Name: מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: למד הדמיה של מולקולה בודדת לחקירת מנגנוני תחבורה גרעינית. השיטה מאפשרת לעקוב אחר תנועת מולקולות דרך מרכיבי הנקבים הגרעיניים בתאי HeLa בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי שיפור יכולת המחקר גרנט (באולינג גרין סטייט).

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יש להקפיד על מנת להבטיח colocalization התקין של מולקולות NE חד במהלך הניסוי. חשוב גם לתת יחס אות לרעש גבוה, במיוחד כאשר האות הוא נמוך בשל תיוג עניים או photobleaching. דיוק לוקליזציה היא מוגבלת על ידי רעש רקע (הנובעים out-of-להתמקד הקרינה, רעש CCD readout, גורמים אחרים הנוכחי כהה).

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

השירות של מולקולה אחת הגישות פלואורסצנציה מיקרוסקופ הוכח להיות הצלחה גדולה בהבנת תגובות ביולוגיות בעשור האחרון. החקירה של אינטראקציות מולקולריות עם רזולוציות של זמן ומרחב גבוהה עמוק בתוך התאים נותר מאתגר בשל אותות חלשים מטבעם הנובעים מולקולות בודדות. עובד לאחרונה על ידי יאנג et al. הראו כי צר שדה מיקרוסקופיה epifluorescence מאפשר הדמיה של תחבורה nucleocytoplasmic ברמת מולקולה בודדת. לפי הגישה מולקולה בודדת, קינטיקה חשובים, כגון זמן תחבורה יעילות גרעיני, על מולקולות מטען אות תלויים ובלתי תלויים הושגו. כאן אנו תיאר פרוטוקול הגישה המתודולוגית עם רזולוציה spatiotemporal משופרת של 0.4 ms ו -12 ננומטר. ברזולוציה משופרת אפשרה לנו ללכוד תחבורה פעילה חולף ואירועים דיפוזיה סבילה דרך מתחמי נקבוביות הגרעין (NPC) למחצה תאים שלמים. אנו מצפים כי בשיטה זו כדי לשמש הבהרת אירועים מחייב סחר אחרות בתוך התאים.

מיקרוסקופיה מולקולה בודדת approch סיפק תובנות הרומן לתוך התחבורה גרעיני.

הוכח כי התועלת של גישות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת היא רבה להבנת תגובות ביולוגיות לאורך ה...

מעטפת הגרעין של התא מכילה כ-2000 קומפלקסים של נקבי גרעין (nuclear PO complexes) המאפשרים מעבר של מולקולות מסיסות במים כגון RNA, ריבוזומים, חלבונים מסוימים, פחמימות ומולקולות סיגנל. על ידי הוספת מולקולות מטען מסומנות לתאים חדירים, ניתן להדגים את תנועתן של מולקולות בודדות דרך נקב הגרעין באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. דרושות תמונות Time-lapse כדי לקבוע את המיקום וכן מאפיינים מרחביים-זמניים כגון זמן הטרנספורט, יעילות הייבוא והייצוא ותדירות הכניסה. שלום, אני אלכס, דוקטורנט מהמעבדה למיקרוסקופיית מולקולה בודדת במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת Bowling Green State.אני אשה פ' שמה, סטודנטית לתואר שני גם אני ממעבדת המיקרוסקופיה של מולקולה בודדת. אני ג'ומה. אני פוסט-דוקטורנטית כאן במעבדת המיקרוסקופיה של מולקולה בודדת.היום נציג בפניכם הליך של דימוי מולקולות בודדות של תעתוע גרעיני דרך קומפלקסי ה-NPC בתאי HeLa. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את התעתוק של מולקולות שונות דרך קומפלקס ה-NPC. בואו נתחיל.כדי להכין את החלבונים לניסוי הובלה גרעינית, גדלים באופן קונבנציונלי חיידקי E coli מזן JM 1 0 9 המבטאים את הגנים האחראים לייצור חלבוני המטען הגרעיני במצע LB ומבצעים השראה באמצעות IPTG. כאשר התאים נמצאים בשלב הלוגריטמי עם צפיפות אופטית של 0.7 עד 0.8, סובבים את התרבית ב-6, 000 ×g למשך 15 דקות בט

single-molecule-imaging-of-nuclear-transport

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

אנו מתארים הליך איתור אלמנטים כימיים נוכח באתרו בתוך התאים של האדם, כמו גם שלהם כימות במבחנה . השיטה הוא מתאים היטב לכל סוג התא, שימושי במיוחד עבור בדיקות כימיות כמותית של תאים בודדים בעקבות במבחנה חשיפה חלקיקי תחמוצת מתכת.

בחיי עיר זיהוי, כימות תא בודד של תחמוצת מתכת חלקיקים באמצעות ניתוח Microprobe גרעיני

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

אנו מתארים שיטות פוטואקטיביות פלואורסצינטיות כדי לנתח את ההובלה האקסונלית של neurofilaments באקסונים מינרטיים בודדים של עצבים היקפיים מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון neurofilament פוטואקטיבי.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

פרוטוקול זה מתאר כיצד להגדיר ולבצע ביעילות ניתוחים אוטומטיים של נתוני הדמיה של תאים חיים המתקבלים ממעקב אחר ההובלה הנוקליאוציטופלזמית באמצעות כלים אופטוגנטיים.

שימוש בכלים אופטוגנטיים של LEXY ו-LINuS וניתוח תמונות אוטומטי כדי לכמת דינמיקת הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים

פרוטוקול זה מציע תהליך עבודה יעיל להדמיית מיקרוסקופיה בלוקליזציה בודדת של גרעיני ארבידופסיס מבודדים, תוך שימוש בבידוד, קיבוע ותיוג אופטימליים להשגת ויזואליזציה ננומטרית אמינה של כרומטין ו-RNA פולימראז II. גישה זו ניתנת להתאמה קלה לחלבונים אחרים הקשורים לכרומטין או לשינויים בהיסטונים להדמיה ברזולוציה גבוהה.

פרוטוקול יעיל למיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת בגרעעיני ארבידופסיס

חלבון ממברנה פונקציה מוסדר על ידי הרכב קרום התא השומנים. זה וידאו המאמר מפרט כיצד ליצור תיקון באמצעות אלקטרודות תיקון bilayer, כמו גם כיצד להשתמש ערוצי gramicidin כמו כתבים של תכונות הממברנה משתנה.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

למד הדמיה של מולקולה בודדת לחקירת מנגנוני תחבורה גרעינית. השיטה מאפשרת לעקוב אחר תנועת מולקולות דרך מרכיבי הנקבים הגרעיניים בתאי HeLa בזמן אמת.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

גלה סרטונים נוספים