Name: דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: למד ליצור תולעים טרנסגנטיות ב-C. elegans באמצעות פגיעה ביוליסטית עם חלקיקי זהב מצופי DNA. שיטה זו מציעה חלופה יעילה למיקרו-הזרקה לחקר תפקוד גנים ורגולציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות זרע מאוניברסיטת פיטסבורג NIH מענק AG028977 ל אלף

<ol><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , 1-15 (2006).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 229, 31-35 (1999).</li>
<li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
<li>Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interacting+genes+in+nematode+dauer+larva+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interacting genes in nematode dauer larva formation.</a> Nature. 290, 668-671 (1981).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+function+and+expression+of+unc-119+from+two+Caenorhabditis+species+despite+divergence+of+non-coding+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA.</a> Gene. 183, 77-85 (1996).</li>
<li>Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrofitting+ampicillin+resistant+vectors+by+recombination+for+use+in+generating+C.+elegans+transgenic+animals+by+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment.</a> Plasmid. 62, 140-145 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+robust%2C+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+JE+%22The+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%22">The nematode, Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine-mediated+DNA+coating+remarkably+improves+bombardment+transformation+efficiency+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells.</a> Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).</li>
<li>Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transformation%3A+microbes+to+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biolistic transformation: microbes to mice.</a> Nature. 346, 776-777 (1990).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפגזה Biolistic היא שיטה פשוטה להציג דנ&quot;א זר לתוך אורגניזמים רבים, כולל ג elegans 1,5,6,7,16. הוא מסתמך על חלקיקי זהב ויצרו מורכבות עם ה-DNA בנוכחות CaCl 2. פוליאמינים קטיוני, כגון spermidine, להגן על ה-DNA מן השפלה nuclease in vivo. מאז spermidine הוא מולקולה יציב, חשוב לאחסן אותו aliquots קטן -20 ° C, ולהפוך את הפתרון הנכון לפני ביצוע הפצצה. כפי שתואר בפרוטוקול הפגזה, protamine יכול לשמש במקום spermidine להעביר דנ&quot;א זר 15. Prot...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<table><tbody><tr><td>חלקיקי זהב</td><td>Inbio gold</td><td>BD021</td><td>1 מיקרון</td></tr><tr><td>ערכה ל-Midiprep</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>ספרמידין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4139</td><td></td></tr><tr><td>פרוטמין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>נשאי-מאקרו (Macrocarriers)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>מערכת PDS-1000/He Hepta</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>דיסקת קריעה</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td></td></tr><tr><td>ניסטטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>סטפטומייצין </td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr></tbody></table>

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי biolistic

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

מספר מעבדות באמצעות C. חינם נמטודות חיים elegans הוא הולך וגדל במהירות. הפופולריות של הדגם הזה ביולוגי מיוחסת זמן הדור מהירה תוחלת חיים קצרה, תחזוקה קלה וזולה, רצף גנום מלא, מערך של RNAi משאבים בעלי חיים מוטציה. בנוסף, ניתוח של C. elegans הגנום גילה דמיון רב בין תולעים חוליות גבוהה, אשר טוען כי מחקר תולעים יכול להיות נספח חשוב מחקרים שבוצעו בעכברים כולו או תאים בתרבית. חלק חזק וחשוב של מחקר תולעת הוא היכולת להשתמש חיות טרנסגניות ללמוד לוקליזציה גן ותפקוד. בעלי חיים מהונדס ניתן ליצור גם באמצעות microinjection של germline התולעת או באמצעות הפצצה biolistic. הפצצה היא טכניקה חדשה והיא מוכרת פחות למספר מעבדות. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר תולעים מהונדס בהפצצות biolistic עם חלקיקי זהב באמצעות Bio-Rad PDS-1000 המערכת. בהשוואה microinjection דנ&quot;א לתוך אנדרוגינוס germline, פרוטוקול זה יש את היתרון של לא דורש כישורים מיוחדים ממפעיל לגבי זיהוי האנטומיה תולעת או ביצוע microinjection. יתר על הקווים מהונדס מרובים מתקבלים בדרך כלל הפגזה אחת. כמו כן, בניגוד microinjection, הפגזה biolistic מייצרת חיות טרנסגניות עם שני מערכים extrachromosomal ו transgenes משולב. היכולת לקבל קווי מהונדס משולב יכול למנוע את השימוש של פרוטוקולים מוטגניות לשלב דנ&quot;א זר. לסיכום, הפגזה biolistic יכולה להיות שיטה אטרקטיבי עבור הדור של חיות טרנסגניות, במיוחד עבור החוקרים לא מעוניין להשקיע את הזמן והמאמץ הדרושים כדי להיות מיומנים microinjection.

תולעים טראנסגנטי משמשים בדרך כלל<em&gt; ג elegans</em&gt; מחקר. המתואר הוא פרוטוקול פשוט, אך יעיל, להציג transgenes לתוך תולעים באמצעות הפצצה biolistic עם DNA מצופה חלקיקי זהב. המאמץ הכרוך ואת התוצאות של הפצצה להשוות לטובה עם microinjection עבור הדור של חיות טרנסגניות.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

מספר המעבדות המשתמשות בנמטודה החופשית *C. elegans* גדל במהירות. הפופולריות של מודל ביולוגי זה מיוחסת ל...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק תולעים טרנסגניות באמצעות טרנספקציה ביוטית או באמצעות פצצת גנים. ראשית גדלים כמויות גדולים של תולעים, לאחר מכן מצפים חלקיקי זהב ב-DNA, ומפגיזים את התולעים; לאחר מכן מבודלים ומצילים את הצאצאים הטרנסגניים, ומקימים קווים טרנסגניים חדשים. שלום, אני דניאל אווה מהמעבדה של ד"ר אלפרד פישר במחלקה לרפואה באוניברסיטת פיטסבורג.היום נדגים לכם פרוצדורה ליצירת תולעים טרנסגניות. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור ויסות גנים על ידי גורמי שעתוק. אז בואו נתחיל.הכנת צלחות הביצים מתחילה במזיגת תערובת של 2% agar במצע NGA מועשר ב-Nystatin ו-strep mycin. בצלחות של 10 עד 50 סנטימטר, יש להניח לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לבצע אוטוקלאב ל-400 milliliters של מצע LB בבקבוק של 500 milliliters ול-40 milliliters של מצע LB בבקבוק ערבוב של 250 milliliters.בנוסף, עקרו באוטוקלאב בק ריק של 500 מיליליטר למשך 20 דקות. לאחר העיקור, הוסיפו streptomycin ל-40 מיליליטר של מצע LB עד לריכוז סופי של 200 micrograms per milliliter. לאחר מכן, בצעו אינוקולציה עם זן של e coli.OP 50 מקריעה אחת. יש לאפשר לתרבית לגדול למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, העבירו את החלמונים מ-10 ביצי תרנגולת לבקבוק סטרילי של 500 mL.השלם את הנפח ל-400 milliliters באמצעות מצע LB ונער עד להיווצרות תמיסה אחידה. דגרי את התמיסה בטמפרטורה של 60 degrees Celsius למשך שעה אחת. לאחר שתערובת ה-lb התקררה לטמפרטורת החדר, הוסף לבקבוק 40 milliliters של תרבית ELI ונער.לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפט pięć עד שמונה מיליליטר של התרבית על פני פלטות NGA שהוכנו מראש. הניחו להן להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, שפכו החוצה כל נוזל שנותר והניחו להתייבש ללילה נוסף בטמפרטורת החדר.בשלב זה, ניתן לאחסן את הצלחות מספר שבועות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס או לזרוע בהן תולעים באופן מיידי. כדי להרחיב אוכלוסייה של DP 38 CL, יש להוסיף E. coli OP 50 מרוכז לצלחות NGA של שישה סנטימטרים המכילות תולעי DP 38 שסבלו מהרעבה לאחרונה, ולהדגיר. השתמש בתמיסת היפוכלוריט בסיסית כדי לבודד את הביצים מהתולעים מסוג DP 38.הפרוצדורה מתוארת בפרוטוקול המצורף. לאחר בידוד הביצים, השהה אותן בבופר S basil או M9. הוסף יותר מ-10,000 ביצים לכל פלטת ביצים של 10 ס"מ שהוכנה, ואפשר לתולעים לגדול בטמפרטורה של 20 °C למשך שבעה עד 10 ימים.ברגע שהתולעים החלו לנקות את המזון, הצלחות מוכנות להפגזה. כדי לצפות חלקיקי זהב ב-DNA לצורך ההפגזה, הוסף 60 milligrams של חלקיקי זהב למבחנה של 1.7 milliliter. לאחר מכן הוסף 70% ethanol והשאר את הזהב להשריה למשך 15 דקות.סובב את המבחנה קצרות כדי להשקיע את חלקיקי הזהב. שפוך את האתנול. לאחר מכן, שטוף את חלקיקי הזהב שלוש פעמים במים סטריליים.שחזר את הזהב במיליליטר אחד של גליצרין סטרילי בריכוז 50%. ניתן לאחסן את תמיסת המאגר של חלקיקי הזהב במשך חודשים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אסוף את התולעים על ידי ציפופה מהצלחות הביצים באמצעות באפרים מסוג s basil או M line.לאחר מכן, העבירו אותם לשפופרת קונית של 50 מיליליטר. המתינו עד שהתולעים ישקעו לתחתית השפופרת. לאחר מכן, שאבו מהשפופרת את כל הבאפר למעט שני עד שלושה מיליליטרים, תוך שימוש בבאפר שנותר.העבירו את התולעים לצלחת NGA נקייה ללא סימונים בקוטר 10 סנטימטרים שהוקפאה על קרח באופן אחיד. פזרו את התולעים על פני כל שטח הצלחת. לאחר מכן, הניחו לצלחת להתייבש לחלוטין על קרח.פעולה זו תמנע מהתולעים להידבק אחת לשנייה במהלך תהליך הייבוש. חשוב שהתולעים יהיו מפוזרות באופן אחיד ושהפלטה תהיה יבשה לחלוטין לפני הליך ההפצצה. כדי להכין את חלקיקי הזהב המצופים ב-DNA, העבירו 50 µL של חלקיקי זהב שהורחפו מחדש למבחנה של 1.7 mL.סבבו את חלקיקי הזהב בסנטריפוגה עד לשקיעה והסירו את הנוזל העליון. לאחר מכן, הוסיפו תערובת של 10 עד 15 מיקרוגרם של DNA מעובד, מעגלי או ליניארי, של מטרה הרצויה ו-20 מיקרוליטר של spermine 0.1 מולארי שהוכן טרי. לבסוף, תוך כדי ערבוב עדין של המבחנה בוורטקס, הוסיפו 50 מיקרוליטר של calcium chloride 2.5 מולארי, והדגירו את התערובת על קרח למשך 30 דקות עם ערבוב תקופתי כדי לשמור על חלקיקי הזהב בתליה.לאחר 30 דקות, סבב את תערובת חלקיקי הזהב בצנטריפוגה. שאב בקצרה את הנוזל העליון, שטוף עם 300 µL של 70% ethanol, ולאחר מכן עם 1 mL של 100% Ethanol, ולבסוף השהה מחדש את חלקיקי הזהב המצופים ב-DNA ב-170 µL של 100% ethanol. עבור כל הפצצה, שטוף שבעה נשאי-מאקרו (macro carriers) שיחזיקו את חלקיקי הזהב ב-propanol, ולאחר מכן הותר להם להתייבש בטמפרטורת החדר.ערבבו במערבל וורטקס (Vortex) את תערובת ה-DNA והזהב. לאחר מכן, טפטפו בעזרת פיפט 20 µL למרכזו של כל נשא מאקרו (macro carrier). המתינו עד להתאיידות האתנול.הכנס את דיסקת הקריעה למתאם ה-Hector ואבטח את המתאם בתוך מכשיר ההפצצה. לאחר מכן, הנח את שבעת נשאי המאקרו לתוך התושבת והשתמש בכלי המסופק כדי להושיב אותם. לבסוף, הנח מסך עצירה של Hector ואת הבסיס על התושבת.הפכו את המחזיק כך שהצד עם הנקודות המוזהבות של נשאי המקרו (macro carriers) פונה כלפי מטה. והניחו אותו על המדף השני מלמעלה. יישרו את החורים בחלקו העליון של מחזיק נשאי המקרו עם פתחי היציאה של מתאם ההקטור (Hector adapter).הסר את המכסה מלוח ה-NGA המצופה בתולעים והנח אותו במדף הנמוך ביותר בתא ההפגזה. פתח לחלוטין את ידית קצב זרימת הוואקום ולחץ והחזק את כפתור ה-vac עד שהתא יגיע ל-26 inches of mercury. לאחר מכן, העבר למצב hold. כדי לשמור על הוואקום, לחץ והחזק את כפתור ה-fire עד לפקיעת הדיסקה.דבר זה יקרה כאשר הלחץ יגיע ל-1, 350 PSI ועשוי להימשך בין חמישה ל-20 שניות. שחרר את הכפתור, שחרר את הוואקום מהתא על ידי מעבר למצב ניתוץ (vent) והוצא את הפלטה. כבה את הוואקום בהליום.לאחר מכן, לחצו על כפתור ההפעלה (fire) מספר פעמים עד שקו ההליום יהיה נקי ומד ההליום יראה 0 PSI. לבסוף, כבו את מערכת ה-PDS 1000. כעת, לאחר שהתולעים עברו טרנספורמציה, ניתן לאסוף אותן ולהדגיר אותן לאחר ההפצצה.השאירו את הצלחת בטמפרטורה של 20 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, הפיקו את התולעים מהצלחת באמצעות 10 milliliters של תמיסת S basil או M nine buffer; זרעו צלחות NGA עם נקודות בקוטר 10 centimeter באמצעות 0.5 milliliters מהתולעים בתמיסה. לאחר מכן, השאירו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך כשבועיים.בצעו סריקה לאיתור הצלה של הפנוטיפ UNC-19 על ידי הטרנסגן, והקימו קו פרט בודד מכל צלחת של 10 סנטימטר שהכילה תולעים שהוצלו. הצלחת הפרוטוקול בכל הנוגע להשגת בעלי חיים טרנסגניים תלויה בטרנסגן הספציפי. עבור טרנסגנים של GFP Reporter עם פרומוטור, השגנו עד 20 קווים.תוצאה טיפוסית יותר היא שלושה עד 10 קווים. עד 30% מהקווים הטרנסגניים הם קווים שבהם בוצעה אינטגרציה, אך הדבר קורה באופן אקראי ואנו נבצע מספר הפצצות ביום אחד אם קיים רצון מיוחד לקו שעבר אינטגרציה. מוצגת פלטה מייצגת של 10 סנטימטרים עם תולעי מוטנט 19 שהוצלו על ידי הפצצה בטרנסגן.ניתן לזהות את התולעים שהוחלצו על פי גודלן הגדול יותר וניידותם המשופרת משמעותית ביחס לאלו שלא עברו טרנספורמציה. באחד נמצאו 19 מוטנטים. בידוד של תולעים שהוחלצו אשר עברו טרנספורמציה עם טרנסגן GFP גורם לביטוי של GFP.טרנסגן זה מבטא GFP בעוצמה במעי ובהיפודרמיס של תולעים טרנסגניות. טרנסגן זה משולב בכרומוזום של התולעת ו-100% מהצאצאים מבטאים את הטרנסגן. הרגע הדגמנו בפניכם כיצד לבצע הפצצה ביוליסטית של sea elegance בעת ביצוע הליך זה.חשוב לגדל כמות גדולה של תולעים ולהשתמש בתרביות טריות. זהו כל השלב. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

generation-of-transgenic-c-elegans-by-biolistic-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

סרטון זה מתאר את העקרונות מאחורי הטיפול ב-RNAi ב-C. elegans ומדגים פרוטוקול להשמדת lin-35 בזן תולעים מהונדס.

ציפוי RNAi עבור C. elegans Feeding: טכניקה להשראת ביטוי dsRNA מטרה ב- E. coli

פרוטוקול זה מתאר הליך מהיר וצריכת חומר נמוך לשילוב של מערכים חוץ-כרומוזומליים טרנסגניים בגנום Caenorhabditis elegans באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV). יתר על כן, פרוטוקול זה מתאים במיוחד לקווים טרנסגניים המשדרים מערכים חוץ-כרומוזומליים בקצב גבוה.

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

פרוטוקול זה מתאר כיצד ללמוד תהליכים תאיים במהלך ההמרה גורל התא ב Caenorhabditis elegans ויוו. באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר ביטוי יזם מונחה חום-שוק של נוירון בתדר גורל שעתוק הגורם צ'ה-1 מציאה RNAi בתיווך דלדול של כרומטין מווסת גורם לין-53 נבט לתא נוירון התכנות יכול להיות שנצפו אין ויוו.<br...

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

ערכת הכלים הגנומית הפונקציונלית עבור הנמטודות הטפיליות סטרונגילואידים סטרקורליס וסטריונגילודים ראטי כוללת טרנסגנזה, מוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 ו-RNAi. פרוטוקול זה ידגים כיצד להשתמש במיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית כדי להכניס טרנסג'נים ורכיבי קריספר לתוך S. stercoralis ו - S. ratti.

יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים סטרונגילואידים על ידי מיקרו-אינטגרציה

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

תהליך הזרקה מיקרו-CRISPR/Cas9 לתיוג פלואורסצנטי אנדוגני בקו הנבט Caenorhabditis elegans לקבלת קווי הדחיפה הומוזיגוטיים לניתוח מיקום חלבונים בחיים.

תיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים ספציפיים לקו הנבט ב-Caenorhabditis elegans

למד ליצור תולעים טרנסגנטיות ב-C. elegans באמצעות פגיעה ביוליסטית עם חלקיקי זהב מצופי DNA. שיטה זו מציעה חלופה יעילה למיקרו-הזרקה לחקר תפקוד גנים ורגולציה.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

גלה סרטונים נוספים