Name: מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: למד הדמיה של מולקולה בודדת לחקירת מנגנוני תחבורה גרעינית. השיטה מאפשרת לעקוב אחר תנועת מולקולות דרך מרכיבי הנקבים הגרעיניים בתאי HeLa בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי שיפור יכולת המחקר גרנט (באולינג גרין סטייט).

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יש להקפיד על מנת להבטיח colocalization התקין של מולקולות NE חד במהלך הניסוי. חשוב גם לתת יחס אות לרעש גבוה, במיוחד כאשר האות הוא נמוך בשל תיוג עניים או photobleaching. דיוק לוקליזציה היא מוגבלת על ידי רעש רקע (הנובעים out-of-להתמקד הקרינה, רעש CCD readout, גורמים אחרים הנוכחי כהה).

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

השירות של מולקולה אחת הגישות פלואורסצנציה מיקרוסקופ הוכח להיות הצלחה גדולה בהבנת תגובות ביולוגיות בעשור האחרון. החקירה של אינטראקציות מולקולריות עם רזולוציות של זמן ומרחב גבוהה עמוק בתוך התאים נותר מאתגר בשל אותות חלשים מטבעם הנובעים מולקולות בודדות. עובד לאחרונה על ידי יאנג et al. הראו כי צר שדה מיקרוסקופיה epifluorescence מאפשר הדמיה של תחבורה nucleocytoplasmic ברמת מולקולה בודדת. לפי הגישה מולקולה בודדת, קינטיקה חשובים, כגון זמן תחבורה יעילות גרעיני, על מולקולות מטען אות תלויים ובלתי תלויים הושגו. כאן אנו תיאר פרוטוקול הגישה המתודולוגית עם רזולוציה spatiotemporal משופרת של 0.4 ms ו -12 ננומטר. ברזולוציה משופרת אפשרה לנו ללכוד תחבורה פעילה חולף ואירועים דיפוזיה סבילה דרך מתחמי נקבוביות הגרעין (NPC) למחצה תאים שלמים. אנו מצפים כי בשיטה זו כדי לשמש הבהרת אירועים מחייב סחר אחרות בתוך התאים.

מיקרוסקופיה מולקולה בודדת approch סיפק תובנות הרומן לתוך התחבורה גרעיני.

הוכח כי התועלת של גישות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת היא רבה להבנת תגובות ביולוגיות לאורך ה...

מעטפת הגרעין של התא מכילה כ-2000 קומפלקסים של נקבי גרעין (nuclear PO complexes) המאפשרים מעבר של מולקולות מסיסות במים כגון RNA, ריבוזומים, חלבונים מסוימים, פחמימות ומולקולות סיגנל. על ידי הוספת מולקולות מטען מסומנות לתאים חדירים, ניתן להדגים את תנועתן של מולקולות בודדות דרך נקב הגרעין באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. דרושות תמונות Time-lapse כדי לקבוע את המיקום וכן מאפיינים מרחביים-זמניים כגון זמן הטרנספורט, יעילות הייבוא והייצוא ותדירות הכניסה. שלום, אני אלכס, דוקטורנט מהמעבדה למיקרוסקופיית מולקולה בודדת במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת Bowling Green State.אני אשה פ' שמה, סטודנטית לתואר שני גם אני ממעבדת המיקרוסקופיה של מולקולה בודדת. אני ג'ומה. אני פוסט-דוקטורנטית כאן במעבדת המיקרוסקופיה של מולקולה בודדת.היום נציג בפניכם הליך של דימוי מולקולות בודדות של תעתוע גרעיני דרך קומפלקסי ה-NPC בתאי HeLa. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את התעתוק של מולקולות שונות דרך קומפלקס ה-NPC. בואו נתחיל.כדי להכין את החלבונים לניסוי הובלה גרעינית, גדלים באופן קונבנציונלי חיידקי E coli מזן JM 1 0 9 המבטאים את הגנים האחראים לייצור חלבוני המטען הגרעיני במצע LB ומבצעים השראה באמצעות IPTG. כאשר התאים נמצאים בשלב הלוגריטמי עם צפיפות אופטית של 0.7 עד 0.8, סובבים את התרבית ב-6, 000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C, שופכים את הנוזל העליון ושוקלים את המשקע. לאחר מכן, מרחפים מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של Celtic B לגרם כדי למצות חלבון המתאים לטיהור באמצעות זיקה ולניתוח.בשלב הבא, יש להוסיף את הכמות המתאימה של תערובת פרוטאז (protease cocktail) ב-midsole DNAs one ו-beta me capto ethanol. ערבבו את התערובת בחושך על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה ב-25,000 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C.לאחר הסבוב, העבירו את הנוזל העליון לבקבוק חדש כהכנה לכרומטוגרפיה. העבירו 400 µL של nickel NTA ואצטון לארבעה מבחנות מיקרו-צנטריפוגה. סובבו ב-16,000 ×g למשך שלוש דקות.שפכו את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, הוסיפו 400 microliters של תמיסת שטיפה לליזה (lysis wash buffer). חזרו על שלבי השטיפה הקודמים שלוש פעמים לאחר השטיפה הסופית.שחזר את ה-nickel NTA בבופר ליזיס והוסף את כל ארבעת המבחנות לבקבוק המכיל את העלייה של התאים. ערבב לאט את התערובת שהתקבלה במיכל חשוך על קרח למשך 60 דקות תוך כדי ערבוב. הכן עמודת כרומטוגרפיה מסוג ecno pack על ידי עטיפתה בנייר אלומיניום כדי למנוע פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית) של חלבונים פלואורסצנטיים.הנח גם 12 מבחנות איסוף במעמד מתחת לעמוד. לאחר שהתערובת נערבבה במשך 60 דקות, טען 10 milliliters של תערובת SNA nickel NTA והמתן עד למעבר מלא שלה. התחל באיסוף פראקציות.בשלב הבא, הוסיפו 10 milliliters של lysis wash buffer. המתינו עד למעבר מלא של הנוזל. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של IZO buffer והמתינו למעברו.המשיכו באיסוף הפראקציות. לאחר מכן, העבירו 0.5 milliliters של בופר אלוציה (elution buffer) והמשיכו להזרים בופר אלוציה עד להשלמת איסוף כל 12 הפראקציות. כדי לקבוע באיזו פראקציה נמצא הריכוז הגבוה ביותר של החלבון, הריצו ארבע microliters מכל פראקציה על ג'ל PAGE ובצעו צביעת Coomassie.בהתאם לנוהלים הסטנדרטיים, יש לאחד את הפראקציות המרוכזות ביותר ולהוסיף 500 µL למסנן nano step בעל גודל נקבוביות של 10 kDa אשר נשטף מראש עם באפר אלוציה. יש לרכז את החלבון על ידי סבוב ב-16,000 ×g למשך חמש דקות. יש להסיר את הבאפר, לערבב את פראקציית החלבון שנותרה ולהוסיף 500 µL נוספים לצנטריפוגת הסינון.חזור שוב על הפעולה עבור כל הפראקציות שנבחרו. לאחר מכן, הבא את הנפח הסופי של החלבון המרוכז לכ- 50 µL באמצעות בופר אלוציה. לאחר מכן, תוך כדי ערבוב עדין באמצעות מיקרו-פיפט המלקט מהפני השטח של המסנן, המשך להעביר את הדגימה בעמודי חילוף יונים וסינון לפי גודל (size exclusion) כדי לקבל חלבון בדרגת ניקיון גבוהה מאוד, וקבע את ריכוז החלבון הסופי.בשלב הבא, סמנו את מולקולות המטען באמצעות עודף של צבע אורגני ריאקטיבי מסייע כגון Alexa 555 או Alexa 647. פעולה זו נדרשת מכיוון שלא ניתן להשתמש בפלואורסצנציה הירוקה הפנימית של GFP עבור דימוי של מולקולה בודדת של תעתוק גרעיני, וזאת בשל יציבות פוטו-כימית נמוכה וספקטרום החופף לאוטופלואורסצנציה של התא. יש לחלק את החלבון המסומן למספר מנות של 25 µL ולאחסנם בטמפרטורה של 80°C- יום אחד לפני הניסויים. הניחו כיסוי זכוכית שעבר עיקור באוטוקלאב בתוך צלחת פטרי סטרילית של 35 mm וטפטפו עליו באמצעות פיפטה 9 mL של DMEM.בשלב הבא, העבירו בפיפטה 1 mL של תרבית תאים וטפטפו אותה באופן אחיד על לביש התכסית. התאים שבהם נעשה שימוש הונדסו גנטית מראש כדי לבטא חלבון ממברנה חיצוני שסומן ב-GFP. POM 1 21, הניחו את הצלחות באינקובטור פחמן דו-חמצני למשך 12 שעות.ביום הניסוי, התחילו בהכנת תאי הזרימה. לאחר מכן, הוציאו את השקופית המצופה בתאים מהאינקובטור, ייבשו את השקופית, ולאחר מכן חברו אותה באמצעות דבק גריז ואקום. במסגרת אלומיניום שיוצרה במעבדה, חיוני לוודא שהתאים לא יתייבשו במהלך ההכנה.באמצעות מזרק פלסטיק של 10 milliliter, יש להוסיף שני קווי סיליקון משני צדדיו של לבישת זכוכית (cover slip) בעזרת פינצטה. יש להרים את לבישת הזכוכית המוכנה עם שני קווי הסיליקון ולהניח אותה הפוכה על גבי השקופית המצופה בתאים, וללחוץ קלות כדי ליצור את תא הזרימה (flow chamber). אם מוכנים שני תאים נפרדים על שקופית אחת מצופה בתאים, חיוני להבטיח איטום טוב כדי למנוע זיהום צולב.יש למרוח מספר קווי גריז סיליקון בין התאים, מהחלק העליון לחלק התחתון של העגלה, כדי לאטום אותם זה מזה. כמו כן, יש למרוח מספר קווי גריז על הדפנות החיצוניות של התאים. הוסף DMEM לתא הזרימה כדי למנוע מהתאים להתייבש.בשלב הבא, בעזרת מקלון צמר, שטפו את תחתית הזכוכית פעמיים עם מים ולאחר מכן פעמיים עם 100% ethanol. התקינו את המסגרת על המיקרוסקופ. שטפו פעמיים עם 25 µL של transport buffer על ידי הוספתו לתא הזרימה וספיגתו.באמצעות פיסת נייר סינון קטנה המונחת בצד היציאה, בצעו פרמיאביליזציה לתאים פעם אחת למשך כשתי דקות עם 25 µL של digitonin; יש לנטר את הפרמיאביליזציה בזמן אמת באמצעות brightfield. לבסוף, שטפו את התאים עם 25 µL של transport buffer, המועשר ב-1.5% polyvinyl pyrrolidone או PVP למניעת נפיחות אוסמוטית של הגרעינים. אתרו את התאים שעברו פרמיאביליזציה תחת המיקרוסקופ וזהו טבעת פלואורסצנטית ירוקה ובהירה.לאחר מכן, התמקד בקו המשווה של התא ודגום תמונה לפני הוספת מולקולות מטען פלואורסצנטיות. הסר כל פלואורסצנציה עצמית על ידי בחירת אזור המעטפת הגרעינית והארה באמצעות לייזר הליום-נאון של 633 nanometer עד להגעה לפוטו-بلیצ'ינג (photo bleaching) מלא. בדרך כלל, נדרשים למשך של למעלה משתי דקות.הוסף לתא הזרימה נפח של 25 µL של דגימת דקסטראן מסומנת המדוללת בבופר הובלה עם 1.5% PVP, והזרם אותה דרך התא באמצעות שימוש בפתיל של נייר סינון. יש לנקוט זהירות בעת הוספת חלבוני המטען המיובאים, התאים המאפשרים חדירה, שכן המיקוד עלול להיפגע בקלות מכל תנועה נמרצת. הפעל את הקיצוץ האופטי (optical chopper) בתדר של כחמישה הרץ כדי למנוע פוטו-בליצ'ינג (photobleaching) ולאפשר לחלק חדש של מולקולות בודדות שלא עברו פוטו-בליצ'ינג להתקרב למעטפת הגרעין.יש להקליט סדרת סרטונים של תעתוע מולקולות בודדות מיד לאחר הוספת מולקולות הדגימה, כדי שניתן יהיה ללכוד את התעתוק דרך קומפלקסי נקבוביות הגרעין. השתמש בלייזר הליום-ניאון ב-633 nanometer כדי להאיר את מסלולי ההובלה של המולקולות התעתקות, במידה שבוצע נכון. פרוטוקול זה מאפשר איסוף של סדרת תמונות המדגימות תעתוק של מולקולות מטען בודדות המקיימות אינטראקציה עם קומפלקס נקבוביות הגרעין.במסגרת זו, הוא השתמש בתאי Perme 1 21. על ידי מעקב אחר המסלולים המרחביים של מולקולות דקסטראן בודדות העוברות דיפוזיה, ניתן להבחין בשלבים העדינים של הדיפוזיה דרך המעטפת הגרעינית. כאן מוצג אירוע מעבר מהציטופלזמה לגרעין, שבו מולקולת דקסטראן בודדת, המופיעה כנקודה אדומה, התחילה בציטופלזמה, הגיבה עם המעטפת הגרעינית המופיעה כקו פיקסלים ירוק, והגיעה לסופה כאן בתוך הגרעין.מולקולת הדקסטראן החלה בציטופלזמה, הגיבה עם המעטפת הגרעינית וחזרה אל הציטופלזמה. בדוגמה זו, מולקולת הדקסטראן החלה בגרעין, הגיבה עם המעטפת הגרעינית וחזרה אל הגרעין. וכאן מולקולת הדקסטראן החלה בגרעין, הגיבה עם המעטפת הגרעינית וסיימה בציטופלזמה.על ידי מעקב אחר המסלולים המרחביים של מולקולות דקסטראן בודדות החודרות פנימה, ניתן להבחין בשלבים העדינים של הדיפוזיה דרך המעטפת הגרעינית. מסלולי האירוע המוצגים כקווים כחולים ונקודות פתוחות נקבעו והונחו על גבי המעטפת הגרעינית המוצגת כקו שחור. הקווים הירוקים והאדומים מייצגים מרחק של 100 nanometer מהמעטפת הגרעינית בצד הציטופלזמי ובצד הגרעיני.הראינו לכם כעת כיצד להדגים ויזואלית את התעתוק של מולקולות בודדות דרך קומפלקס הנקבים הגרעיני ברזולוציה של 10 nanometer ב-400 microseconds. במהלך הליך זה, חשוב לזכור את הצורך להשיג יחס אות לרעש מרבי, וכן להיות זהירים מאוד בעת ביצוע ניסוי המולקולה הבודדת כיוון שהמיקוד עלול להשתבש בקלות. זהו כל התהליך.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

single-molecule-imaging-of-nuclear-transport

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

אנו מתארים הליך איתור אלמנטים כימיים נוכח באתרו בתוך התאים של האדם, כמו גם שלהם כימות במבחנה . השיטה הוא מתאים היטב לכל סוג התא, שימושי במיוחד עבור בדיקות כימיות כמותית של תאים בודדים בעקבות במבחנה חשיפה חלקיקי תחמוצת מתכת.

בחיי עיר זיהוי, כימות תא בודד של תחמוצת מתכת חלקיקים באמצעות ניתוח Microprobe גרעיני

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

אנו מתארים שיטות פוטואקטיביות פלואורסצינטיות כדי לנתח את ההובלה האקסונלית של neurofilaments באקסונים מינרטיים בודדים של עצבים היקפיים מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון neurofilament פוטואקטיבי.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

פרוטוקול זה מתאר כיצד להגדיר ולבצע ביעילות ניתוחים אוטומטיים של נתוני הדמיה של תאים חיים המתקבלים ממעקב אחר ההובלה הנוקליאוציטופלזמית באמצעות כלים אופטוגנטיים.

שימוש בכלים אופטוגנטיים של LEXY ו-LINuS וניתוח תמונות אוטומטי כדי לכמת דינמיקת הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים

פרוטוקול זה מציע תהליך עבודה יעיל להדמיית מיקרוסקופיה בלוקליזציה בודדת של גרעיני ארבידופסיס מבודדים, תוך שימוש בבידוד, קיבוע ותיוג אופטימליים להשגת ויזואליזציה ננומטרית אמינה של כרומטין ו-RNA פולימראז II. גישה זו ניתנת להתאמה קלה לחלבונים אחרים הקשורים לכרומטין או לשינויים בהיסטונים להדמיה ברזולוציה גבוהה.

פרוטוקול יעיל למיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת בגרעעיני ארבידופסיס

חלבון ממברנה פונקציה מוסדר על ידי הרכב קרום התא השומנים. זה וידאו המאמר מפרט כיצד ליצור תיקון באמצעות אלקטרודות תיקון bilayer, כמו גם כיצד להשתמש ערוצי gramicidin כמו כתבים של תכונות הממברנה משתנה.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

למד הדמיה של מולקולה בודדת לחקירת מנגנוני תחבורה גרעינית. השיטה מאפשרת לעקוב אחר תנועת מולקולות דרך מרכיבי הנקבים הגרעיניים בתאי HeLa בזמן אמת.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

גלה סרטונים נוספים