איתור פעילות Neu1 Sialidase בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את השראת הפעילות של cellular new one sase בתגובה לקשירת ליגנד לקולטן הספציפי שלו. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול תאים על למסות זכוכית מעגליות בקוטר 12 מילימטר בתוך פלטת תרבית רקמות בעלת 24 בארות למשך 24 שעות. כשלב שני, התאים החיים ההודבקים למסת הזכוכית מובאים למגע ישיר עם תערובת שהוכנה מראש של סובסטרט של sase וליגנד של הקולטן, עם או בלי מעכבים ספציפיים, על גבי למסת מיקרוסקופ.

את זכוכית העצירה מניחים מיד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי על מנת להדגים ולתעד באופן דיגיטלי את תמונות הפלואורסצנציה. עם הזמן מתקבלות תוצאות המראות שינויים בפעילות של new one sase על פני השטח של התא, הקשורה לתאים חיים שעובדו עם הליגנד, בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנציה הכחולה המקיפה את התאים תחת מיקרוסקופיית epi fluorescence.

היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אנליזה ספקטרופוטומטרית, הוא שימוש בכמות מופחתת של ריאגנטים. כמו כן, ניתן לצפות וללכוד תמונות של פעילות sase בתאים חיים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון בחינת אינטראקציות פוטנציאליות וחדשניות בין ליגנד לרצפטור, וכן בחינת ההשפעות של מעכבי אנזימים או חלבונים ספציפיים על הפעלת רצפטורים.

את הפרוצדורה ידגימו ד"ר Ray Amit וד"ר PT Gath, סטודנטים לשעבר לתואר PhD מהמעבדה שלי, המשתמשים בסבב בדיקות זה במחקריהם. לפני החייאת תאי מקרופאג קפואים, הכינו מצע תרבית באמצעות delcos מסונן סטרילית, modified eagles medium מועשר ב-10% fetal bovine serum וב-5 µg/mL של האנטיביוטיקה plasmin. לאחר מכן, הוסיפו 4 mL של מצע התרבית לבקבוק תרבית תאים של 25 cm² עבור כל מבחנה של תאים קפואים; הוציאו את מבחנת התאים הקפואים מהמקפיא של 80°C- והפשירה אותם במהירות על ידי חימום בידיים תחת מנדף ביו-סכנה סטרילי.

תהליך זה יארך כשלוש עד שתי דקות. ברגע שהתאים הופשרו, השתמשו בפיפטה סטרילית של 1 mL כדי להעבירם במהירות לבקבוק תרבית התאים המכיל את המצע המותנה. הניחו את הבקבוק המכיל את התאים באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide באמצעות מיקרוסקופ הפוך.

בדוק את התאים מדי יום כדי לוודא צמיחה והיצמדות עד שיגיעו ל-75% עד 90% התמסרות (confluency), מספר ימים לפני זריעת התאים לבדיקת ה-SASE. הכן את הלמיות הזכוכית העגולות בקוטר 12 מילימטר שבהן ייזרעו התאים, בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.

הניחו את העגילות בצלחת פטרי גדולה מזכוכית ועקרו אותן על ידי טבילה ב-100% ethanol למשך שעה אחת. הסירו את האלכוהול והשאירו את העגילות הרטובות חשופות לזרם האוויר המסונן והסטרילי בארון תחת UV למשך 24 שעות או עד שיהיו יבשות להזריעה. ראשית, עקרו פינצטה מסוררת מעוקלקת מאותו פלדת אל-חלד באורך ארבעה אינץ' על ידי שריפה בלהבה.

לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להניח בזהירות סלייד זכוכית עגול וסטרילי בודד לתוך כל באער של פלטה פוליסטירנית לתרביות רקמה עם תחתית שטוחה בעלת 24 באערים. באמצעות פיפטה סטרילית של 5 מיליליטר, הסירו את מצע ה-DMEM המותנה מהבקבוק עם תאי המקרופאגים הדבקים. שטפו את התאים פעם אחת עם 1x sterile tris buffered saline pH 7.4 כדי להסיר כל מצע המכיל סרום.

בשלב הבא, הוסיפו 1 mL של תמיסת saline buffered phosphate נטולת פוספט עם סידן ב-pH 7.4. הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך כ-10 דקות או עד שהתאים יתחילו להתנתק מדופן הבקבוק. לאחר שהתאים התנתקו, הוסיפו 3 mL של מצע DMEM conditioned לתאים התלויים.

לאחר מכן, העבירו 0.5 milliliters של התרחיף עם כ-0.5 מיליון תאים לכל זכוכית כיסוי עגולה בקוטר 12 millimeter בתוך פלטת 24 בארות. הדגירו את פלטת תרבית הרקמה המכילה את תאי המקרופאג בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 24 שעות, כדי לאפשר לתאים להיצמד לזכוכית הכיסוי העגולה. הבדיקה לפעילות sase תבוצע תחת שלושה תנאים שונים בשלוש זכוכיות כיסוי נפרדות עבור המיקרוסקופ. בזכוכית הראשונה, המשמשת כביקורת שלילית.

תאי ביקורת נחשפים לתמיסת קיבוע, לתשתי של נוירומינידאז עבור ANA ולסליין בבופר טריס, אך לא לליגנד של קולט TLR, LPS. בפריזית השנייה, התאים נחשפים לתמיסת קיבוע, לליגנד של קולט TLR, LPS ולסליין בבופר טריס.

בשקופית השלישית, התאים נחשפים לתוסף קיבוע עבור ANA, LPS Tris, תמיסת סליין מחוצעת, ומעכב נוירמינידאז Tamiflu. נדגים את הפרוצדורה עבור הבדיקה השנייה בלבד, מכיוון ששלוש הבדיקות נבדלות רק בתערובת התרכובים על שקופית המיקרוסקופ. הניחו את שקופית המיקרוסקופ על משטח העבודה במעבדה והוסיפו את התרכובים הבאים בסדר עוקב.

מיקרוליטר אחד של תמיסת קיבוע, לאחר מכן מיקרוליטר אחד של פורמלין, שני מיקרוליטרים של LPS ולבסוף, שלושה מיקרוליטרים של tris buffered saline, pH 7.4. לאחר מכן, הסירו את המצע מבאר אחת בלוח 24 הבארים המכיל את התאים. השלב הבא הוא החלק הקשה ביותר בהליך זה, שכן עליכם להסיר את כיסוי הזכוכית העגול מהבאר של לוח תרביות הרקמה באמצעות פינצטה, מבלי לשבור אותו, בעזרת פינצטה באורך ארבעה אינצ'ים.

הרימו בעדינות את השקף המעגלי לפינת הבאר, ולאחר מכן הסירו אותו בזהירות והניחו את השקף כשהתאים פונים כלפי מטה לתוך תערובת התמיסות. קחו את שקף המיקרוסקופ מיד למיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי (epi fluorescent) שהוגדר למסנן UV ומצויד במצלמה דיגיטלית לצילום תמונות פלואורסצנטיות. התמקדו במיקרוסקופ תחת ניגודיות פאזה (phase contrast) עד שתוכלו לראות את התאים, ולאחר מכן עברו למצב פלואורסצנטי.

רכשו תמונות של התאים במצב פלואורסצנציה לאחר דקה אחת, שתי דקות ושלוש דקות. בנוסף, רכשו תמונה בודדת של התאים בייצוג של ניגוד מופע (phase contrast). תוצאות של ניסוי sase assay מוצגות כאן.

ראשית, כביקורת שלילית, תאים חיים שהודבקו לשקף זכוכית הוכנסו למגע ישיר עם תערובת נקודתית של מדיום קיבוע ותסבסב (substrate) לצורך בדיקת פעילות IP sase. התסבסב יעבור הידרוליזה כדי להפיק ethyl lum beone חופשי, בעל פליטה פלואורסצנטית ב-450 nanometers בעקבות עירור ב-365 nanometers, שנמדדה שתי דקות לאחר הוספת התסבסב.

תמונה פלואורסצנטית זו אינה מראה פעילות sase מסביב לתאים. התמונה הבאה מראה את התוצאות של בדיקת SASE חיובית, שבה תאים חיים שהודבקו למשטח זכוכית הוכנסו במגע ישיר עם תערובת נקודתית של מדיום קיבוע, substrate 4 וליגנד TLR 4 מסוג LPS. ה-substrate עבר הידרוליזה על ידי אנזים sase כדי להפיק ethyl lum beone חופשי, והתמונה הפלואורסצנטית שצולמה שתי דקות לאחר הוספת ה-substrate וה-LPS מעידה על רמות גבוהות של פעילות sase מסביב לתאים.

עם זאת, כאשר תאים חיים הועמדו במגע ישיר עם תערובת נקודתית של מדיום קיבוע מהסובסטרט הננוי, ליגנד TLR 4 מסוג LPS, וכן מעכב נוראמינזידאז, Tamiflu, נשגגה פעילות ה-sase באופן משמעותי או שלא זוהתה עוד, בהתאם לריכוז המעכב. לבסוף, גרף זה מציג את ריכוז העכבה של 50% (IC50) של Tamiflu ושל Oseltamivir carboxylate, שנקבע על ידי שרטוט הירידה בפעילות ה-sase אל מול הלוגריתם של ריכוז החומר; הפלואורסצנציה הממוצעת מסביב לתאים עבור כל קבוצה נמדדה באמצעות תוכנת Image J. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לתרבית את התאים על לוחות כיסוי מזכוכית עגולים בצלחות תרבית רקמה של 24 בארים, 24 שעות לפני תחילת בדיקת ה-Sade.

בנוסף, יש להכין את כל הרכיבים המשמשים בבדיקה זו לפני תחילת הבדיקה.