדריץ RNAi צוות לדיון. ברצוננו להודות מקס פלאנק החברה ואת für Bundesministerium Bildung und Forschung Grands Go-Bio [0315105] לתמיכה. MISSION ® הינו סימן מסחרי רשום של סיגמא אולדריץ ביוטכנולוגיה LP

1. באיכות גבוהה esiRNA המשימה ספריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל עניין הגן לאזור המיקוד רגישים ביותר ספציפית עבור RNAi נבחר ניצול אלגוריתם DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 ציונים DEQOR את הפוטנציאל ההשתקה של כל אפשרי 21 נוקלאוטידים siRNAs ארוכה mRNA-היעד המבוסס על המדינה-of-the-art עיצוב אילוצים 4. בנוסף, siRNA כל הפוטנציאל הוא ניתח עבור תגובתיות צולבת אפשרי עם גנים אחרים על ידי ביצוע חיפוש תפציץ נגד transcriptome האורגניזם למד. התוכנית ובכך מספק ניתוח של איכות הכוללת בין היכולות של השתקה esiRNA את הפוטנציאל (300-600 אורך נ&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האזור הנבחר של גנים היעד cDNA מוגבר על ידי ה-PCR באמצעות גן ספציפי primers מוקף bacteriophage RNA-פולימראז-האמרגן רצפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מוצר PCR המשמש לייצור esiRNA המשימה מאומתת זהות על ידי רצף של טוהר על ידי ניתוח Labchip Caliper. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לונג פעמיים תקועים RNA הוא עיבד מ-PCR המוצר על ידי RNA פולימראז, ואחריו חישול של גדילי עיבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> esiRNAs מוכנים על ידי עיכול אנזימטי מוגבל של פעמיים תקועים רנ&quot;א ארוך באמצעות RNaseIII ואחריו טיהור באמצעות כרומטוגרפיה אניון מטבע ניצול Q-sepharose עמודות ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> esiRNAs הם זירז ו resuspended במאגר TE. התשואה נמדדת UV-קליטת מדידות ריכוז מותאם ידי המסת בכרך המתאים של חיץ TE. האיכות הכוללת של המוצר הסופי נבדק על ידי ניתוח Labchip Caliper. </li></ol> 2. בחירת שורת תאים ואופטימיזציה transfection להקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמויות לכיל של esiRNA (שימוש Eg5 כמו חיוביים renilla-בלוציפראז כביקורת שלילית) והגדלת סכומי מגיב transfection בצלחת 384 היטב, מוסיפים תאים דגירה של 48 שעות. Eg5 הוא חלבון מנוע kinesin נדרש הרכבה ציר דו קוטבית דלדול מוביל לעצור mitotic. חזור על הליך זה עבור ריאגנטים transfection שונים שורות תאים. כאן, אנו משתמשים בתאים בתרבית הלה בעקבות הליכים סטנדרטיים oligofectamine (Invitrogen) כמו מגיב transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחירת תנאים אופטימליים transfection לספור את התאים transfected עם Eg5 esiRNAs להראות כי מעצר mitotic (צורה עגולה) ואת המספר הכולל של תאים transfected עם esiRNA (RLUC) renilla-בלוציפראז על ידי מיקרוסקופ אור. בחר את המצב עם רעילות לפחות RLUC ואת הפנוטיפ בולט ביותר Eg5. שיטה חלופית לייעול התנאים transfection כוללת שורת תאים יציבה מביע EGFP (או גן אחר כתב מתאים) תחת שליטה של ​​מקדם פעיל מכוננת. לאחר transfection של esiRNA נגד EGFP (או גן אחר כתב) ו RLUC (או אחרת esiRNA מתאים לשלוט שלילי) לדפוק למטה למדוד יעילות ורעילות על ידי מיון התא הקרינה למשל סייעה (FACS). ודא esiRNA המשמש EGFP הוא משלים לחלוטין-mRNA המטרה. </li></ol> 3. הגדרת את המסך ראשי 5,6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב את הדיוק pipetting עבור כל הרכיבים המשמשים בתחנת pipetting אוטומטיות (למשל אקווריוס, טקאן WellMate, מטריקס). בגלל הפרמטרים pipetting לשנות בהתאם לסוג סוג, פתרון נפח צלחת אופטימיזציה זה יש צורך לחזור על כל שלב בנפרד. אם אפשר, תחנת pipetting צריך להיות ממוקם מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהומים. כל הרכיבים המשמשים צריך להיות מחוטא לפני השימוש או על ידי מעוקר אם ישים או על ידי ריסוס עם אתנול 75%. מטב לשטוף פרוטוקולים כך צולבות זיהום היטב גם היא מחוץ לתחום. פרטים עבור אופטימיזציה של pipetting אוטומטיות לא ניתן לתת תמורת אילוצי מרחב תלויות במידה רבה התחנה pipetting מנוצל. לפרטים נוספים עיין בפרוטוקול מייצרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Transfect בפורמט 384 גם באמצעות תנאי אופטימיזציה מלמעלה עם esiRNAs עבור Eg5 ו RLUC. השתמש דפוס לסירוגין במשך Eg5 ו RLUC esiRNA מכסה את הצלחת כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה למשך 48 שעות לתקן את התאים עם 100% אתנול קר, רעננותם ב PBS במשך 15 דקות, כתם במשך 25 דקות ב PBS המכיל 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - 100 מיקרוגרם DAPI / ml RNase (Qiagen). לבסוף לשטוף עם PBS ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת עוצמת הקרינה על ידי-DAPI למשל במיקרוסקופ על מערכת אולימפוס ScanR. יצירת היסטוגרמה של עוצמת DAPI מזימות כנגד מספר התא להעריך את חלוקת מחזור התא על ידי חישוב אחוז התאים עם ה-DNA תוכן 2N עבור שלב G1; &lt;2N&gt; 4N עבור S-שלב; 4N עבור G2/M-phase ו &gt; 4N עבור aneuploidy / polyploidy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת ההומוגניות של תוצאות מעל הצלחת. אופטימיזציה נוספת נדרשת אם תוצאות שונות משמעותית להוציא effe עמדהCTS. בעיה שכיחה בעת שימוש רב גם לוחיות אידוי היא משופרת על בארות קצה בזמן הדגירה. זה מוביל תנאים ניסויים שונים בבארות שונים, אשר לעתים קרובות מתרגמת צלחת עמדה השפעות ספציפיות. מסיבה זו, אנו ממליצים להשאיר את כל בארות קצה ריק במסך. כדי לצמצם עוד יותר אידוי לוודא כי חממות נשמרים לחות גבוהה. אנחנו גם שגרתי להעסיק מחסומים אידוי כגון קלטת איטום קורנינג לנשימה אשר לחסום אידוי. משאבים אחרים גם עבור אפקטים עמדה צריך להילקח בחשבון, וריאציה טכניים כגון מערכת readout (מיקרוסקופ צלחת הקורא, וכו &#39;) או וריאציות בטיפול נוזלי (הדרגתיים, inhomogeneity של פתרונות, וכו&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבדלים סטטיסטיים בין בקרות חיוביות ושליליות לספק למדוד את המשמעות של assay מועסק. הבדל גדול בין שליטה שלילי (או רעשי רקע, שליטה מדומה) לבין המדגם צריך להיות הוקמה לפני תחילת ההקרנה בפועל. מדד טוב עבור המשמעות הסטטיסטית היא Z-הגורם. Z-גורם מחושב המשוואה הבאה: Z = 1 - (3 SD [מדגם] + 3 SD [מדומה]) * (| באב [מדגם] - באב [מדומה] |) -1; עם SD: סטיית התקן; באב: ממוצע. Z-פקטור של 1&gt; Z&gt; 0.5 מצביע על הפרדה מובהקת סטטיסטית של בקרות שלילית (רעש) מן שולטת חיוביים 7. </li></ol> 4. ראשי המסך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 384 גם תרבות צלחות רקמה transfection של esiRNAs ניצול התנאים אופטימיזציה מלמעלה. כאן, אנו משתמשים esiRNA 15ng מומס היטב לכל חיץ TE 5μl. לפחות שמונה עמדות בקרה לכל צלחת צריך להיות עמוסה בקרות חיוביות ושליליות מתאים לתהליך ביולוגי למד (כאן: Eg5 ו RLUC). כדי למנוע תופעות עמדה בארות קצה נטענים עם חיץ TE 5μl בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5μl OptiMEM (Invitrogen) המכיל Oligofectamine 0.2μl לכל היטב, לערבב דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ההשעיה התא על התערובת transfection (כאן: 40μl ההשעיה תא הלה במהירות של 25 תאים / ריכוז μl, שווה ערך ל 1000 לכל התאים היטב) ו דגירה במשך 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד ה-DNA על תוכן מיקרוסקופ אוטומטיות (אולימפוס ScanR, ראה לעיל). הערכת משתמש Z-ציון סטטיסטיקה לבחירה להכות: Z-הציונים מחושבים עבור כל esiRNAs מדגם באמצעות האות שליטה שלילי כנקודת התייחסות. שים לב, הציון-Z אינו זהה כגורם-Z. Z-עשרות לספק מידה סטטיסטית המשמעות של ערכי המדגם בהשוואה שליטה (מדומה). זה מחושב על המשוואה הבאה: Z = (ערך [לדוגמא] - ממוצע [מדומה]) * סטיית תקן-[מדומה] -1. עבור מבחר פגע סף צריך להיות מיושם. בדרך כלל, משמעות קריטריונים כמו: 2 &lt;Z &lt;-2 משמש, אבל תלוי באיכות של בסיס הנתונים, את חקר תהליך ביולוגי או פשוט היקף של המסך, ספי שונות עשויות לחול. לצד ה-Z ציון סטטיסטיקה קל למדי גם משוכלל יותר שיטות הערכה מתמטית ניתן להשתמש (בתוך הראשונה לתוך שדה רחב של הערכות סטטיסטיות של נתוני ההקרנה ניתן למצוא Malo et al. 8). </li></ol> 5. מסך משני ואימות פגע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך משני כדלקמן המסך העיקרי לחסל חיוביות שגויות עקב שגיאות ניסיוני או מחוץ היעד תופעות. במשך להיטים שנבחרו בהליך זהה בשימוש במסך הראשי יש לחזור על מספר גדול יותר של משכפל (3-5), כדי לאפשר הערכה סטטיסטית טובה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך להיטים מאומת esiRNA שאינן חופפות משני (או אחרת ההדק שאינן חופפות השתקה) נגד יעדים המזוהים המסכים הראשוני אמור לשמש. Assay אותו לקריאה החוצה צריך להיות מוחל גם על המסך הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של דבר הגנים הנבחר יכול להיות מאומת על ידי הצלה RNAi חוצה מינים 9. ובכך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) קידוד למשל ortholog את העכבר של הגן הוא transfected ביציבות לתוך התאים. BAC-בונה לשמר את הגן בהקשר הגנומי שלו ולאפשר ביטוי כמעט-פיזיולוגיים. RNAi נגד הגן האנושי אנדוגני יעזוב את transgene עכבר ביטוי ללא שינוי אשר מציל RNAi-פנוטיפ. RNAi הצלה מספק זהב סטנדרטי עבור אימות של פנוטיפים RNAi זמין עד כה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, המועמדים תוקף נלמדים בפירוט רב יותר בסופו של דבר לגזור הבנה מכניסטית. במקרים רבים RNAi יכול לשמש בניסויים אלה, למשל, מבחני משני משוכללים יותר. </li></ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
<li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEQOR%3A+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li>
<li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+mammalian+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li>
</ol>

מחברים להכריז יחסים פיננסיים עם גופים מסחריים שאולי יש אינטרס העבודה שהוגשה.

התערבות RNA הפך טכניקה סטנדרטיים ללמוד הפסד של פונקציה פנוטיפים. בקנה מידה גדול אוספים של RNAi-מתווכים זמינים ספקים שונים ולספק שיטה קלה, חסכונית ומהירה על השתקה של גן. זה פתח את השער להקרנה שיטתית מפתח שחקנים תהליכים ביולוגיים רבים ומאפשר פרספקטיבה הגנום בקנה מידה על מגוון רחב של מינים שונים, סוגי תאים. שיעורי גבוהה שווא שלילי חיובי כוזב הם אתגר משותף מסכי RNAi. כדי לטפל בבעיה זו, מאמצים רבים הושקעו על מנת לשפר את היעילות בפרט הספציפיות של השתקת מפעילה. התגלית החשובה הייתה בריכה של siRNAs שונה המיקוד התמליל זהה משפר באופן משמעותי את היעד הספציפיות. מכיוון בריכת מורכבת מאוד של siRNAs שונה מופק על ידי endoribonuclease, esiRNAs גבוהים סגוליות מעורר היעד, הפחתת שיעור חיובי כוזב מסכי RNAi. esiRNAs הוכיחו גם להשיג knockdowns יעיל, גם הפחתת שיעור שלילי כוזב. מכיוון מסכי RNAi הם תובענית מבחינה טכנית, סביר להניח שהם יישארו מאתגר לבצע על בסיס קבוע במשך זמן מה. עם זאת, כפי ריאגנטים ומכשירים מעבדות לקבל יותר ויותר לשתף את מומחיותם, השימוש במסכים RNAi בביולוגיה המודרנית נחשבים להגדיל בעתיד.

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>לקבלת מידע נוסף פנה לכתובת: rnai@sial.com</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרט איטום נושם</td><td>Corning</td><td>סרט איטום נושם, סטרילי (מוצר מס' 3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346&quot;&gt;אתנול&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof (מוחלט), לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347&quot;&gt;מלחים של פוספטים בבופר סלין (PBS)&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>BioReagent, ריכוז 10x, מתאים לתרבית תאים, לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348&quot;&gt;4&amp;#8242;6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>אבקה, BioReagent, מתאימה לתרבית תאים, &amp;gt;98% (HPLC ו-TLC)</td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349&quot;&gt;ריבונוקלאז A מלבלב בקר&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>עבור ביולוגיה מולקולרית, &amp;#8805;70 יחידות קוניץ/מג חלבון, אבקה ליופיליזית</td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350&quot;&gt;תמיסת בופר Tris-EDTA&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100x, לביולוגיה מולקולרית</td></tr></tbody></table>

המשימה esirna עבור הקרנת rnai בתאי יונקים

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

התערבות RNA (RNAi) הוא מנגנון בסיסי הסלולר לבקרה של ביטוי גנים. RNAi הוא המושרה על ידי פעמיים תקועים RNAs קצר הידוע גם בשם RNAs התערבות קטנה (siRNAs). קצר פעמיים תקועים RNAs מקורן יותר מבשרי גדילי כפול על ידי פעילות של דייסר, חלבון ממשפחת RNase III של endonucleases. שברי וכתוצאה מכך הם מרכיבים של RNA-Induced השתקה מורכבות (RISC), בהכוונת אותו mRNA המטרה מאותו מקור. RISC cleaves את ה-mRNA היעד ובכך להפחית את הביטוי של החלבון המקודד 1,2,3. RNAi הפכה שיטה ניסיונית עוצמה בשימוש נרחב עבור אובדן של מחקרים לתפקד גנים בתאי יונקים ניצול RNAs התערבות קטנה. כיום שתי שיטות עיקריות זמינים לייצור RNAs התערבות קטנה. שיטה אחת כרוכה סינתזה כימית, ואילו שיטה חלופית מעסיקה מחשוף endonucleolytic של יעד ספציפי פעמיים תקועים RNAs ארוך על ידי RNase III במבחנה. ובכך, בריכה מגוונת של siRNA כמו oligonucleotides מיוצר אשר ידוע גם בשם-siRNA endoribonuclease מוכן או esiRNA. השוואה של היעילות של siRNAs ו esiRNAs נגזרת כימית מראה מעורר הן עוצמה והשתקת מטרה גן. הבדלים עם זאת, ניתן לראות כאשר משווים סגוליות. רבים siRNAs מסונתז כימי יחיד לייצר בולטות מחוץ היעד תופעות, ואילו תערובת מורכבת הטמון esiRNAs מוביל מציאה ספציפי יותר 10. במחקר זה, אנו מציגים את העיצוב של הגנום בקנה מידה esiRNA ספריות המשימה וניצול שלו להקרנה RNAi לידי ביטוי במסך ה-DNA תוכן לזיהוי גנים המעורבים התקדמות מחזור התא. אנחנו מראים איך לייעל את פרוטוקול transfection ואת assay להקרנה של תפוקה גבוהה. אנחנו גם מדגימים כיצד נתונים גדולים מגדיר ניתן להעריך סטטיסטית ולהציג שיטות לאימות להיטים העיקרי. לבסוף, אנחנו נותנים נקודות מוצא פוטנציאל אפיונים תפקודית נוספת של להיטים תוקף.

כאן אנו להשתמש בספריית esiRNA האדם המסך תפוקה גבוהה עבור גנים המעורבים חלוקת התא. אנו מדגימים כיצד להקים ולנהל מסכי esiRNA, וכן כיצד לנתח ולאמת את התוצאות.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

הפרעה של RNA (RNAi) היא מנגנון תאי בסיסי לבקרת ביטוי גנים. RNAi מושרה על ידי מולקולות RNA קצרות דו-גדיליות, המכונה גם...

סריקה של גנים הקשורים למחזור התא באמצעות RNAi מתחילה בבחירת משימת טכנולוגיית knockdown מתאימה. ספריות RNA של Sigma Aldridge מנצלות את היעילות והספציפיות הגבוהה של siRNA המוכן על ידי אנדו-ריבנוקליאז. ספריות RNA הן מאגרים מורכבים של siRNA בודדים, המוכנים על ידי עיכול אנזימטי של RNA דו-גדילי ארוך, המשליים ל-mRNA המטרה. איחוד של siRNA המכוונים לאותו תמליל מגביר את הספציפיות, ומונע את החיפוש המפרך אחר siRNA בודדים יעילים וספציפיים.מאפיינים אלו הופכים את ה-RNA הקל למתאים במיוחד לסריקות של אובדן תפקוד (loss of function) בקנה מידה גדול ובינוני. כאן אנו מציגים את השלבים הדרושים לביצוע סריקת RNA רחבת היקף בעין, החל מהקמת תהליך טרנספקציה בעלת תפוקה גבוהה ועד לפיתוח בדיקה (assay) מתאימה. הדבר מודגם באמצעות הקמת סריקה של גנים המעורבים בהתקדמות מחזור התא של יונקים.ראשית, נראה כיצד לבצע טרנספקציה של תאי hila כפי שעברה אופטימיזציה, ולאחריה הערכה סטטיסטית של איכות הבדיקה. לבסוף, מבוצע סריקה בקנה מידה גנומי המודדת את התפלגות מחזור התא לאחר דילול הגן מטרה. הפגיעות (hits) נבחרות באמצעות הסטטיסטיקה zco ומאומתות על ידי easy RNAs עצמאיים משניים.בנוסף, אנו משרטטים פרוצדורות ניסיוניות פוטנציאליות שניתן להשתמש בהן כמעקב אחר סריקת ה-RNA של העין. היי, אני Ty ממכון Max Plank לביולוגיה של תאים מולקולרית וגנטיקה. וגם טריסטן.אני פרנק אל, גם אני ממכון מקס פלנק בדרזדן. היום נדגים לכם פרוצדורה להקמת סריקת אובדן תפקוד (loss of function screen) בתאים של יונקים תוך שימוש ב-mission easy RNAs מבית Sigma Aldridge. נשתמש במבחן למדידת התפלגות מחזור התא באוכלוסייה של תאי תרבית רקמה כדוגמה להדגמת האופן שבו ניתן לקשור גנים לתהליכים ביולוגיים באמצעות סריקת RNAi.בואו נתחיל. כל פרויקט סריקת RNAi מתחיל בבחירה של טריגרים להשתקה, תוך שימוש ב-siRNAs המוכנים על ידי אנדו-ריבנוקלאז, או ב-siRNAs בקיצור, הנוצרים על ידי עיכול אנזימטי מוגבל של RNA דו-גדילי ארוך באמצעות RNase 3. כל siRNA מאומת באשר לזהותו באמצעות ריצוף ובאשר לטוהרו באמצעות אנליזת Caliper LabChip.איחוד של siRNAs בודדים המכוונים כולם לאותו תמליל מגביר את הספציפיות, כיוון שכל siRNA במאגר חולק את אותו מטרה (on target), בעוד שהשפעות המטרה הלא-ספציפיות (off-target effects) מדוללות. לכן, ל-easy RNAs יש יעילות השתקה טובה וספציפיות גבוהה למטרה, תוך הימנעות מהשפעות off-target. קנה מידה גנומי easy.ספריות RNA מסופקות על ידי Sigma Aldrich. בלוחיות עם 384 בארות, בארות השוליים נשארות ריקות. בנוסף, שמונה מיקומים במרכז הלוחית נשארים ריקים עבור בקרות.ספריות משניות של easy RNAs מסופקות בלוחיות עם 96 בארות שכולן מאוכלסות כאן; הלקוחות יכולים להחליט כיצד יסודרו ה-easy RNAs בלוחיות אלו. easy RNAs בודדים מסופקים במבחנות בודדות. טרנספקציה של easy RNA דורשת אופטימיזציה עבור ריאגנטים שונים לטרנספקציה וסוגי תאים שונים.כאן תאים תרביתו לפי פרוטוקולים סטנדרטיים ונעשה שימוש ב-oligo כחומר transfection. השתמש ב-EEG five E-Z-R-N-A-A kinesin motor protein, הדרוש להרכבת כישורה דו-קוטבית (bipolar spindle), כביקורת חיובית וב-ran luciferase easy RNA כביקורת שלילית. בלוחית 384 בארות, בצע טיטרציה של כמויות שונות של easy RNA, למשל, מ-1 nanogram ועד 56 nanograms בתוספת של 5 nanograms, וכמויות עולות של חומר transfection מ-0.1 µL ועד 0.9 µL בתוספת של 0.05 µL.לאחר ערבוב ה-RNA וסוכן הטרנספקציה, הוסיפו את התאים והדגירו למשך 48 שעות. עם סיום תקופת ההדגירה, בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ אור. ספרו את התאים שעברו טרנספקציה עם eeg.חמישה RNA קלים המראים צורה עגולה המעידה על מיטוזה. כמו כן, ספרו את המספר הכולל של תאים שעברו טרנספקציה עם בקרת שלילה. לוקיפראז ונילה פשוטה RNA קל.תנאי הטרנספקציה האופטימליים מראים את הרעילות הנמוכה ביותר עבור vanilla luciferase ואת הפנוטיפ הבולט ביותר עבור EEG five. כעת, לאחר שפרמטרי הטרנספקציה עברו אופטימיזציה, ניתן להמשיך להקמה ולסריקה ראשונית. תחנות פיפוט אוטומטיות כגון Matrix Wellm Mate או Tecan Aquarius המשמשות להכנת הסריקות הראשוניות צריכות להיות ממוקמות תחת מCustomGlare זרימה למינרית כדי למנוע זיהום.יש לחטא את כל הרכיבים המשמשים לפני השימוש, באמצעות אוטוקלב במידת האפשר או על ידי ריסוס ב-75% ethanol לפני הסריקה. יש לאופטימיזציה של מכשירים אלו בהתאם לפרוטוקולי היצרן. יש לבצע אופטימיזציה לדיוק השפיפה עבור כל הרכיבים המשמשים בתחנת השפיפה האוטומטית, כיוון שפרמטרי השפיפה משתנים בהתאם לסוג התמיסה, לנפח ולסוג הפלטה.יש לחזור על אופטימיזציה זו עבור כל שלב בנפרד. בנוסף, יש לבצע אופטימיזציה לפרוטוקולי השטיפה כך שזיהום צולב בין באערים יימנע כאשר תחנות הפיפוט האוטומטיות יהיו מוכנות. בצע טרנספקציה לתאים בפורמט של 384 באערים תוך שימוש בתנאים המותמצים שנקבעו בעבר, כדי לוודא שלא נצפו השפעות מיקום.השתמשו ב-RNAs קלים עבור EEG five וב-luciferase vanilla בתבנית לסירוגין המכסה את כל הפלטה. השאירו את כל בארות הקצה ריקות, מכיוון שבעיה נפוצה בשימוש בפלטות רב-בארות היא אידוי מוגבר בבארות הקצה במהלך זמן האינקובציה. דבר זה מוביל לתנאים ניסיוניים שונים בבארות שונות, מה שמתבטא לעיתים קרובות באפקטים של מיקום הפלטה; כדי למזער עוד יותר את האידוי, השתמשו במחסומי אידוי כגון סרט כיסוי נושם של Corning.בנוסף, ודאו כי האינקובטורים נשמרים בלחות גבוהה. עם זאת, זכרו כי קיימים מקורות אפשריים לאפקטים של מיקום, כגון שונות בטיפול בנוזלים או במערכת הקריאה, כגון קורא לוחות (plate reader). לאחר דגירה של 48 שעות, קבעו את התאים באמצעות 100% ethanol קר מאוד (בטמפרטורת קרח) למשך שעתיים, ולאחר מכן בצעו רהידרציה ב-PBS למשך 15 דקות.צבע את התאים המקובעים למשך 25 דקות ב-PBS המכיל 1 µg/mL של DPI ו-100 µg/mL של RNAs. לבסוף, שטוף שלוש פעמים עם PBS ושמור בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, מדוד את עוצמת הפלורסצנציה של ה-DPI באמצעות מיקרוסקופיה.בכל מקרה נעשה שימוש במערכת סריקה של Olympus. נבחן את התאים ונקבע את עוצמת ה-DPI היחסית. נפיק היסטוגרמה על ידי שרטוט עוצמת ה-DPI אל מול מספר התאים על בסיס ההיסטוגרמה.העריכו את התפלגות מחזור התא על ידי חישוב אחוז התאים בעלי תכולת DNA של 2N עבור שלב G1/G0, בין 2N ל-4N עבור שלב S, 4N עבור שלב G2/M, וגדול מ-4N עבור אנאפלואידיה או פוליפלואידיה. כדי להעריך את הומוגניות התוצאות על פני הפלטה, השוו את התפלגות מחזור התא בין הבארות השונות על ידי השוואת אחוז התאים בשלב G2/M עבור התאים שעברו טרנספקציה של EEG5 ולוסיפראז. אם התוצאות נבדלות באופן משמעותי על פני הפלטה, נדרשת אופטימיזציה נוספת כדי לבטל השפעות מיקום. לאחר שווידאתם את עקביות התוצאות, חשבו את ההבדלים הסטטיסטיים בין הביקורות החיוביות לשליליות.השתמשו במשוואת ה-Z factor המוצגת כאן כדי לקבוע את המובהקות הסטטיסטית של התוצאות. SD מייצג סטיית תקן ו-AV מייצג ממוצע. Z factor שבין 1 ל-0.5 מעיד על הפרדה מובהקת סטטיסטית של הביקרות השליליות והרעש מהביקרות החיוביות.אם נקבע הבדל סטטיסטי כזה, ניתן להמשיך לסריקה הראשונית. הכין פלטות לתרבית רקמה של 384 בארות לטרנספקציה של RNAs קלים, תוך שימוש בתנאים האופטימליים שנקבעו מראש כאן.15 nanograms של RNA קל לכל באר מומסים בחמישה µL של TE buffer. לפחות שמונה מיקומי ביקורת לכל פלטה נטענים עם ביקורות חיוביות ושליליות מתאימות לתהליך הביולוגי הנחקר כאן, EEG five ו-ranil luciferase.משתמשים ב-Easy RNAs כדי למנוע אפקטים של מיקום. את בארות השוליים ממלאים בחמישה מיקרוליטרים של TE buffer בלבד. לאחר מכן, מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של opti MEM המכיל 0.2 מיקרוליטרים של oligo לכל בארה, ומדגירים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר ערבוב ה-RNA עם ריאגנט הטרנספקציה, יש להוסיף כאן את תרחיף התאים. מוסיפים 40 µL מתרחיף תאי He R בריכוז של 25 תאים ל-µL, השקול ל-1000 תאים לבאר, ומדגירים למשך 72 שעות. לאחר דגירה של 72 שעות.מדוד את תכולת ה-DNA במיקרוסקופ אוטומטי כגון Olympus scan R כפי שהודגם בעבר. חזור על הליך זה עבור כל הפלטות של הספרייה לצורך בחירת פגיעות (hit selection). העריך את ערכי תכולת ה-DNA באמצעות סטטיסטיקת Z-score.שימו לב ש-Z-score אינו זהה ל-Z factor Z-score. הוא מספק מדד סטטיסטי למשמעות של ערך דגימה בהשוואה לבקרת שלילה או לבקרת דמי (mock control). הוא מחושב לפי המשוואה המוצגת כאן.חשבו את ה-zco עבור כל דגימות ה-RNA המקלות (easy RNA), תוך שימוש באות של בקרת הלוציפראז (luciferase) השלילית (vanilla) כנקודת ייחוס לבחירת הפגיעות (hits). יש להחיל סף מסוים. בדרך כלל, נעשה שימוש בקריטריון מובהקות של Z הגדול מ-2 או הקטן מ-2-. עם זאת, בהתאם לתהליך הביולוגי הנחקר או להיקף הסריקה, ניתן להחיל ספים שונים.ניתן להשתמש בשיטות הערכה מתמטיות מורכבות יותר, כגון ה-Q, לצורך בחירת פגיעות (hits). לאחר מכן, הפגיעות שנבחרו יעברו סינון משני ותיקוף HIIT. סינון משני של גני ה-HIIT שנבחרו יתבצע בעקבות הסינון הראשוני כדי לסנן תוצאות חיוביות שגויות הנובעות משונות ניסויית.ראשית, יש לאמת את הפגיעות (hits) שנבחרו באמצעות אותו הליך כפי שבוצע בסריקה הראשונית, למעט הגדרת הפגיעות עם מספר גבוה יותר של חזרות, בין שלוש לחמש, כדי לאפשר הערכה סטטיסטית טובה יותר. עבור הפגיעות המאושמות, השתמש באותה בדיקה ובאותו מדד (readout) כפי שבוצע בסריקה הראשונית, אך עם RNA משתיק (silencing trigger) קל שאינו חופף, או טריגר השתקה אחר שאינו חופף, כגון siRNA מסנתז כימית. לבסוף, יש לתקף את הגנים שנבחרו באמצעות השוואה בין מינים (cross-species).הצלה באמצעות RNAi היא תו התקן לאימות של פנוטיפים של RNAi הזמינים נכון להיום. בקצרה, כרומוזום מלאכותי חיידקי (BAC) המקודד עבור אורתולוג של הגן הנבחר ממין אחר, מוחדר באופן יציב לתאים. מבני BAC משמרים את הגן בהקשרו הגנומי ומאפשרים ביטוי קרוב למצב הפיזיולוגי.RNAi נגד הגן האנדוגני לא ישפיע על ביטוי הטרנסגן האורתולוגי, מה שיוביל להצלה של הפנוטיפ הנגרם מה-RNAi. לבסוף, המועמדים שעברו תיקוף נבחנו בפירוט רב יותר כדי להגיע להבנה מכניסטית. במקרים רבים, ניתן להשתמש ב-RNAi גם בבדיקות משניות ומורכבות יותר אלו.לדוגמה, מיקרוסקופיה בשיטת time-lapse של פנוטיפים של RNAi. להלן דוגמה לסריקת מחזור תא שבה נמדד תכולת ה-DNA של תאי HeLa לאחר knockdown של יותר מ-16,000 גנים מהגנום האנושי. זוהו 1,351 פגיעות ראשוניות (primary hits) שנמצאו כנדרשות לחלוקת התא.במסך המשני, 743 פגיעות (hits) אומתו באמצעות easy RNA trigger עצמאי משני תוך שימוש במערך בדיקה משני. השתקת גנים (Knockdowns) שהובילה לעצירה בשלב G2 הופרדה מהשתקות שהובילו לעצירה מיטוטית. לבסוף, ניסוי הצלה של RNA בעין חוצה-מינים עבור הגן Lin 54 שימש כדי לתקף את תפקידו בחלוקה תקינה של התאים.ניסויים נוספים בהמשך הראו כי התשבshen של Lin 54 שינתה את הביטוי של גנים רבים במחזור התא. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע טרנספקציה של mission easy RNAs בסביבה בעלת תפוקה גבוהה, ואת ניתוח התפלגות מחזור התא בקו תאי תרבית רקמה אנושי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שיש לאופטימיזציה של תנאי הטרנספקציה והבדיקות בנפרד עבור כל מערכת תאית וכל תהליך ביולוגי.השימוש במערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים מומלץ אך אינו הכרחי, במיוחד עבור סריקות בקנה מידה קטן. טיפול ידני הוא בר ביצוע אף הוא. זהו כל הפרוטוקול. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Reticulum endoplasmic ממלא תפקיד מרכזי ב biogenesis חלבון ו הומאוסטזיס הסידן. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו כתובת תפקידו של ערוצי Ca2 + לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המתרברבים שלהם. מערכת זו כוללת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca2 + הדמיה.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

כאן אנו להשתמש בספריית LentiPlex האנושי ונקווה המסורתית רצף שיטות לזיהוי מטרות הגן לקידום הישרדות התא. אנו מדגימים כיצד להגדיר deconvolute מסך LentiPlex ולאמת את התוצאות.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה...

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

צעד אחר צעד לפרוטוקול בידוד וזיהוי RNA מתחמים הקשורים באמצעות RIP שבב.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות להעברה יעילה של קווי תאי מקרופאגים של עכברים עם siRNAs באמצעות מערכת המעבורת Amaxa Nucleofector 96-well, לעורר את המקרופאגים עם ליפופוליסכריד ולנטר את ההשפעות על ייצור ציטוקינים דלקתיים.

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לבצע siRNA ממוקד מסך "ubiquitome" לזהות היוביקוויטין רומן ורגולטורים כמו היוביקוויטין של התגובה התאית בתיווך HIF1A להיפוקסיה. זה יכול להיות מותאם לכל מסלול ביולוגי שבו חזקה לקריאה מהפעילות העיתונאית היא זמינה.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

SINEUPs הם סינתטיים antisense ללא קידוד RNAs, אשר מכילים תחום הכריכה (BD), תחום אפקטור (אד) ו- up-לווסת את התרגום של יעד ה-mRNA. כאן, אנו מתארים שיטות איתור עבור SINEUPs של שורות תאים בתרבית, ניתוח של פעילותם קידום תרגום על ידי המערב-כתם של תפוקה גבוהה חצי אוטומטי מערכת הדמיה.

תא המבוסס על מבחני של SINEUP ללא קידוד RNAs זה במיוחד יכולה לשפר את התרגום mRNA

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

למד את שיטת esiRNA לסקרי RNAi בקנה מידה גדולה בתאי יונקים. מאמר זה מדגים אופטימיזציה של תנאי טרנספקציה, הערכה סטטיסטית ואימות תוצאות לזיהוי גנים המעורבים בחלוקת תאים.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

גלה סרטונים נוספים