Name: דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: למד ליצור תולעים טרנסגנטיות ב-C. elegans באמצעות פגיעה ביוליסטית עם חלקיקי זהב מצופי DNA. שיטה זו מציעה חלופה יעילה למיקרו-הזרקה לחקר תפקוד גנים ורגולציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות זרע מאוניברסיטת פיטסבורג NIH מענק AG028977 ל אלף

<ol><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , 1-15 (2006).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 229, 31-35 (1999).</li>
<li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
<li>Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interacting+genes+in+nematode+dauer+larva+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interacting genes in nematode dauer larva formation.</a> Nature. 290, 668-671 (1981).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+function+and+expression+of+unc-119+from+two+Caenorhabditis+species+despite+divergence+of+non-coding+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA.</a> Gene. 183, 77-85 (1996).</li>
<li>Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrofitting+ampicillin+resistant+vectors+by+recombination+for+use+in+generating+C.+elegans+transgenic+animals+by+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment.</a> Plasmid. 62, 140-145 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+robust%2C+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+JE+%22The+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%22">The nematode, Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine-mediated+DNA+coating+remarkably+improves+bombardment+transformation+efficiency+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells.</a> Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).</li>
<li>Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transformation%3A+microbes+to+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biolistic transformation: microbes to mice.</a> Nature. 346, 776-777 (1990).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפגזה Biolistic היא שיטה פשוטה להציג דנ&quot;א זר לתוך אורגניזמים רבים, כולל ג elegans 1,5,6,7,16. הוא מסתמך על חלקיקי זהב ויצרו מורכבות עם ה-DNA בנוכחות CaCl 2. פוליאמינים קטיוני, כגון spermidine, להגן על ה-DNA מן השפלה nuclease in vivo. מאז spermidine הוא מולקולה יציב, חשוב לאחסן אותו aliquots קטן -20 ° C, ולהפוך את הפתרון הנכון לפני ביצוע הפצצה. כפי שתואר בפרוטוקול הפגזה, protamine יכול לשמש במקום spermidine להעביר דנ&quot;א זר 15. Prot...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<table><tbody><tr><td>חלקיקי זהב</td><td>Inbio gold</td><td>BD021</td><td>1 מיקרון</td></tr><tr><td>ערכה ל-Midiprep</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>ספרמידין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4139</td><td></td></tr><tr><td>פרוטמין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>נשאי-מאקרו (Macrocarriers)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>מערכת PDS-1000/He Hepta</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>דיסקת קריעה</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td></td></tr><tr><td>ניסטטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>סטפטומייצין </td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr></tbody></table>

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי biolistic

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

מספר מעבדות באמצעות C. חינם נמטודות חיים elegans הוא הולך וגדל במהירות. הפופולריות של הדגם הזה ביולוגי מיוחסת זמן הדור מהירה תוחלת חיים קצרה, תחזוקה קלה וזולה, רצף גנום מלא, מערך של RNAi משאבים בעלי חיים מוטציה. בנוסף, ניתוח של C. elegans הגנום גילה דמיון רב בין תולעים חוליות גבוהה, אשר טוען כי מחקר תולעים יכול להיות נספח חשוב מחקרים שבוצעו בעכברים כולו או תאים בתרבית. חלק חזק וחשוב של מחקר תולעת הוא היכולת להשתמש חיות טרנסגניות ללמוד לוקליזציה גן ותפקוד. בעלי חיים מהונדס ניתן ליצור גם באמצעות microinjection של germline התולעת או באמצעות הפצצה biolistic. הפצצה היא טכניקה חדשה והיא מוכרת פחות למספר מעבדות. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר תולעים מהונדס בהפצצות biolistic עם חלקיקי זהב באמצעות Bio-Rad PDS-1000 המערכת. בהשוואה microinjection דנ&quot;א לתוך אנדרוגינוס germline, פרוטוקול זה יש את היתרון של לא דורש כישורים מיוחדים ממפעיל לגבי זיהוי האנטומיה תולעת או ביצוע microinjection. יתר על הקווים מהונדס מרובים מתקבלים בדרך כלל הפגזה אחת. כמו כן, בניגוד microinjection, הפגזה biolistic מייצרת חיות טרנסגניות עם שני מערכים extrachromosomal ו transgenes משולב. היכולת לקבל קווי מהונדס משולב יכול למנוע את השימוש של פרוטוקולים מוטגניות לשלב דנ&quot;א זר. לסיכום, הפגזה biolistic יכולה להיות שיטה אטרקטיבי עבור הדור של חיות טרנסגניות, במיוחד עבור החוקרים לא מעוניין להשקיע את הזמן והמאמץ הדרושים כדי להיות מיומנים microinjection.

תולעים טראנסגנטי משמשים בדרך כלל<em&gt; ג elegans</em&gt; מחקר. המתואר הוא פרוטוקול פשוט, אך יעיל, להציג transgenes לתוך תולעים באמצעות הפצצה biolistic עם DNA מצופה חלקיקי זהב. המאמץ הכרוך ואת התוצאות של הפצצה להשוות לטובה עם microinjection עבור הדור של חיות טרנסגניות.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

מספר המעבדות המשתמשות בנמטודה החופשית *C. elegans* גדל במהירות. הפופולריות של מודל ביולוגי זה מיוחסת ל...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק תולעים טרנסגניות באמצעות טרנספקציה ביוטית או באמצעות פצצת גנים. ראשית גדלים כמויות גדולים של תולעים, לאחר מכן מצפים חלקיקי זהב ב-DNA, ומפגיזים את התולעים; לאחר מכן מבודלים ומצילים את הצאצאים הטרנסגניים, ומקימים קווים טרנסגניים חדשים. שלום, אני דניאל אווה מהמעבדה של ד"ר אלפרד פישר במחלקה לרפואה באוניברסיטת פיטסבורג.היום נדגים לכם פרוצדורה ליצירת תולעים טרנסגניות. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור ויסות גנים על ידי גורמי שעתוק. אז בואו נתחיל.הכנת צלחות הביצים מתחילה במזיגת תערובת של 2% agar במצע NGA מועשר ב-Nystatin ו-strep mycin. בצלחות של 10 עד 50 סנטימטר, יש להניח לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לבצע אוטוקלאב ל-400 milliliters של מצע LB בבקבוק של 500 milliliters ול-40 milliliters של מצע LB בבקבוק ערבוב של 250 milliliters.בנוסף, עקרו באוטוקלאב בק ריק של 500 מיליליטר למשך 20 דקות. לאחר העיקור, הוסיפו streptomycin ל-40 מיליליטר של מצע LB עד לריכוז סופי של 200 micrograms per milliliter. לאחר מכן, בצעו אינוקולציה עם זן של e coli.OP 50 מקריעה אחת. יש לאפשר לתרבית לגדול למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, העבירו את החלמונים מ-10 ביצי תרנגולת לבקבוק סטרילי של 500 mL.השלם את הנפח ל-400 milliliters באמצעות מצע LB ונער עד להיווצרות תמיסה אח

generation-of-transgenic-c-elegans-by-biolistic-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

סרטון זה מתאר את העקרונות מאחורי הטיפול ב-RNAi ב-C. elegans ומדגים פרוטוקול להשמדת lin-35 בזן תולעים מהונדס.

ציפוי RNAi עבור C. elegans Feeding: טכניקה להשראת ביטוי dsRNA מטרה ב- E. coli

פרוטוקול זה מתאר הליך מהיר וצריכת חומר נמוך לשילוב של מערכים חוץ-כרומוזומליים טרנסגניים בגנום Caenorhabditis elegans באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV). יתר על כן, פרוטוקול זה מתאים במיוחד לקווים טרנסגניים המשדרים מערכים חוץ-כרומוזומליים בקצב גבוה.

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

פרוטוקול זה מתאר כיצד ללמוד תהליכים תאיים במהלך ההמרה גורל התא ב Caenorhabditis elegans ויוו. באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר ביטוי יזם מונחה חום-שוק של נוירון בתדר גורל שעתוק הגורם צ'ה-1 מציאה RNAi בתיווך דלדול של כרומטין מווסת גורם לין-53 נבט לתא נוירון התכנות יכול להיות שנצפו אין ויוו.<br...

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

ערכת הכלים הגנומית הפונקציונלית עבור הנמטודות הטפיליות סטרונגילואידים סטרקורליס וסטריונגילודים ראטי כוללת טרנסגנזה, מוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 ו-RNAi. פרוטוקול זה ידגים כיצד להשתמש במיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית כדי להכניס טרנסג'נים ורכיבי קריספר לתוך S. stercoralis ו - S. ratti.

יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים סטרונגילואידים על ידי מיקרו-אינטגרציה

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

תהליך הזרקה מיקרו-CRISPR/Cas9 לתיוג פלואורסצנטי אנדוגני בקו הנבט Caenorhabditis elegans לקבלת קווי הדחיפה הומוזיגוטיים לניתוח מיקום חלבונים בחיים.

תיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים ספציפיים לקו הנבט ב-Caenorhabditis elegans

למד ליצור תולעים טרנסגנטיות ב-C. elegans באמצעות פגיעה ביוליסטית עם חלקיקי זהב מצופי DNA. שיטה זו מציעה חלופה יעילה למיקרו-הזרקה לחקר תפקוד גנים ורגולציה.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

גלה סרטונים נוספים