הזרקת. עוברים stephensi ליצור מלריה עמידים יתושים

בכל 15 שניות, ילד אחד בעולם מת ממלריה; כאן במעבדתו של ג'יימס, אנו מנסים ליצור יתושים שאינם יכולים להנחית את טפיל המלריה. שמי הוא TIUs. אני נמצא כאן באוניברסיטת קליפורניה ארווין, במחלקה לביולוגיה מולקולרית וביוכימיה, במעבדה של אנתוני ג'יימס.

היום אראה לכם כיצד להכין עיני יתושים טראנסגניות ולא-טראנסגניות. אנו עושים זאת כדי להפוך יתושי מלריה לעמידים, כך שלא יוכלו לשאת את טפיל המלריה. כעת הכנתי מבחנה עם בופר איזוטוני שבו היתושים יטילו את ביציהם.

אני אשתמש בשואב זה כדי לשאוב את היתושים ולהעבירם למבחנה. את המבחנה נכניס למדגרה בטמפרטורה של 30 °C, ונשאיר אותה שם במשך כשעה בתוך כוס. כעת נשלוף את מחטי המיקרו-הזרקה.

אלו מחטים העשויות קוורץ ועלינו להשתמש בקצה דק מאוד. לכן, אנו זקוקים למותח מחטים זה. אנו משתמשים במותח מחטים מבית Suter Instruments וכן במחטים מבית Suter Instruments.

כעת אוציא את היתושים ואני אניח את הביצים בתוך צלחת פטרי שבה נמצא נייר סינון ספוג בבופר איזוטוני, וזאת כדי לשמור על העוברים רטובים במהלך תקופת ההזרקה. כמות המים על נייר הסינון היא קריטית; אין להגיע למצב שבו הביצים צפות, אך גם אסור שהנייר יתייבש.

כעת אעביר את העובר מנייר הביצים לדף נייר Watman בעובי 3 מ"מ נוסף, שהספג בבופר איזוטוני. שלב זה נועד להסיר את הקוריון לפני יישורם להזרקה מיקרוסקופית. כעת אסיר את הקוריון, שהוא השכבה כסופית שעל הביצים.

ואני עושה זאת על ידי הסרתם בעזרת המברשת שלי. כאן למעלה יש לנו עובר שבו ה-Corian עדיין נמצא, ויש לו את החלק הכסוף והמבריק הזה. היכן נמצא זה שמתחתיו?

הצלחתי להוציא את ה-Corian; החלק העליון כנראה יחליק על סרט, בעוד שהחלק התחתון יידבק. וזהו הדבר החשוב כשמבצעים צד לא אחיד. כעת אני מיישרת את העוברים.

העוברים רחבים יותר בקצה הקדמי, ואותו אני מציב לימין. משמאל נמצא הקצה האחורי, שהוא דק יותר ושם אני אזריק את העוברים. אני מנסה לסדר אותם יחד כך שיסייעו זה לזה להישאר במיקומם.

בדרך כלל אני מעבירה כ-10 בשורה אחת. כעת יש לי שורה של עוברים, ואני אעביר אותם לזכוכית כיסוי. על זכוכית הכיסוי.

הדבקתי סרט דבק לפאות כדי שהם יידבקו. לאחר מכן, אייבש את נייר הסינון עליו מונחים העוברים באמצעות נייר סינון נוסף, אעביר את העוברים לזכוכית כיסוי ואמתין 30 שניות לייבוש לפני יישום השמן. כעת סידרנו את העוברים והם נמצאים תחת השמן.

על משטח המיקרוסקופ, נזריק DNA מעורבב עם צבע מאכל באמצעות קצה מיוחד זה של תבנית המיקרובים, ונזריק זאת אל תוך מחטי הנמלים. כעת מילאנו את המחט והחזרנו אותה למיקרו-מזרק. כעת אנו מוכנים לבצע את ההזרקות המיקרוסקופיות.

כעת אני מזיזה את המחט כדי להחדדה, כך שאוכל לראות אותה ממוקדת. לאחר מכן, אני מזיזה מחט משקולת, ומקרבת את העוברים וממקדת גם אותם. כשזה מסתיים, אני מזיזה שוב את המחט עד שהיא ממוקמת במיקומה, ואז אני נעה לעבר העוברים שלי.

כעת, כאשר המחט עוברת דרך השמן, התמונה הופכת למטושטשת ויש לכוון אותה שוב. כך בדיוק זה נראה. בדיוק, תקתוק של כריש.

וכעת אני מוכן לבצע את ההזרקות. ניתן לראות שנגעתי בעובר עם המחט, ובכך שברתי את הקצה, וניתן לראות טיפה קטנה שיוצאת וזו שתוזרק אל תוך העובר. כעת מזריקים ומוציאים את המחט שוב.

ואני בודקת בכל פעם בין עובר לעובר שטיפה קטנה יוצאת לקצה המחט. וכפי שניתן לראות, אני צריכה לכוון מחדש עבור כל עובר כדי להגיע למיקום מדויק. כעת, זהו דלף.

כפי שניתן לראות, כאשר אני מבצע את ההזרקה השנייה בתוך השמן, הבועה הופכת לגדולה מאוד ואני צריך לכוון מחדש את הלחץ של המיקרו-מזרק. כעת סיימנו את ההזרקות המיקרוסקופיות ואנו נעביר את העוברים מהמיקרוסקופ אל צלחת הפטרי, שמילאנו בבופר איזוטוני. אני אנגב את השמן מהזכוכיתית והגזר אותה לחלק קטן, שאני מניח בתוך צלחת הפטרי.

כעת נשאיר אותם כאן עד סוף היום בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, נעביר אותם לאינקובטור. היום הדגמתי בפניכם כיצד להזריק תמיסת dsRNA כדי ליצור בניו-יתושים זמניים.

כעת עלינו להמתין רק עד שכל הזחלים יבקעו. נגדל אותם לשלב הבגרות ואז הם יזדווגו. לאחר מכן, יעברו שלושה שבועות לפני שנוכל להתחיל בבדיקה כדי לקבוע אם הם Refactor או לא.