Name: Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-04T17:32:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: למדו ליצור מודל של פגיעה כליות חריפה בזברה דגונית באמצעות מיקרו-הזרקה תוך ורידית של גנטמיצין. השיטה כוללת צביעת אימונוהיסטוכימיה להדמיית נזק לשלפוחיות כליות וניתוח מבני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי המוסד האמריקני הלאומי לבריאות (NIH) מענקים R01DK069403 ו P30DK079307.

<ol><li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li>
<li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li>
<li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gridlock%2C+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University Oregon Press. Oregon. (1993).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

במאמר זה הראינו וידאו טכניקה microinjection תוך ורידי עבור דגם AKI, על ידי יצירת נזק בתיווך גנטמיצין צינורי הפרוקסימלי של הזחלים דג הזברה. פגיעה זו גורמת להיווצרות של קרום הלב ו / או בצקת חמורה, המשקפת חוסר יכולת לווסת את מאזן המים. אנחנו גם תיאר ניסוי אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן אשר סימוני tubules כליות הבדיל (Majumdar et al. 2000), מראה הפסד של קוטביות התא שיבוש אבובית הפרוקסימלית בכליות פגום. Microinjections תוך ורידי מייצגים שיטה יעילה לאספקת חומר מסיס למחזור הדם של הזחלים דג הזברה. טכניקה זו היא כלי מצוין עבור כניסתה של מגוון רחב של חומרים בעזרת זריקות אחיד פלורסנט סמן ניתן לחזור פעמים רבות ומאפשר תוצאות עקביות.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;6F נוגדן מונוקלונלי לעכבר </td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחזיק בלוקים EBH-2</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>קפילריות זכוכית בורוסיליקט</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-6</td><td></td></tr><tr><td>צינוריות קפילריות R-6 זכוכית בהתאמה אישית </td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3000</td><td></td></tr><tr><td>אבקת קטליזטור</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618</td><td></td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>155-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>ריס</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין סולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8648</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית 4ml</td><td>Weathon</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>לוח ברזל</td><td>Narishige International</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת שימור JB-4 A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת שימור JB-4 B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור עם ג'ויסטיק</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>Narishige International</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מיקרו-מזרק ידנית</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר להזרקה מיקרוסקופית</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Shandon Finesse</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי, קל</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-1</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת פיפטות</td><td>Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>מגש כוסות עיצוב מפלסטיק</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16643A</td><td></td></tr><tr><td>להב תער</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>מחמם סליידים</td><td>Labline Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרומטר לבמה </td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>בסיס נטיה</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TB 1</td><td></td></tr><tr><td>אבקת טריקאין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td></tr></tbody></table>

microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

במאמר זה אנו מתארים וידאו דגם דג הזברה של AKI באמצעות גנטמיצין כמו nephrotoxicant. טכניקה מורכבת microinjections תוך ורידי על דג הזברה 2 DPF. טכניקה זו מהווה שיטה יעילה ומהירה כדי לספק חומרים מסיסים למחזור הדם של הזחלים דג הזברה, ומאפשר הזרקה של דגים 15-20 לשעה. בנוסף AKI מחקרים, טכניקה זו microinjection יכול לשמש גם עבור סוגים אחרים של מחקרים ניסיוניים כגון אנגיוגרפיה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט של הטכניקה מציוד נדרש אמצעים החזותיים של ירידה בתפקוד הכליות. בנוסף, אנחנו גם מדגימים את תהליך, אימונוהיסטוכימיה קיבעון הר שלם עם סמן כליה אבובית, הטבעה פלסטיק חתך של דג הזברה הזחל. אנו מראים כי הזחלים דג הזברה הוזרקו גנטמיצין להראות תכונות מורפולוגיות בקנה אחד עם AKI: בצקות, אובדן הקוטביות בתא הפרוקסימלי לתאי האפיתל צינורי, והפרעה המורפולוגי של אבובית.

אנו מתארים טכניקה של microinjecting aminoglycoside, גנטמיצין, תוך 2 ימים שלאחר fetilization (DPF) הזחלים דג הזברה לגרום לפציעה כליות חריפה (AKI). כמו כן, אנו מתארים שיטה אימונוהיסטוכימיה הר שלמה, פלסטיק הטבעה ואת חתך של הזחלים דג הזברה לדמיין את הנזק בתיווך AKI.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

במאמר וידאו זה אנו מתארים מודל של פגיעה כלייתית חריפה (AKI) בדגי zebrafish, תוך שימוש ב-gentamicin כחומר נפרוטוקסי. הטכניקה כוללת מיקרו-הזרקות תוורידיות...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מודל של פגיעה כלייתית חריפה בדגי זהב (zebrafish) באמצעות הגליקוזיד AMG גנטמיצין (Gentamicin) כנפרוטוקסין. הדבר מושג תחילה על ידי הזרקת גנטמיצין לווריד הקרדינלי המשותף של זחלי דגי זהב יומיים לאחר ההפריה. השלב השני של ההליך הוא דירוג של פנוטיפ emus בזחלים שהוזרקו ארבעה ימים לאחר ההפריה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא עיבוד של דגי zebrafish ארבעה ימים לאחר ההפריה לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדן ל-kidney tubule epithelium am. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא חיתוך של הזברופיש, הלרוות, והדמיה של צינוריות פגומות עקב אובדן קוטביות התאים ושיבוש של מבנה הצינורית. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות מקטעים פגומים של צינוריות הכליה באמצעות אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן לאפיתל הכליה.שלום, אני קרלה סן קוסטנטינו ממעבדתו של ניל הארי במחלקה לביולוגיה התפתחותית באוניברסיטת פיטסבורג. היום נדגים לכם הליך להזרקה מיקרוסקופית של האמינוגליקוזיד Gentamycin לתוך זחלי דגי זברה יומיים לאחר ההפריה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להשרות פגיעה כלייתית חריפה בזחלי דגי זברה.בואו נתחיל. התחילו בהרביית דגי זברה בוגרים שלושה לילות לפני הניסוי המתוכנן. כדי להגיע לשלב העוברים ביום השני לאחר ההפריה, הכינו מצע E3 המכיל 5 mM sodium chloride, 0.17 mM potassium chloride, 0.33 mM calcium chloride ו-0.33 mM magnesium sulfate; אספו את העוברים והניחו אותם בצלחת פטרי עם מים של E3 מחוממים בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 28.5 °C.הסיר כל עובר מת מהצלחת הפטרי בסיום היום הראשון. חלק את העוברים כך שיהיו 80 עד 100 עוברים לכל צלחת פטרי. הכן מחטי הזרקה מזכוכית על ידי מתיחת צינורות קפילריים לקוטר סופי של כ-10 עד 20 מיקרון באמצעות מושך אלקטרודות.לאחר המתיחה, הניחו את הקפילרה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי והשתמשו בסרגל כדי לסמן בערך עשרה קווים של 1 mm לאורך המחט בעזרת טוש קבוע. אחסנו את המחטים בצלחת פטרי גדולה על גבי משענות חימר. לאחר מכן, הכינו את פיפטת ההחזקה באמצעות חשיפה ללהבה.ליטוש קצה של קפילרה מזכוכית בורוסיליקט דקה. החזק את הקפילרה באמצעות פינצטה ארוכה וחמם את קצה הקפילרה על ידי הצבתו באופן אנכי מעל החרוט הפנימי התכלת של הלהבה למשך שנייה אחת עד שתיים. גלגל את הקפילרה כדי להשיג התכה אחידה.חזור על פעולה זו מספר פעמים, ולאחר מכן בחן את הקפילרה תחת מיקרומטר של במה. קוטרה של הקפילרה צריך להיות 0.4 עד 0.5 millimeters. לאחר הכנת הקפילרות והתושבות, מלא את משאבת מיקרו-מזרק הידנית בשמן מינרלי בהתאם להוראות היצרן.הכנס את מחזיק הפיפטה למניפולטור ג'ויסטיק המחובר באמצעות מעמד מגנטי ללוח ברזל. הכן 20 µL של תערובת הזרקת הנפרוטוקסין: 2.4 nL של Gentamicin ו-17.6 nL של Lucifer yellow dextran עבור קבוצת הביקורת (control rva).הג'נטמיצין מוחלף בתמיסת סליין. הכין שתי צלחות פטרי בקוטר 30 מילימטר עם 2 מיליליטר של שמן מינרלי ליד מיקרוסקופ ההזרקה, לצורך הנחת התערובות הנפרוטוקסיות ותערובת הביקורת לפני ההזרקה. הכן את חומר ההרדמה על ידי המסה של 400 מיליגרם אבקת trica ב-97.7 מיליליטר של מים מזוקקים פעמיים וב-2.1 מיליליטר של triss בריכוז one molar, תוך כיוון ה-pH ל-7.אחסן תמיסת מלאי זו במקפיא בנפח של 4.2 milliliters. כדי להשתמש ב-trica כחומר הרדמה, דלל את תמיסת המלאי של trica בריכוז 4.2 milliliter ב-100 milliliters של E three והשאר אותה בטמפרטורת החדר. כדי להכין את הזחלים להזרקה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, הסר ידנית את ה-coons באמצעות פינצטה עדינה. הרדם את זחלי דג הזברה על ידי העברתם לצחנת פטרי עם trica שחוממה לטמפרטורת החדר.יש לחשוף זחלי דגי זברה ל-trica למשך 15 דקות לפחות. לפני תחילת המיקרו-הזרקות, פתחו את קצה מחט ההזרקה באמצעות להב תער. החזיקו את הלהב בזווית קלה כדי ליצור שיפוע (bevel) וחתכו את הקצה כך שיתקבל פתח קצה בקוטר של כ-10 עד 20 מיקרון.הפעל את אספקת החשמל והאוויר עבור מכשיר המיקרו-הזרקה. הכנס את המחט למחזיק המחטים. מלא את המחט על ידי הנחת טיפה של 10 µL מתמיסת ההזרקה בתוך צלחת פטרי מלאה בשמן.תחת המיקרוסקופ, הפעילו את משאבת הפיקו הידנית ובצעו שטיפה ראשונית (sub burge) לקצה המחט. בתוך הטיפה, הגדירו את משאבת הפיקו למצב שחרור (vent) כדי למלא את המחט. פעולה זו תימשך מספר דקות.אם התמיסה נעה לתוך המחט במהירות רבה מדי, קוטר הקצה גדול מדי וההזרקות לא יהיו מדויקות. לאחר מילוי המחט, הגדירו את משאבת ה-pico למצב hold כדי לכייל את המחט, והעבירו את מתג משאבת ה-pico למצב gated. לחצו על דוושת הרגל כדי לפרוק את המחט ורשמו את הזמן הדרוש בשניות למניסקוס לעבור מסימון של מילימטר אחד לסימון הבא; חזרו על הפעולה שלוש פעמים וחלקו את הזמן הממוצע ב-30, שהוא הנפח בננוליטרים המתאים למרחק קווי של מילימטר אחד, ובכך השגיחו את מספר המילישניות הדרושים להזרקת ננוליטר אחד של תמיסה.כוון את כפתור תקופת הטווח (range period) למספר זה והעבר את מתג זמן השער (gated time) למצב timed. כעת משאבת הפולס מוגדרת לספק פולס של 1 nanoliter מהתמיסה. לאחר מכן, מקם את פטריית הפטרי עם הלרווה תחת המיקרוסקופ.קבצו את הזחלים במרכז צלחת הפטרי וכוונו את המיקרוסקופ. הניחו את פיפט ההחזקה במשאבת המיקרו-מזרק הידנית בצד opposite למיקרו-מזרק, והקדימו את קצהו אל צלחת הפטרי למישור המוקד של המיקרוסקופ. כופפו אותו בזווית רדודה למדי, כך שקצהו של פיפט ההחזקה נוגע בתחתית צלחת הפטרי ונמצא במצב קרוב לאופקי.שנו להגדלה גבוהה יותר במיקרוסקופ והשתמשו בריס למסננת דקיקה במיוחד עם ידית. מקמו את זברויש (zebra fish) בשלב הזחוח כך שגבו פונה כלפי מטה והחלמון קרוב מאוד לפיפט התמיכה. סובבו את בורג המיקרומטר השולט במשאבת המזרק המיקרוסקופית הידנית נגד כיוון השעון כדי להחזיק את זברויש בשלב הזחוח על ידי שאיבת החלמון לתוך פיפט התמיכה.יש להיזהר לא לסובב את המיקרומטר יתר על המידה, שכן החלמון עלול להתבקע. אם המיקרומטר נמשך עמוק מדי לתוך פיפטת ההחזקה, יש להתמקד בוריד הקרדינלי המשותף שנוצר, אשר שוכן מעל החלמון ממש מתחת לפרידרם (periderm), ומהווה אתר של זרימת דם גבוהה. באמצעות המיקרו-מניפולטור של מכשיר ההזרקה.הנח את המחט לתוך הווריד הקרדינלי המשותף (common cardinal vein) המתפתח. בדרך כלל יש צורך למשוך את המחט מעט אחורה לאחר ההחדרה, כיוון שהווריד הקרדינלי המשותף הוא שטחי מאוד. אם עורף הזחלים מוחזק כראוי באמצעות פיפטת האחיזה, הוא לא יסתובב בעת כניסת המחט.הזריקו ננוליטר אחד של תמיסה על ידי לחיצה על דוושת הרגל. לאחר מכן, שחררו את הזחלים מהפיפט של ההחזקה והחזירו אותם למים של הזחלים. כדי לוודא את הצלחת המיקרו-הזרקה, עקבו אחר נוכחות ה-Lucifer yellow dextran בלבם של זחלי דגי הזברה.תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ה-Lucifer yellow נשאר נראה במערכת הדם למשך כ-20 דקות; החזירו את הזחלים לתווך E3 טרי ארבעה ימים לאחר ההפריה. העבירו בין 10 ל-15 זחלי דגי זברה למבחנות זכוכית של 4 ml וקבעו אותם ב-1 ml של דנטורן למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. בצעו רהידרציה לזחלים בסדרת מהולות של מתנול ו-PBS בריכוזים של 25% ל-75%, 50% ל-50%, 25% ל-75% ו-100% PBS, תוך שאיבת התמיסה והוספת תמיסה חדשה לאותה המבחנה.מיליליטר אחד של תמיסה לכל מבחנה. 20 דקות בכל תמיסה. אין לחשוף את הזחלים לאוויר בשום שלב.השאירו תמיד כמות קטנה של תמיסה המכסה את הזחלים. בעת החלפת התמיסות, הסירו את ה-PBT והחליפו במילליטר אחד של תמיסת חסימה המורכבת מ-PBS עם 1% DMSO, 0.5% בין 20 10% סרום עיזים נורמלי למשך שלוש שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על שייקר. העבירו את הזחלים לשני מילליטר eph.הסר את הסרום החוסם והחלף אותו ב-300 µL של נוגדן ראשוני. נוגדן מונוקלונלי נתרן-אשלגן ב-TPS בדילול של 1:25, alpha six F supernat, ו-300 µL של תמיסת אינקובציה PBS עם 1% DMSO, 0.5% tween ו-2% נסיון עז normal goat serum למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C על מנער (mutator). הסר את הנוגדן הראשוני ושטוף שלוש פעמים, למשך 30 דקות בכל פעם, עם 1 mL של תמיסת אינקובציה בטמפרטורת החדר, תוך הנחה על מנער בכל שלב שטיפה.לאחר מכן, דגרו עם נוגדן שני המדולל ביחס של 1:500 בתמיסת דגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו שלוש פעמים למשך 30 דקות בכל פעם עם PBT, ובצעו דהידרטציה לזחלים באמצעות סדרת אתנול מדורגת בהשריה של 10 דקות לכל שלב. הכינו את תמיסת החדירה (infiltration solution) באמצעות 25 milliliters של תמיסת שיכון JB four embedding solution A ו-0.24 grams של זרז (catalyst) המומס למשך 20 עד 30 דקות. ניתן לשמור את התמיסה בטמפרטורה של 4 °C עד חודש ימים.הסר את ה-100% ethanol והחלף אותו בתמיסת חדירה של פלסטיק. הנח את המבחנות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על רוטטור ואפשר לתהליך החדירה להימשך כ-30 דקות, עד שהזחלים ישקעו לתחתית המבחנה. כדי להטמיע את הזחלים, הנח את מגש כוסות התבנית של הפלסטיק תחת מיקרוסקופ דיסקציה.העבירו את הzlarvae יחד עם כמות מספקת של תמיסת חדירה (infiltration solution) שתכסה אותם אל תוך הכוסות. את תוך הקיבוע הפלסטי מכינים בשפופרת פלסטיק קטנה. בדרך כלל מקבעים ארבעה עד חמישה zlarvae בכל פעם, תוך שימוש ב-zlarva אחת לכל כוס, ומכינים 5 mL של פלסטיק לקיבוע.הוסיפו 35 µL של JB-4, תמיסת שימור B, לכל מיליליטר של תמיסת חדירה (infiltration solution). ערבבו היטב באמצעות פיפטור למעלה ולמטה עם פסטת פלסטיק או פיפטה מספר פעמים כדי להבטיח ש-JB-4 יפולימריז בצורה תקינה. לאחר שהוכנו 5 mL של פלסטיק שימור, הסירו את פלסטיק החדירה מהדגימות העגולות באמצעות פיפטת פסטה. מלאו את הכוס בפלסטיק השימור; הפלסטיק חייב לגלוש מהכוס כדי להבטיח הצמדה טובה של מחזיק הבלוק לדגימה.לזיהוי צינוריות הכליות של דגי זברה, חתכים רוחביים הם המתאימים ביותר למטרה זו. יש להטמיע את הזחלים בצורה אנכית, כאשר הראש פונה כלפי מטה, בעזרת פינצטה דקה או ריס עם ידית.מקמו את ה larvae בצורה אנכית מדי פעם, עד שהפלסטיק יהיה קשיח מספיק כדי שהם לא יזוזו ממיקומם. תהליך זה אורך כ-20 עד 30 דקות. לאחר מכן, הניחו את מחזיק שני הבלוקים של ה-EVH מעל הכוסות והשאירו את המגש בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה עד להשלמת הפולימריזציה.מקם את הדגימה במחזיק הדגימות (chuck holder) של המיקרוטום והגדר את מחמם השקופיות ל-45 °C. שפוך מים דה-יוניים לתוך כלי כימי (beaker) והנח אותו סמוך למיקרוטום לפני ביצוע החיתוך. ודא שהבלוק מכוון כך שניתן יהיה להוציא חיתוכים רוחביים מושלמים של הזחלים.ניתן לסובב את ידיות הכוונון של ראש האוריינטציה כדי למקם את הדגימה. בצעו חיתוך של חתכים עבים דרך הראש. כוונו את הבלוקים כך שיילקחו חתכים שוויים של העיניים עבור כל זחלי.כאשר הסנפירים החזיים מופיעים בחתכים, זהו השלב שבו מתחילים הצינורות הפרונים (prone tubules). מנקודה זו, חתכו כ-32 פרוסות ברוחב 4 micron מהבלוקים. אספו את החתכים בעזרת פינצטה והניחו להם ליפול אל תוך כוס הביקר עם המים, מבלי שהפינצטה תיגע במים.החתך יתרחב ברגע שיגע במשטח המים. כעת ניתן לאסוף אותו על גבי זכוכית. הכניסו את הזכוכית למים בזווית של 45 מעלות והתקרבו אל החתך בעזרת מברשת ריסים עם ידית, תוך נגיעה רק בקצוות החתך. דגרו את הזכוכיתים במחמם זכוכיות עד לייבוש מלא, ודמיינו את החתכים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפיגנסטית או קונפוקלית.כאשר הפעולה מבוצעת נכון, זחל שהוזרק נראה כפי שמוצג בתמונה העליונה, כאשר דקסטראן צהוב פלואורסצנטי של לוציפראז נמצא במערכת כלי הדם של הזחלים. אם ההזרקה עמוקה מדי, כפי שניתן לראות בתמונה התחתוית, ניתן להבחין בחומר המוזרק בשקיק החלמון, או שהלב עלול להינקב ולגרום לדימום מסיבי. הזחלים פיתחו בצקת פריקארדיאלית כתוצאה מרעילות כלית של gentamicin, כפי שניתן לראות כאן.הזחלים בקבוצת הביקורת בחלק העליון אינם מראים בצקת פריקארדיאלית. עם זאת, לאחר הזרקת gentamycin, 80% מזחלי zebrafish מראים בצקת בינונית או חמורה, כפי שמוצג על ידי החצים בלוחות האמצע והתחתון. אנו משתמשים במערכת סיווג מבוססת פנוטיפ, שבה זחלים עם בצקת בינונית מראים בצקת פריקארדיאלית ניכרת, אך ללא פנוטיפים ניתנים לצפייה אחרים.בעוד שזחלים עם בצקת חמורה מראים בצקת פריקארדיאלית ובגוף, היעדר סירקולציה בגוף ועקמומיות קלה עד בינונית של ה-axis באמצעות נוגדן לצינורית הכליה נגד sodium potassium atpa ace. הצינוריות הפגועות נראות בחתכים רוחביים עם אובדן ניכר של קוטביות תאי בלוחות C ו-D ושיבוש צינורי בצינוריות הפגועות בהשוואה לביקורות בלוחות A ו-B. דפוס זה עקבי לאורך מספר חתכים רוחביים בעת השוואת החתכים. סנפירים פקטוריאליים וצינוריות פרוקסימליות מפותלות משמשים כסימנים אנטומיים.הרגע הצגנו בפניכם כיצד להשרות פגיעה כלייתית חריפה בזריקי דגי zebrafish. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש במחטי הזרקה בעלות קוטר של 10 20 micrometers. ייתכן שיהיה צורך לבצע ליטוש באש (fire polish) לכמה פיפטות אחזקה כדי להשיג את הממדים המתאימים, אך ברגע שיש לכם אחת כזו, תוכלו להמשיך להשתמש בה מכיוון שהיא יכולה להספיק למספר סבבי הזרקות.בנוסף, חשוב לוודא שאין בועות אוויר במכשיר המיקרו-סדרות JA, שכן הדבר יפגע במיקום של המערכת. לבסוף, מקמו את הדג בצורה אנכית במהלך ההטמעה כדי לקבל חיתוך רוחבי מושלם של התוואי הכליתי. וזהו.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

intravenous-microinjections-zebrafish-larvae-to-study-acute-kidney

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

נזק כלייתי אקוטי (AKI) בבני אדם היא בעיה קלינית נפוצה נגרמת על ידי נזק לתאי האפיתל המרכיבים nephrons כליות, AKI קשור עם שיעורי תמותה גבוהים של 5-70% 1. לאחר חורבן תא אפיתל, nephrons יש יכולת מוגבלת להתחדש, אם כי המנגנונים והמגבלות המנחים את התופעה הזאת להישאר ממעטים להבין. במאמר זה וידאו, אנחנו מתארים את הטכניקה שלנו אבלציה לייזר ממוקד של תאים נפרון כליה כליות העובר דג הזברה, או כלית ראשית. השיטה החדשה שלנו יכול לשמש כדי להשלים nephrotoxicity-Induced דגמים של AKI ולהשיג הבנה ברזולוציה גבוהה של...

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

סרטון זה מדגים מיקרו-הזרקה תוך ורידית של נפרוטוקסינים לווריד הזנב של עובר דג זברה כדי לחקור את ההשפעות הכימיות שלהם על תפקוד הכליות.

מיקרו-הזרקה תוך ורידית של נפרוטוקסינים לעובר דג זברה: טכניקה להעברת חומרים נפרוטוקסיים לזרם הדם של עובר דג זברה

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

כאן אנו מציגים שיטה אמינה לחקר התחדשות כליות במבוגרים על ידי גרימת פגיעה כלייתית חריפה על ידי הזרקת גנטמיצין. אנו מראים כי הפציעה תלויה במינון הגנטמיצין ובטמפרטורת הסביבה באמצעות הכלאה באתרה כדי לתייג lhx1a+ מפתח נפרונים חדשים.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

מאמר זה מדגים את העקרונות של זריקה מהירה, פולשנית של פלורסנט microparticles את circulatory system של דגים קטנים, הפריט החזותי ויוו של microparticles בדם דגים.

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לגרום לפגיעה בכליות חריפה (AKI) ב זברה-דג מבוגר באמצעות ציספלטין כסוכן נטרוקסי. פירטנו את השלבים כדי להעריך את הרבייה של הטכניקה ושתי טכניקות לניתוח דלקת ומוות תאים ברקמת הכליה, ציטומטריית זרימה ו- TUNEL, בהתאמה.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

מתוארת שיטת הזרקה תוך-צפקית חדשה (IP) בדגי זברה בוגרים. בעת טיפול בתרכובות רעילות כגון דוקסורוביצין, הליך זה יעיל יותר משתי שיטות ה- IP שדווחו בעבר. הטכניקה תוכננה להיות מאומצת בקלות על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל במודל דגי הזברה.

טכניקת הזרקה תוך צפקית בדגי זברה בוגרים הממזערת נזקי גוף ותמותה נלווית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי ויעיל להזרקה תוך ורידית של תאים או חומרים פרמקולוגיים לדג זברה בוגר, וכתוצאה מכך השתלת תאים משופרת ושיעורי הישרדות מוגברים של דג הזברה המטופל.

הזרקה תוך ורידית אופטימלית בדגי זברה בוגרים

כדי למודל כיצד אותות דלקתיים משפיעים על התפתחות עצבית באורגניזמים רגישים גנטית, אנו מציגים פרוטוקול להזרקת IL-6 מיקרו לתעלה של הווריד הקרדינלי הנפוץ של זחלי דגי הזברה, המאפשר השראה מבוקרת של דלקת והערכת השפעתו ההתפתחותית בהקשר של קומפלקס טרשת השחפתות (TSC).

מיקרוהזרקה של אינטרלוקין-6 לזרם הדם של זחלי דגי זברה TSC כדי לחקור התנהגויות דמויות הפרעות נוירופסיכיאטריות

למדו ליצור מודל של פגיעה כליות חריפה בזברה דגונית באמצעות מיקרו-הזרקה תוך ורידית של גנטמיצין. השיטה כוללת צביעת אימונוהיסטוכימיה להדמיית נזק לשלפוחיות כליות וניתוח מבני.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

גלה סרטונים נוספים