Name: איתור פעילות Neu1 Sialidase בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: חקור פעילות סיאלידאז בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן במקרופאגים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי תגובות תאיות ומנגנוני מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה חלקית על ידי מענקים גברת הוא מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC), את Botterell הארי קרן Neuroscience Research, ARC, ואת המחקר קלי גארפילד לב וכלי דם הקרן לפיתוח. SRA הוא חתן פרס המלכה מחקר אוניברסיטת רוברט וילסון המלגה. ג&#39;יי הוא חתן פרס בוגר של המלכה ואת רוברט וילסון המלגה. AG ו SA הם מקבלי פרס בוגר של המלכה. המדע הבדיוני היה מקבל מלגת אונטריו בוגר במדע וטכנולוגיה (OGSST). AG הוא מקבל מלגת פרנקלין של המלכה בוגר שרך. SA הוא מקבל מלגת RS של המלכה בוגר מקלפלין.

1. החייאת&#39; תאים macrophage קפוא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני להחיות תאים קפואים מ -80 מעלות צלזיוס הקפאה, צריך להכין מדיום תרבות באמצעות סטרילי בינונית מסוננת השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו - 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של plasmocin. Plasmocin הוא פתרון אנטיביוטי השתמשו במחקר שלנו לחסל ולמנוע זיהום mycoplasma של תרביות תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בקבוקון אחד של תאים קפואים, מוסיפים 4 מ&quot;ל, 1 מ&quot;ל של מדיום תרבותי ל 25 ס&quot;מ 2 בקבוק תרבית תאים במנדף Biohazard הבלימה סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר את הבקבוקון של תאים קפואים לקוחים במקפיא -80 מעלות צלזיוס, הם הפשירו מהר מכסה המנוע סטרילית, אשר לוקח בערך 2-3 דקות על ידי ההתחממות יד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים מופשר, הם מועברים במהירות לתוך בקבוקון המכיל את המדיום מותנה בעזרת פיפטה סטרילית 1mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון המכיל את התאים ממוקמים בתרבית רקמה החממה ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בדק צמיחה ועמידה על בסיס יומי עד שהם הופכים 75% עד 90% ומחוברות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה את התרבות התאים, 12 מ&quot;מ עגול שקופיות זכוכית מעוקר ידי כיסוי אותם אתנול 70% צלחת פטרי זכוכית גדול עבור שעות 1 בממשלה הבלימה Biohazard, אלכוהול הוא הסיר לאחר מכן מאוחסן עבור reusage, והצדדים כוס רטוב נותרים חשופים תזרים סטרילי סינון האוויר בממשלה תחת UV למשך 24 שעות או עד שהם יבשים. </li></ol> 2. ציפוי תאים עבור Assay Sialidase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ציפוי התאים, שקופית אחת בודדת סטרילי זכוכית עגול ממוקם היטב באחד היטב של פלקון 24-BD גם שטוחות תחתית עם מכסה רקמות תרבות צלחת קלקר שטופלו באמצעות עיקור מעוקל מלא בוערים, 4 &quot;, משונן, נירוסטה המלקחיים . עבור בקבוק אחד של תאים בנקודת המפגש 75%, אנו משתמשים בדרך כלל 12 בארות הצלחת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים macrophage חסיד, המדיום DMEM מותנה הוסר מהבקבוק בעזרת פיפטה 5 מ&quot;ל סטרילי בממשלה הבלימה סטרילית. לשטוף את התאים חסיד פעם עם 1x סטרילי טריס בופר סליין pH 7.4 כדי להסיר כל מדיום המכיל סרום, ולהוסיף 1 מ&quot;ל של סידן זרחתי בינוני (CMF) חינם בופר ב-pH 7.4 מספיק כדי לכסות את התאים. התאים ממוקמים 37 ° C חממה כ -10 דקות או עד שהתאים מתחילים להמריא בבקבוק. הבקבוק ניתן התנדנדה קלות או מזועזע כדי לשחרר את כל התאים הנותרים חסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי מ&quot;ל 1 של תאים המרחפים הבקבוק, להוסיף 3 מ&quot;ל של מדיום DMEM מותנה. קח 0.5 מ&quot;ל של תאים על תנאי sterilely והעבירו אותם בצלחת בתרבית רקמה המכילה את 12 עגול מ&quot;מ שקופיות הזכוכית. כ, 0.5 x 10 6 תאים מועברים השקופיות זכוכית עגולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות הרקמה צלחת התאים המכילים מודגרת על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 למשך 24 שעות על מנת לאפשר לתאים לדבוק שקופיות זכוכית עגולה. </li></ol> 3. Sialidase Assay 1. ביצוע הבקרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות מיקרוסקופ (חלבית: 1 סוף, 1slide, 25 x 75 x 1 מ&quot;מ) בקבינט בלימה או ספסל מעבדה להוסיף ידי ערבוב בסדר רציף המתחמים הבאים: 1 + 1 μL DAKO μL של 4-MUNANA ולבסוף + 3 μL של טריס בופר סליין pH 7.4 (TBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת התקשורת מאחד היטב המכיל את התאים, להרים בעדינות את השקף זכוכית עגול עם המלקחיים את &quot;4 לפינה של הבאר. בזהירות להסיר את השקופית זכוכית עם המלקחיים והמקום השקופית עם התאים הפונים אל הפתרון את התערובת על השקופית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לקחת את השקופית microcope כדי מיקרוסקופיה עלית פלורסנט אשר הוגדר עבור המסנן UV ויש לו מצלמה דיגיטלית ללכידת תמונות ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס תחת מיקרוסקופ לעומת שלב עד שתוכל לראות את התאים ולאחר מכן לעבור למצב ניאון. צלמו תמונות של התאים תחת פלורסנט בבית 1 דקות, 2 דקות, ו - 3 דקות. קחו תמונה אחת של תאים תחת בניגוד שלב. </li></ol> 2. ביצוע הבדיקה חיובית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט המתחמים הבאים לפי סדר רציף בשקופית אחרת מיקרוסקופ: 1 + 1 μL DAKO μL של 4-MUNANA + 2 μL של LPS + 1 μL של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.2 עד 3.1.4 לעיל. </li></ol> 3. ביצוע הבדיקה חיובית יחד עם מעכב טמיפלו neuraminidase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט המתחמים הבאים לפי סדר רציף הבא בשקופית אחרת מיקרוסקופ: 1μL DAKO + 1μL של 4-MUNANA + 2 μL של LPS + 1 μL של טמיפלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוזים טמיפלו הם מראש שהוכנו 1x טריס בופר סליין pH 7.4, הריכוז הסופי של תרכובות במגע עם תאים חיים בשקופית זכוכית עגול יהיה גורם לדילול של 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.2 עד 3.1.4 לעיל. </li></ol> 4. קביעת ריכוז של מעכבי צורך לעכב 50% פעילות Sialidase (IC 50) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את פלורסנט סביב התאים, התמונות מנותחות באמצעות ImageJ 1.38x עם תוסף לנתח את למדידת RBG. קח 50 קריאות נקודה אקראית של הקרינה המקיפה את התאים לחשב את הממוצע של הקרינה הכוללת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IC 50 מופק מגרש של ריכוז מעכב המרה יחידות יומן (למשל, יומן ng / mL) על ציר ה-x נגד הקרינה אומר על ציר ה-Y באמצעות רגרסיה ליניארית. </li></ol> 5. סודות להצלחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי התאים בתרבית הם זיהום ללא mycoplasma. אנו משתמשים באופן שגרתי Plasmocin במדיום תרבות לשלוט על זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצע neuraminidase מלאכותית, 4-MUNANA, יש להשתמש מוכן טרי. המצע מוכן ניתן להשתמש תוך שבוע עבור assay sialidase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם שורת תאים יש ביטוי נמוך קולטן על פני התא, אפשר להשתמש מינון גבוה יותר של ליגנד לגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנו ניסיון גם כי תאי passaged במשך 6 פעמים עלול לאבד פנוטיפ הקולטן שלהם. טרי, תאים לתחייה צריך להיות תרבותי. </li></ol> 6. נציג תוצאות ראה פרוטוקול אנימציה של assay sialidase עם תוצאות נציג המצורף <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2142/szewczuk_JoVE_sialidase_assay.pptx">קובץ Powerpoint</a> .

<ol><li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+desialylation+of+sialyl+alpha-2%2C3-linked+beta-galactosyl+residues+of+TOLL-like+receptor+4+is+essential+for+receptor+activation+and+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling.</a> Cell Signal. 22, 314-324 (2010).</li>
<li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+pathogen+molecule-induced+Toll-like+receptor+activation+and+cell+function+on+Neu1+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase.</a> Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).</li>
<li>Woronowicz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+neurotrophic+factor+activation+of+Trk+tyrosine+kinase+receptors+on+cellular+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase.</a> Glycobiology. 17, 10-24 (2007).</li>
<li>Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+Sialidase+and+Matrix+Metalloproteinase-9+Cross-talk+is+Essential+for+Neurotrophin+Activation+of+Trk+Receptors+and+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling.</a> Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).</li>
<li>Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoquinone+from+nutraceutical+black+cumin+oil+activates+Neu4+sialidase+in+live+macrophage%2C+dendritic%2C+and+normal+and+type+I+sialidosis+human+fibroblast+cells+via+GPCR+G%CE%B1i+proteins+and+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9.</a> Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).</li>
<li>Seyrantepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Phagocytosis+in+Macrophages+by+Neuraminidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).</li>
</ol>

SRA ו PJ תרמו באותה מידה מחברים הראשון.

השימוש assay החדש שפותח כדי לזהות פעילות sialidase בתאים macrophage לחיות 2, השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לזהות פעילות sialidase בפעילות ליגנד-Induced sialidase ב לחיות BMC-2 תאים macrophage באופן תלוי מינון, כמו גם ב לחיות DC-2.4 התאים הדנדריטים , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 תאים אדנוקרצינומה החלב, WT האדם 1140F01 ו WG0544 סוג תאים פיברובלסטים אני sialidosis. מעכבי neuraminidase כמו טמיפלו (oseltamivir פוספט) עכבות thymoquinone-Induced פעילות sialidase ב לחיות BMC-2 תאים עם...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-MUNANA</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation, מדיום סמיך להרכבת דגימות פלואורסצנטיות</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)</td><td>Hoffmann-La Roche AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

איתור פעילות neu1 sialidase בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

היונקים קולטני Toll-כמו (TLRs) הם משפחה של קולטנים המזהים פתוגנים הקשורים דפוסי מולקולרית. לא רק TLRs חיישנים מכריע של חיידקים (כגון וירוסים, חיידקים טפיל) זיהומים, הם גם ממלאים תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיה של מחלות זיהומיות, מחלות דלקתיות, ואולי גם מחלות אוטואימוניות. לפיכך, עוצמת ומשך תגובות TLR נגד מחלות זיהומיות חייבים להיות מבוקרים היטב. מכאן להבנת השלמות המבנית של קולטנים חיישן, אינטראקציות ליגנד שלהם ורכיבים איתות חיוני להגנה החיסונית שלאחר מכן. זה יהיה גם לספק הזדמנויות חשובות עבור שינוי המחלה באמצעות מניפולציה חיישן. למרות מסלולי איתות של חיישנים TLR מאופיינים היטב, הפרמטרים השליטה אינטראקציות בין חיישנים ligands שלהם נותרו מוגדרות היטב. זיהינו לאחרונה מנגנון חדשני של הפעלת TLR על ידי ליגנד הטבעי, שלא נצפתה בעבר 1,2. זה מצביע על כך ליגנד-Induced ההפעלה TLR נתונה לפיקוח הדוק על ידי הפעלת Neu1 sialidase. יש לנו עוד דווח כי Neu1 בחוזקה מווסת רצפטורים neurotrophin כמו TrkA ו TrkB 3, אשר כרוך Neu1 והמטריקס metalloproteinase-9 (MMP-9) צולבות לדבר מורכב עם קולטנים 4. Assay sialidase כבר בתחילה להשתמש כדי למצוא thymoquinone רומן, ליגנד, בשנת ההפעלה של sialidase Neu4 על פני התא של מקרופאגים, תאים דנדריטים ותאי פיברובלסטים דרך GPCR Gαi חלבונים MMP-9 5. עבור קולטני TLR, הנתונים שלנו מצביעים על כך Neu1 sialidase כבר מורכבים עם קולטני TLR-2, -3 ו -4, והוא המושרה על הכריכה ליגנד לקולטן אחד. הופעל Neu1 hydrolyzes sialidase sialyl α-2 ,3-linked β-galactosyl שאריות רחוקים ליגנד מחייב להסיר hinderance סטרית כדי dimerization TLR-4, MyD88/TLR4 גיוס מורכבים, ההפעלה NFkB ופרו דלקתיים תגובות התא. בדו&quot;ח משותף, sialidase Neu1 הוכח להסדיר phagocytosis בתאים macrophage 6. יחדיו, assay sialidase סיפק לנו תובנות רבות עוצמה המנגנונים המולקולריים של הפעלת ליגנד-Induced הקולטן. למרות הקשר המדויק בין sialidase Neu1 ואת ההפעלה של TLR, TRK קולטנים טרם הובהר באופן מלא, זה היה לייצג גישה חדשה או חלוצית מסלולים תקנה התא.

Assay sialidase היא גישה טכני פשוט כי יהיה להבהיר המנגנון המולקולרי רומן (ים) של חיישנים TLR של זיהומים מיקרוביאליים ומעורבות מחלות דלקתיות ברמת הקולטן על פני התא של מקרופאגים לחיות.

איתור פעילות Neu1 Sialidase בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן

קולטני Toll-like (TLRs) בינקים הם משפחה של קולטנים המזהים תבניות מולקולריות הקשורות לנתיב פתוגני. TLRs אינם רק חיישנים קריטיים של...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את השראת הפעילות של cellular new one sase בתגובה לקשירת ליגנד לקולטן הספציפי שלו. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול תאים על למסות זכוכית מעגליות בקוטר 12 מילימטר בתוך פלטת תרבית רקמות בעלת 24 בארות למשך 24 שעות. כשלב שני, התאים החיים ההודבקים למסת הזכוכית מובאים למגע ישיר עם תערובת שהוכנה מראש של סובסטרט של sase וליגנד של הקולטן, עם או בלי מעכבים ספציפיים, על גבי למסת מיקרוסקופ.את זכוכית העצירה מניחים מיד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי על מנת להדגים ולתעד באופן דיגיטלי את תמונות הפלואורסצנציה. עם הזמן מתקבלות תוצאות המראות שינויים בפעילות של new one sase על פני השטח של התא, הקשורה לתאים חיים שעובדו עם הליגנד, בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנציה הכחולה המקיפה את התאים תחת מיקרוסקופיית epi fluorescence.היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אנליזה ספקטרופוטומטרית, הוא שימוש בכמות מופחתת של ריאגנטים. כמו כן, ניתן לצפות וללכוד תמונות של פעילות sase בתאים חיים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון בחינת אינטראקציות פוטנציאליות וחדשניות בין ליגנד לרצפטור, וכן בחינת ההשפעות של מעכבי אנזימים או חלבונים ספציפיים על הפעלת רצפטורים.את הפרוצדורה ידגימו ד"ר Ray Amit וד"ר PT Gath, סטודנטים לשעבר לתואר PhD מהמעבדה שלי, המשתמשים בסבב בדיקות זה במחקריהם. לפני החייאת תאי מקרופאג קפואים, הכינו מצע תרבית באמצעות delcos מסונן סטרילית, modified eagles medium מועשר ב-10% fetal bovine serum וב-5 µg/mL של האנטיביוטיקה plasmin. לאחר מכן, הוסיפו 4 mL של מצע התרבית לבקבוק תרבית תאים של 25 cm² עבור כל מבחנה של תאים קפואים; הוציאו את מבחנת התאים הקפואים מהמקפיא של 80°C- והפשירה אותם במהירות על ידי חימום בידיים תחת מנדף ביו-סכנה סטרילי.תהליך זה יארך כשלוש עד שתי דקות. ברגע שהתאים הופשרו, השתמשו בפיפטה סטרילית של 1 mL כדי להעבירם במהירות לבקבוק תרבית התאים המכיל את המצע המותנה. הניחו את הבקבוק המכיל את התאים באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide באמצעות מיקרוסקופ הפוך.בדוק את התאים מדי יום כדי לוודא צמיחה והיצמדות עד שיגיעו ל-75% עד 90% התמסרות (confluency), מספר ימים לפני זריעת התאים לבדיקת ה-SASE. הכן את הלמיות הזכוכית העגולות בקוטר 12 מילימטר שבהן ייזרעו התאים, בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.הניחו את העגילות בצלחת פטרי גדולה מזכוכית ועקרו אותן על ידי טבילה ב-100% ethanol למשך שעה אחת. הסירו את האלכוהול והשאירו את העגילות הרטובות חשופות לזרם האוויר המסונן והסטרילי בארון תחת UV למשך 24 שעות או עד שיהיו יבשות להזריעה. ראשית, עקרו פינצטה מסוררת מעוקלקת מאותו פלדת אל-חלד באורך ארבעה אינץ' על ידי שריפה בלהבה.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להניח בזהירות סלייד זכוכית עגול וסטרילי בודד לתוך כל באער של פלטה פוליסטירנית לתרביות רקמה עם תחתית שטוחה בעלת 24 באערים. באמצעות פיפטה סטרילית של 5 מיליליטר, הסירו את מצע ה-DMEM המותנה מהבקבוק עם תאי המקרופאגים הדבקים. שטפו את התאים פעם אחת עם 1x sterile tris buffered saline pH 7.4 כדי להסיר כל מצע המכיל סרום.בשלב הבא, הוסיפו 1 mL של תמיסת saline buffered phosphate נטולת פוספט עם סידן ב-pH 7.4. הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך כ-10 דקות או עד שהתאים יתחילו להתנתק מדופן הבקבוק. לאחר שהתאים התנתקו, הוסיפו 3 mL של מצע DMEM conditioned לתאים התלויים.לאחר מכן, העבירו 0.5 milliliters של התרחיף עם כ-0.5 מיליון תאים לכל זכוכית כיסוי עגולה בקוטר 12 millimeter בתוך פלטת 24 בארות. הדגירו את פלטת תרבית הרקמה המכילה את תאי המקרופאג בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 24 שעות, כדי לאפשר לתאים להיצמד לזכוכית הכיסוי העגולה. הבדיקה לפעילות sase תבוצע תחת שלושה תנאים שונים בשלוש זכוכיות כיסוי נפרדות עבור המיקרוסקופ. בזכוכית הראשונה, המשמשת כביקורת שלילית.תאי ביקורת נחשפים לתמיסת קיבוע, לתשתי של נוירומינידאז עבור ANA ולסליין בבופר טריס, אך לא לליגנד של קולט TLR, LPS. בפריזית השנייה, התאים נחשפים לתמיסת קיבוע, לליגנד של קולט TLR, LPS ולסליין בבופר טריס.בשקופית השלישית, התאים נחשפים לתוסף קיבוע עבור ANA, LPS Tris, תמיסת סליין מחוצעת, ומעכב נוירמינידאז Tamiflu. נדגים את הפרוצדורה עבור הבדיקה השנייה בלבד, מכיוון ששלוש הבדיקות נבדלות רק בתערובת התרכובים על שקופית המיקרוסקופ. הניחו את שקופית המיקרוסקופ על משטח העבודה במעבדה והוסיפו את התרכובים הבאים בסדר עוקב.מיקרוליטר אחד של תמיסת קיבוע, לאחר מכן מיקרוליטר אחד של פורמלין, שני מיקרוליטרים של LPS ולבסוף, שלושה מיקרוליטרים של tris buffered saline, pH 7.4. לאחר מכן, הסירו את המצע מבאר אחת בלוח 24 הבארים המכיל את התאים. השלב הבא הוא החלק הקשה ביותר בהליך זה, שכן עליכם להסיר את כיסוי הזכוכית העגול מהבאר של לוח תרביות הרקמה באמצעות פינצטה, מבלי לשבור אותו, בעזרת פינצטה באורך ארבעה אינצ'ים.הרימו בעדינות את השקף המעגלי לפינת הבאר, ולאחר מכן הסירו אותו בזהירות והניחו את השקף כשהתאים פונים כלפי מטה לתוך תערובת התמיסות. קחו את שקף המיקרוסקופ מיד למיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי (epi fluorescent) שהוגדר למסנן UV ומצויד במצלמה דיגיטלית לצילום תמונות פלואורסצנטיות. התמקדו במיקרוסקופ תחת ניגודיות פאזה (phase contrast) עד שתוכלו לראות את התאים, ולאחר מכן עברו למצב פלואורסצנטי.רכשו תמונות של התאים במצב פלואורסצנציה לאחר דקה אחת, שתי דקות ושלוש דקות. בנוסף, רכשו תמונה בודדת של התאים בייצוג של ניגוד מופע (phase contrast). תוצאות של ניסוי sase assay מוצגות כאן.ראשית, כביקורת שלילית, תאים חיים שהודבקו לשקף זכוכית הוכנסו למגע ישיר עם תערובת נקודתית של מדיום קיבוע ותסבסב (substrate) לצורך בדיקת פעילות IP sase. התסבסב יעבור הידרוליזה כדי להפיק ethyl lum beone חופשי, בעל פליטה פלואורסצנטית ב-450 nanometers בעקבות עירור ב-365 nanometers, שנמדדה שתי דקות לאחר הוספת התסבסב.תמונה פלואורסצנטית זו אינה מראה פעילות sase מסביב לתאים. התמונה הבאה מראה את התוצאות של בדיקת SASE חיובית, שבה תאים חיים שהודבקו למשטח זכוכית הוכנסו במגע ישיר עם תערובת נקודתית של מדיום קיבוע, substrate 4 וליגנד TLR 4 מסוג LPS. ה-substrate עבר הידרוליזה על ידי אנזים sase כדי להפיק ethyl lum beone חופשי, והתמונה הפלואורסצנטית שצולמה שתי דקות לאחר הוספת ה-substrate וה-LPS מעידה על רמות גבוהות של פעילות sase מסביב לתאים.עם זאת, כאשר תאים חיים הועמדו במגע ישיר עם תערובת נקודתית של מדיום קיבוע מהסובסטרט הננוי, ליגנד TLR 4 מסוג LPS, וכן מעכב נוראמינזידאז, Tamiflu, נשגגה פעילות ה-sase באופן משמעותי או שלא זוהתה עוד, בהתאם לריכוז המעכב. לבסוף, גרף זה מציג את ריכוז העכבה של 50% (IC50) של Tamiflu ושל Oseltamivir carboxylate, שנקבע על ידי שרטוט הירידה בפעילות ה-sase אל מול הלוגריתם של ריכוז החומר; הפלואורסצנציה הממוצעת מסביב לתאים עבור כל קבוצה נמדדה באמצעות תוכנת Image J. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לתרבית את התאים על לוחות כיסוי מזכוכית עגולים בצלחות תרבית רקמה של 24 בארים, 24 שעות לפני תחילת בדיקת ה-Sade.בנוסף, יש להכין את כל הרכיבים המשמשים בבדיקה זו לפני תחילת הבדיקה.

detection-neu1-sialidase-activity-regulating-toll-like-receptor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים בדיקה לבחינת הפעילות התלויה בקולטן דמוי אגרה (TLR) של גורמי השעתוק גורם גרעיני-קאפה-B (NF-κB) וחלבון מפעיל -1 (AP-1) במקרופאגים. ה-TLRs מפעילים מפל איתות פרו-דלקתי בעת זיהוי דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק (DAMPs), ומפעילים NF-κB ו-AP-1. המקרופאגים המהונדסים מייצרים אנזים אלקליין פוספטאז עוברי מופרש (SEAP) בהפעלת NF-κB ו-AP-1, אשר מזוהה באמצעות תגובה כרומוגנית.

בדיקה עבור NF-&kcy--תלוי TLR;B/AP-1 איתות גורם שעתוק במקרופאגים

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת תאים של כתב לסינון ננו-חלקיקים ביו-אקטיביים פוטנציאליים המעכבים איתות קולטן דמוי אגרה (TLR). הבדיקה כוללת החדרת ליפופוליסכרידים (LPS) מעורבבים עם כלאיים של ננו-חלקיקי פפטיד זהב למקרופאגים המבטאים את חלבוני הכתב - פוספטאז אלקליין עוברי מופרש (SEAP) ולוציפראז. הפחתת אות ה-TLR המושרה על ידי LPS בתיווך ההיברידים נקבעת על ידי מדידת אותות המדווח.

בדיקה לסינון ננו-חלקיקים ביו-אקטיביים לעיכוב איתות קולטן דמוי אגרה

תאים דנדריטים (DC) להפריש IL-1β בתגובה להכרה TLR8 של פורין הסינתטי, R848, ואחרי הפעלת inflammasome NLRP3 עם nigericin, ולכן, IL-1β יכולים לשמש למדידת פעילות inflammasome NLRP3. צביעה תאית ציטוקינים, immunoblotting, וELISA משמשים למדידת inflammasome NLRP3 תחול והפעלה באמצעות ביטוי IL-1β במדויק.

הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

אנו מתארים שיטה מבוססת HPLC לקביעת חומצה N-acetylneuraminic ו- N-glycolylenuraminic חומצה בכבד העכבר חלב.

קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של סוג הבר<em&gt; CMAH</em&gt; נוק- out עכברים.

כמו קולטן קולטן (TLR) איתות משחק תפקיד חשוב פתופיזיולוגיה של מחלות דלקתיות רבות של האדם, ואת הסדרת תגובות TLR על ידי חלקיקי ביו צפוי להיות מועיל בתנאים דלקתיים רבים. תאי ה- THP-1 מבוססי תאים מספקים פלטפורמה סינון רב-תכליתי וחזק לזיהוי מעכבים חדשים של איתות TLR.

הקרנת חלקיקים ביואקטיביים בתאי החיסון Phagocytic עבור מעכבי איתות כמו קולטן איתות

MALT1 מסדיר מולדת חסינות אך איך זה מתרחש נשאר מעורפל. השתמשנו החומר המדכא paracaspase סלקטיבית MALT1 הטכנולוגי-827 לפענח את התרומה של MALT1 איתות מולדת במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי כמו אגרה או C-type, הוכחת MALT1 מסדיר את הייצור של תאים מיאלואידים ציטוקינים, ויוצאת של קולטני לקטין דמוי C-type, באופן סלקטיבי.

תאים מיאלואידים מולדת איתות לשביל רגולציה על-ידי פעילות Paracaspase MALT1

פרוטוקול זה מספק לחוקרים עם שיטה מהירה, עקיפה של מדידת tlr תלויי-NF-кb/AP-1 הפעילות שעתוק בשורה מקרופאג cell מורה בתגובה למגוון של משטחים פולימריים ושכבות חלבון נספחת כי המודל ביומיהמיקרוסביבה השתל ביומטריה.

תא עיתונאי מקרופאג שיטה לבחון קולטן שיחת כמו-תיווך NF-kB/AP-1 איתות על שכבות חלבון Adsorbed על משטחים פולימריים

פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

מוצג פרוטוקול ייחודי ומקיף ליצירת תאים דנדריטיים אנושיים שמקורם במונוציטים אנושיים (mo-DCs) מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים (PBMCs) באמצעות טיפול בסיאלידאז. יתר על כן, מתוארות שיטות להערכת האפיון הפנוטיפי והפונקציונלי של mo-DCs ולהעריך כיצד טיפול בסיאלידאז משפר את רמת ההתבגרות של mo-DCs.

יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים עם פנוטיפים סיליליים שונים

כאן, אנו מציעים פרוטוקול פשוט המשלב הנדסת אוליגוסכריד מטבולית, כימיית קליקים ומיקרוסקופ הרחבה המאפשר הדמיה ביולוגית של N-גליקופרוטאינים תוך-תאיים עם רזולוציה משופרת באמצעות ציוד מיקרוסקופיה שגרתי.

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

חקור פעילות סיאלידאז בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן במקרופאגים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי תגובות תאיות ומנגנוני מערכת החיסון.

איתור פעילות Neu1 Sialidase בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן

גלה סרטונים נוספים