הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מטריצות גמישות (compliant) לצורך ויסות וכימות של התכווצות תאית. דבר זה מושג תחילה על ידי הפעלת לכיסוי זכוכית (cover slip) כדי לאפשר עיגון של המטריצה. השלב השני של הפרוצדורה הוא פולימריזציה של ג'ל פוליאקרילאמיד אל לכיסוי הזכוכית המופעל.

השלב השלישי של הפרוטוקול הוא זריעת התאים על הג'ל והמתנה להיצמדותם. השלב הסופי של הפרוטוקול הוא הדמיית הג'ל כדי להפיק נתונים שינותחו באמצעות פרוטוקולים של מיקרוסקופיית כוחות מתיחה (traction force microscopy). בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות תאים המפעילים כוחות מתיחה על המטריקס שלהם באמצעות מיקרוסקופיית כוחות מתיחה.

שלום, אני איבון איונס מהמעבדה של מרגרט ELL במחלקה לפיזיקה ובמכון לדינמיקה ביופיזית באוניברסיטת שיקגו. אני סטיבן וינטר, גם אני ממעבדת Guard. היום נרצה להראות לכם פרוטוקול להכנת מטריצות גמישות למדידת התכווצות תאית.

אנו משתמשים בפרוצדורות אלו במעבדה שלנו כדי לחקור רשתות של actin myosin מתכווצות. אז בואו נתחיל. לפני הפעלת לוחות כיסוי, הניחו מראש מספר לוחות כיסוי בגודל 22 על 40 מילימטר, מספר 1.5.

שטפו ב-70% ethanol במעמד נירוסטה כך שכיסויי הזכוכית (cover slips) יהיו במרווחים זה מזה ולא ייגעו זה בזה. בעבודה תחת מנדף כימי, הכינו תמיסת 2% three or minor profile trimeth ב-isopropanol בתוך צלחת זכוכית מרובעת. השתמשו בפיפטת זכוכית מסוג pasta כדי להוסיף את ה-three or minoro profile.

בשל תגובתיות לפלסטיק, טבול את לוחות הכיסוי באופן מלא בתמיסת Trimeth oxy והדגש אותם למשך 10 דקות תוך ערבוב על פלטת ערבוב במנדף. לאחר ההשריה, שטוף את לוחות הכיסוי על ידי טבילה במים מזוקקים פעמיים. החלף את המים ארבע פעמים; לאחר ההחלפה האחרונה, המצב מוכן.

השרו את הזכוכית למשך 10 דקות תוך כדי ערבוב. לאחר מכן, ייבשו את לוחות הכיסוי באינקובטור בטמפרטורה של בערך 37 °C למשך 10 דקות. לאחר הייבוש, הניחו להם להגיע לטמפרטורת החדר.

טבלו את לבישי הזכוכית (cover slips) בתמיסת Glutaraldehyde בריכוז 1% במים מזוקקים פעמיים. השתמשו בכלי זכוכית מרובע על גבי מעבנ שקיפה למשך 30 דקות. ודאו שאתם משתמשים בכלי נקי.

אחרכך, התמיסה עלולה להיראות עכורה. שטפו את לוחות המכסה בשלושה סבבים של מים מזוקקים פעמיים למשך 10 דקות לכל סבב תוך כדי ערבוב. לאחר מכן, כסו את לוחות המכסה בנייר אלומיניום כדי למנוע הצטברות אבק והניחו להם להתייבש בטמפרטורת החדר.

לאחר הייבוש, יש לאחסן את לביבות הכיסוי במקום יבש הרחק מאבק למשך עד חודשיים. להכנת ג'ל פוליאקרילאמיד או PAA, הכין תחילה תמיסות מלאי של Acrylamide bis. ערבב Acrylamide מ-40% acrylamide ו-2% bis acrylamide כפי שמתואר בפרוטוקול ה-RI.

בצעו דגזציה (DGA) לתמיסת האקרילאמיד בתא ואקום למשך 20 דקות. פעולה זו מפחיתה את רמת החמצן בתוך הג'ל, דבר המונע פולימריזציה. במקביל, הכינו תמיסת 암מוניום פרסולפט (ammonium per sulfate) או תמיסת PS בריכוז 10%.

לאחר מכן, נגבו זכוכיות מיקרוסקופ בגודל one by three inch בעזרת מגבונים של Rain X כדי להפוך את פני השטח של הזכוכית להידרופוביים. הסירו אבק בעזרת Kim wipe כדי להבטיח פני שטח חלקים לג'ל. כסו את הזכוכית בנייר אלומיניום והניחו בצד.

לאחר מכן, הוצא את תמיסת האקרילאמיד מתא הוואקום והוסף חרוזי פלואורסצנציה. כדי להתחיל את פולימריזציית הג'ל, הוסף 0.75 µL של TM E ו-2.5 µL של 10%a PS. ערבב את התמיסה קצרות באמצעות שאיבה ודחיפה עם פיפט. לאחר מכן, העבר 10 עד 12 µL של תמיסת האקרילאמיד לזכוכית המיקרוסקופ ההידרופובית שהוכנה קודם לכן.

הנח זכוכית כיסוי מופעלת בגודל 22 על 40 מילימטר מעל הטיפה. תמיסת הג'ל צריכה לצפות את כל זכוכית הכיסוי. החלק בועות שעלולות להופיע בתוך התמיסה.

הניחו לתמיסת הג'ל להתפלמר בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות. לאחר הפולימריזציה, הג'ל יסוג מקצות זכוכית הכיסוי. בעזרת קצה דק של פינצטה, הסירו בזהירות את זכוכית הכיסוי עם הג'ל הדבוק אליה ממשטח זכוכית המיקרוסקופ.

טבלו את הג'ל בצלחת פטרי המכילה מים מזוקקים פעמיים כדי לשמור על פני שטח ג'ל הידרטי לצורך קישור צולב של חלבוני המטריצה החוץ-תאית (ECM) לג'ל. ראשית, הכינו מנות עבודה של 40 µL של sulfur san par על ידי המסה של אבקת SULF san par ב-dimethyl sulf oxide או DMSO אנहाइडרי. לאחר מכן, הסירו את המים המזוקקים פעמיים מפני השטח של הג'ל באמצעות שימוש קצר בספינר לכיסויי זכוכית (cover slip spinner).

יש להקפיד שהג'ל לא יתייבש מיד לפני השימוש. יש לדלל את מנות ה-sulfur sampa DMSO במים מזוקקים פעמיים ולצפות את מרכז פני השטח של הג'ל בכ-200 microliters. לאחר מכן, יש לחשוף את פני השטח של הג'ל לאור UV בתנור UV crosslinker.

לאחר החשיפה ל-UV, טבול את לביבות הכיסוי בב mengangkat עם מים מזוקקים פעמיים טריים. הסר כל תמיסה מפני השטח של הג'ל באמצעות מסובב לביבות כיסוי. לאחר מכן, הנח את ה-param במכל של צלחת פטרי והטף 50 µL של פיברונקטין קר על ה-param.

הפוך את לוכסנית הכיסוי והנח את צד הג'ל מעל הפיברונכטין. הנח ללוכסניות הכיסוי להגיב בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים, או ב-4 °C למשך הלילה. לאחר הדגירה, העבר את הדגימות למנדף סטרילי למטפלות רקמה.

הניחו את לביות הזכוכית (cover slips) בתוך צלחות תרבית רקמה של שישה סנטימטרים המכילות PBS כדי לצפות את הלביות. שטפו את לביות הזכוכית ביסודיות באמצעות מספר החלפות של PBS תחת תנאים סטריליים לאחר השטיפה. סטריליזו את לביות הזכוכית באמצעות טיפול ב-UV למשך 30 דקות.

לאחר מכן, דגרו את לוחות הכיסוי במצע תרבית תאים למשך 30 עד 45 דקות לפני זריעת התאים. בשלב הבא, מקמו לוח כיסוי בגודל 22 על 30 מילימטר על מחזיק לוח הכיסוי העליון של תא דימוי קונפוקאלי מבית Warner Instruments, תוך שימוש בגריז ואקום כדי לקבע את לוח הכיסוי במקומו. הניחו אטם גומי ליצירת תא על גבי לוח הכיסוי, כך שתהיה גישה הן לצינור הפוליאתילן של הכניסה והן לזה של היציאה.

פעולה זו תאפשר מרווח של 150 עד 1000 מיקרון בין זכוכית הכיסוי העליונה לבין זכוכית כיסוי במידות 22 על 40 מילימטר מצופה ג'ל, בהתאם לגודל האטם שבו נעשה שימוש. לאחר מכן, טענו מזרקים המכילים מצע תרבית תאים חמים אל צינור הכניסה באמצעות ערכת המחברים, ובדקו כי מצע התרבית זורם דרך הצינור אל זכוכית הכיסוי העליונה. מרחו גריז ואקום על בסיס התא והכניסו זכוכית כיסוי במידות 22 על 40 מילימטר מצופה ג'ל, כאשר צד התאים פונה כלפי מעלה.

יש להחיל את המצע החם על התאים. מקמו את מחזיק כיסוי הזכוכית העליון על בסיס התא, כאשר אטמי התא מפרידים בינו לבין כיסוי הזכוכית המצופה בג'ל. ודאו שפיני המיקום בבסיס התא יושבים בתוך חורי המיקום בכיסוי הזכוכית העליון.

הנח את לוחית הלחץ על בסיס התא והשתמש במפתח ללוחית הלחץ כדי להבריג ולהדק את לוחית הלחץ. בדוק את זרימת המדיום דרך הפעריות והתא כדי לנטר דליפות פוטנציאליות בתוך התא, וכדי למנוע אזורים נטולי מדיום על פני השטח של התאים.

הצמד את תא הדימוי הקונפוקאלי למתאם הבמה הממוקם בתוך מחזיק המיקרוסקופ כדי לדמות חלבון מסומן פלואורסצנטית וחרוזי פלואורסצנציה המוטמעים בתשתית הג'ל במיקרוסקופ פלואורסצנציה קונפוקאלי, וזאת כדי לקבל תמונה של מיקום החרוזים ללא מאמץ בתוך זרימת הג'ל. בצע שטיפות כדי להפריד הידבקותים תאיים מהג'ל ודמיין את חרוזי הפלואורסצנציה באותו שדה דימוי שבו נמצאים התאים. כאשר הפרוטוקול מבוצע נכון, פני השטח של הג'ל יהיו שטוחים וחלקים יחסית, עם חרוזי פלואורסצנציה המוטמעים באופן אחיד לכל אורכו.

ניתן להדמיות את ה-ECM גם באמצעות אימונופלורסצנציה של פיברונקטין. אם נמדד התכווצות של הג'ל במיקום של היצמדותים מוקדיים (focal adhesions), יש לבצע את הדמיית הג'ל והתאים במישור האופטי הקונפוקלי של ההיצמדותים המוקדיים. כאן, היצמדותים מוקדיים מודמיינים בניסוי של כוח משיכה בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים או תאי U2 OS המסומנים ב-GFP pxi.

ניתן להדמיות את התכווצות הג'ל באמצעות תזוזה של חרוזי פלואורסצנציה מוטמעים מתחת להיצמדותים מוקדיים (focal adhesions). השוואה בין מיקומי חרוזים תחת מאמץ (בצבע ירוק) למיקומי חרוזים ללא מאמץ (בצבע אדום) מאפשרת כימות של תזוזת תשתית הג'ל תחת התכווצות; להלן תוצאה מייצגת של תא פרוס המנותק מפני השטח של הג'ל באמצעות טריפסין. להלן תוצאה מייצגת של השוואה בין מיקומי חרוזים תחת מאמץ למיקומי חרוזים ללא מאמץ.

שימוש באלגוריתמים חישוביים מתוחכמים יכול להניב מאמצי מתיחה הקשורים להעתקת חרוצים ולמודול האלסטיות של הג'לים. מאמצים אלו מוצגים כאן באמצעות מפת צבעים (heat scale map) ווקטורים, כאשר הצבעים החמים יותר במפת הצבעים וחצים גדולים יותר מציינים כוחות חזקים יותר. הרגע הצגנו כיצד להכין מטריצות גמישות למדידת התכווצות תאית בעת ביצוע פרוצדורה זו.

חשוב לתכנן מראש כדי שניתן יהיה לבצע את השלבים הרגישים לזמן במהירות. זהו כל הדבר. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.