Name: הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: למדו פרוטוקול הדמיה לעוברי Drosophila בזקופה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. השיטה מאפשרת מדידות מדויקות של גודל עוברים וכימות רמות חלבון ו-RNA בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים הם אסיר תודה באופן מיוחד דבורה האריס דניאל מק &#39;קיי. תמיכה עבור עבודה זה סופק על ידי המחלקה לביולוגיה במכללה לאמנויות ומדעים של CWRU, ועל ידי מספר מענק HHMI 52005866 לתמיכה של חינוך לתואר ראשון במדעים ביולוגיים.

1. הדמיה מתודולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים גליצרין ג'לי בתוך אמבט 55 ° C מעלות מים 20-30 דקות עד שהוא הופך לנוזל הומוגני. מערבולת, אבל לא לנער את הבקבוק, כדי למנוע היווצרות של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד ג'לי נמס, למרוח שכבה דקה של גליצרול באמצעות Kimwipe בשקופית זכוכית נקי (אופציונלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1-1.5 מ"ל של גליצרין מומסת ריבה באמצעות P1000 לחתוך קצה הפיפטה על פני השטח של השקופית כדי ליצור שכבה ראשונה דקה. פיפטה בזהירות כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו ג'לי לחזק 5 דקות על משטח אופקי, ואז למקם את השקופית ב -20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהמשיך יישור העובר. לחלופין, לכסות את השקופית עם בניילון נצמד ומניחים אותו על 4 ° C עד 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה טיפה קטנה של עוברי הצבעונית גליצרול 70% / PBS או אחרים מבוססי גליצרול antifade התקשורת הרכבה (למשל Slowfade או Vectashield) בצד של תשתית ג'לי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין טרום יישור העוברים בנפרד על ידי העברת אותם מירידה לפני השטח ג'לי. העברת אותם באמצעות מחט המזרק מלוכסנות, באמצעות צד מלוכסנות כמו כפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בערך המקום עוברים לאורך 2-3 עמודים. אם העובר נתקע המחט, מערבבים אותו טיפה המכילה את העוברים אחרים כדי לשחרר אותו. אל תבזבזו זמן בזהירות יישור אותם בשלב זה. תשאיר קצת מקום בין עמודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את העוברים על ידי הזזה אותם במאוזן על המדיום ג'לי בעזרת המחט של המזרק. בעוד הזזה, לכוון את הראשים והזנבות באותו כיוון. לגרום להם מקבילות זו לזו לאורך הטור. הסרה של עודפי גליצרול PBS שמאל כמו שביל עם חתיכת Kimiwipe מעוות. הערה: גליצרול עודף יגרום עוברים להיות עטוף בצורה רופפת בתוך ג'ל, והתוצאה היא הפרדה של שתי שכבות ג'לי, ולכן קשה לגזור הר. לעומת זאת, הסרת גליצרול יותר מדי יהיה יבש לשטח עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קצה צהוב לחתוך להפיץ שכבה דקה של ריבה על עוברי (50-150 μL, תלוי כמה היו מיושרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להחליק במקפיא -20 מעלות צלזיוס 10-20 דקות או לאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא ג'לי הוא קשיח לחלוטין לפני חיתוך. אחרת, בלוק של עוברים יהיה קשה מאוד הבלו. התוצאות הטובות ביותר עבור חיתוך מתקבלים ביום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת בהיקף לנתח, להשתמש סכין גילוח לחתוך לחלוטין דרך ג'לי בשני הצדדים של העוברים בציר. החזק את הסכין בזווית של 90 מעלות כדי לבצע חתכים ישר. הקיצוצים צריכים להיעשות קרוב מאוד הקטבים הקדמי ואת האחורי של עוברים, כדי למנוע ג'לי עודף שעלול להכשיל הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100-200 μL של קר PBT (4 ° C, PBS 0.1% Tween 20) לצד הפחתות בזהירות מגרדים את ג'לי בין העוברים באמצעות מרית. הערה: חומר ניקוי ב PBT עוזר להסיר את ג'לי משקופית מבלי לפגוע בעוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט, להעביר את גוש ג'לי עם עוברי מוטבע לשקופית נקי לחיתוך נוסף. חותכים קוביות קטנות עם עוברי 5-7. השתמש PBT להעביר בקלות סביב הבלוק ג'לי. לחלופין, במקום לחסום על משטח זכוכית יבשה לתת לזה לצרף זכוכית, אשר יוצרת יציבות יותר דווקא זמירה ג'לי, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פליפ זקוף העוברים מוטבע ריבה בעזרת סכין גילוח ומחט. להדמיה תחת מיקרוסקופ, להמשיך עם אחד משני הצעדים הבאים, בהתאם לסוג של מיקרוסקופ לעמוד בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ הפוך: במקום סיים בלוקים העובר על coverslip רב, עם עוברים בתנוחה זקופה. ודא שהצד של העובר עם סכום של לפחות ג'לי יהיה במגע קרוב עם יעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ זקופה: לעשות שתי ערימות עם ארבעה # 1 coverslips מודבק עם דבק מגע כדי לשמש "תומך" והמקום לחסום העובר בתוך גליצרול בין "תומך". גשר ערימות באמצעות coverslip ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח confocal, לבדוק את מרחק העבודה של מטרות לשמש כדי לברר אם אתה יכול תמונה לאורך כל הדרך העובר או באופן חלקי בלבד. לדוגמה, ד עוברים melanogaster יש ~ 0.55 מ"מ באורך ניתן הדמיה לחלוטין באמצעות תוכנית Zeiss 20x-Apo או 40X LD ניאו פלואוריד אובייקטיבי. האתר הבא יש מידע על יעדים Zeiss זמין נותן לך את האפשרות לחפש יעדים על פי מרחקי עבודה: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. נציג תוצאות מכיוון העוברים נותרים שלמים, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לקחת מידות מדויקות של גודל העובר ואת המרחקים בין דפוסי ביטוי גנים. באיור 1, אנו מראים שלב blastoderm עוברים מוכתמות DAPI כתם גרעיני (כחול), אנטי הגב חלבון (אדום), mRNA SOG (צהוב) ו-mRNA SNA (ירוק). מורפולוגי procesSES, כגון invagination של והמזודרם (איור 2 א ', ב') הגירה של תאים mesodermal (איור 3 ו 4) יכול גם להיות דמיינו באמצעות שיטה זו. Z-עמדות שונות לאורך ציר DV ניתן להשיג על ידי שינוי מישור המוקד, כפי שמוצג איורים 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. זקופה פרוסה אופטי של העובר תקין בשלב blastoderm. מכתים כפולה עבור ה-mRNA וחלבון. MRNAs יעד של בדיקות באתרו (SOG ו SNA) וחלבון מוכתם על ידי נוגדן ראשוני (אנטי הגבי) מסומנים בתרשים. DAPI שימש התווית גרעינים. ראוי לציין, כי הביטוי של SOG ו SNA ממוקמים apically בציטופלסמה, תוך הבעת הגבי הוא גרעיני. אותות חזקים מהתעתיק SOG המתהווה הממוקמים גרעינים ניתן לראות בהגדלה זו. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. הדמיה של העובר זקופה gastrulating ללא פגע. בדיקות ה-mRNA השתמשו בצבעים שלהם מצוינים באיור. א) שים לב כי בשלב זה, שלושה גנים מוכתם פלואוריד זהה (SNA, SOG ו DPP, בירוק), באים לידי ביטוי בתחומים מופרדים מרחבית. והמזודרם invaginating מבטא SNA, שכבת neuroblast מבטא ind ו האאקטודרם מבטא DPP, ואילו הביטוי SOG עדיין קיים באזורים הגחון של מערכת העצבים. ב) מטוס confocal עמוקה יותר של העובר אותו, נציין את בסיס והמזודרם invaginating בתוקף מבטא SNA, אבל האזור apical שלה מבטאת רמות נמוכות יותר. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. הדמיה של העובר זקופה שלם עם הלהקה המורחבת נבט SOG RNA (צהוב). חילזון, ind ו mRNAs DPP (ירוק), חלבון הגבי (אדום). גרעינים הוכתמו DAPI (כחול). א) משטח הפוקוס ליד ראש העובר. ב) אחר המטוס מוקד באזור הגזע של העובר אותו. הערה גוש של תאים mesodermal לפני הגירה לרוחב (להשוות איור 4) שוכב קרוב לקו האמצע הגחון משני צידי העובר נבט-band המורחבת. Neuroblasts Delaminating מסומנים בירוק (ind ו SNA). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. הדמיה זקופה של העובר ללא פגע במהלך הארכה הלהקה נבט SOG RNA (צהוב). חילזון, ind ו mRNAs DPP (ירוק), חלבון הגבי (אדום). א) שים לב neuroblasts delaminating מן האפיתל (חץ), מוכתם הן ind ו SNA בשלב זה (ירוק). הערה גם את הביטוי מוגבל של SOG אל קו האמצע הגחון (צהוב). הביטוי של DPP בשלב זה ניתן לראות בצדדים רוחבי של העובר (כוכבית). ב) סעיף אופטי בעובר אותו מוצג לקראת סוף אורך העובר, המתאימה לאזור אמצע האחורי. התאים קו האמצע הגחון מוכתמות עבור SOG.

<ol><li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li>
<li>Grβhans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li>
<li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bryologist%22%5BJournal%5D)">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li>
<li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לקיחת תמונות חתך של עוברים תסיסנית יכול להיות מאתגר, כיוון שהיא דורשת דיסקציה זהירה של יד 2 פרוסות או שימוש בתקשורת מוטבע לעיבוד microtome, שהיא בדרך כלל מזיקה עבור stainings ניאון. לחלופין, Z-ערימות שנעשו מיקרוסקופ Confocal ניתן להשתמש כדי להפוך את שיקום 3D של חתך תמונות. עם זאת, זמן רב כדי להפוך כמה פרוסות דק Confocal לשיקום photobleaching 3D מדויק הופכת בעייתית. דאגה נוספת כאשר עוברים הדמיה כי הם רכובים longitudinally הוא פיזור אור המתרחשת כאשר מגיעים חלקים עמוקים יותר של העובר, אשר גם מסבך לקיחת מידות מדויקות של אותות ניאון לצורך כימות של רמות החלבון או ביטוי mRNA 1. אפילו עם מיקרוסקופ שני הפוטונים confocal, פיזור אור עדיין דאגה בגלל האטימות של החומר חלמון באמצע של העובר, מה שהופך את הבחירה של התקשורת הרכבה לשקיפות אופטימלי של המדגם להיות מוגבל. כדי לעקוף את הבעיות הללו, טכניקה חדשה בשם &quot;סיום על&quot; הדמיה של עוברים מיצוב אנכית פותחה לאחרונה על התמונה הן לחיות דגימות קבוע 4. במאמר זה, פיתחנו פרוטוקול חדש עבור עוברי רכוב אנכית המאפשרת הכנה ויזואליזציה פשוטה של עוברי או רקמות קבוע בכל גודל וצורה, כי הם מוכתמים מספר בדיקות באתרו 3. השיטה שלנו מורכבת של שימוש גובר בתקשורת עם עקביות ג&#39;לטיני המשמש לשים בארגז עוברים מיושר בתוכו. בלוקים Cut זה כלי התקשורת הרכבה ובו עוברים מוטבע ניתן למקם זקוף לפני הדמיה בכל סוג של מיקרוסקופ Confocal. על ידי הטבעה את העוברים לתוך ג&#39;לי ומיקום אותם במאונך, אנו מסוגלים לקחת אופקי חתכים באמצעות מיקרוסקופ Confocal, שבו תאים לאורך הציר הגבי-הגחון של העובר מוצגים בו זמנית. זהו שיפור משמעותי לצורך כימות מאז בעיות של פיזור אור photobleaching של צבעי ניאון המתרחשת שחזור Z-מחסנית קונבנציונאלי של עוברים רכוב longitudinally מסולקות עכשיו. לפיכך, כימות הביטוי או חלבון רמות הגן לאורך הציר הגבי-הגחון מדויק, שכן התאים הממוקם הגבי-הגחון עמדות מול הם צילמו באותו זמן ובאותו העמדה-Z אותו confocal. בנוסף, בשיטה המתוארת מאפשרת לנו לקבל תמונה מלאה 2-D על פני ציר הגבי-הגחון מעובר 3-D ללא שימוש מורכב שיטות חישוביות ופרש לדמיין תאים בנקודות שונות לאורך ציר DV 6. כמה שלבים קריטיים לכלול הסרת עודפי גליצרול לאחר יישור עוברים, כדי למנוע פיצול בין שתי שכבות של ג&#39;לי. עם זאת, אם המדגם הוא מיובש מדי, התמונה המתקבלת יהיה מעוות יש מורפולוגיה שגויה. בנוסף, אם המדיום ג&#39;לי סביב העובר נחתך בזווית ולא ישר, וכתוצאה מכך התמונה עשויה להופיע בסיבוב פחות ביצי יותר בכושר, בשל מיקום שגוי של עוברים בזווית שאינה 90 מעלות. לבסוף, אם ג&#39;לי אינו הדוק מספיק כדי לחתוך העובר על קצות קדמית / אחורית, לא ניתן לקבל תמונה נכונה בגלל מרחק העבודה של מטרה ישמש בעיקר כדי להתמקד לתוך ג&#39;לי ולא את העובר. צעד חשוב נוסף אשר עשוי להיות נחוץ כאשר העובר מאוחר הדמיה gastrulating היא בזהירות למיין את שלבי עניין תחת היקף לפני ליישר אותם. בדרך כלל, עוברים הם מבוימים על פי מאפיינים מורפולוגיים, כי ניתן לזהות בקלות כאשר בעמדה האורך. בין השינויים אלטרנטיבה שיכולה להתבצע בשיטה זו היא לכלול מגיב אנטי לדעוך (למשל p-Phenylenediamine או PPD) לתוך השכבה השנייה של ג&#39;לי כדי לסייע בהגנה מפני photobleaching של צבעי ניאון.

<table><tbody><tr><td>תוך הרכבה ג'לטין גליצרין (Glycerin Jelly mounting media)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17998-10</td><td>מכיל ריכוז נמוך של פנול כחומר משמר ויש להשתמש בו במטחח או באזור מאוורר היטב. מתכון להכנת תוך הרכבה באופן עצמאי מתואר ב-Zander, 1997.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקאלי Zeiss LSM 700</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>נעשה שימוש בעדשות הבאות: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td></tr><tr><td>סלויין פוספט (PBS) עם 0.1% Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית למסמיכות מיקרוסקופ</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי מזכוכית</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-02</td><td>גודל 1 &amp;#189; (ספציפי לעדשות שנעשה בהן שימוש בעבודה זו).</td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי מזכוכית (להכנת תומכים)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>השתמשו בארבע לוחיות כיסוי המודבקות בעזרת דבק מהיר (superglue).</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>להב תער</td><td></td><td></td><td>להבים תעשייתיים בעלי גב פלדה ושהייה אחת</td></tr><tr><td>ספטולה</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>מחטים תת-עוריות</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482610</td><td>26 Gauge</td></tr><tr><td>פיפטות</td><td>Labnet International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Upright Imaging of Drosophila Embryos

מספר ידוע הדרגתיים המוךפו&quot;גנטי שהולך ותנועות הסלולר להתרחש לאורך הציר הגבי / הגחון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; העובר. עם זאת, טכניקות הנוכחי נעשה שימוש כדי להציג תהליכים כאלה מוגבלים במקצת. פרוטוקול הבאה מתארת ​​שיטה חדשה הרכבה קבוע שכותרתו<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים לצפייה העטרה עם הדמיה confocal. שיטה זו כוללת הטבעה העוברים בין שתי שכבות של התקשורת גליצרין ג&#39;לי הרכבה, הדמיה רצועות ג&#39;לי בעמדה זקופה. הצעד הראשון עבור הרבדה העוברים היא להפוך את תשתית דקה של ריבת גליצרין בשקופית. לאחר מכן, עוברים מיושרים בקפידה על משטח זה מכוסה בשכבה השנייה של ג&#39;לי. אחרי השכבה השנייה היא הקרושה, רצועות ג&#39;לי נחתכים והתהפך זקוף הדמיה. חלופות מתוארים עבור לדמיין את העוברים בהתאם לסוג של מיקרוסקופ עומד לשמש. מאז כל התאים לאורך הציר הגבי-הגחון הם צילמו בתוך מטוס-Z יחיד confocal, השיטה שלנו מאפשרת מדידה מדויקת והשוואה של אותות ניאון ללא photobleaching או פיזור אור משותפת 3D שחזורים של עוברים רכוב longitudinally.

כאן אנו מציגים פרוטוקול הרכבה מוכתם<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים בתנוחה זקופה המאפשרת הדמיה של חתכים באמצעות מיקרוסקופ Confocal.

מספר מדרגי מורפוגנטים ידועים ותנועות תאיות מתרחשים לאורך הציר הגבי/בטני (dorsal/ventral) של עוברי ה-Drosophila. עם זאת, ה... הנוכחי...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג תמונות במישור קורונלי של עוברי oph שלמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, שניתן להשתמש בהן למדידה מדויקת של גודל העובר ולכימות רמות ביטוי של חלבונים ו-RNA. מטרה זו מושגת באמצעות שימוש במצע קיבוע בעל עקביות ג'לטינית כדי להקיף את העוברים בתוכו ולממקם אותם במצב זקוף. כשלב ראשון.העוברים מיושרים מעל שכבה דקה של ג'לי גליצרין ולאחר מכן מכוסים בשכבה שנייה של מדיום זה. לאחר מכן, מדיום הקיבוע המכיל את העוברים נחתך לבלוקים, אותם ניתן להפוך אנכית לצורך האחזקה. העוברים נמצאים כעת במיקום המאפשר קבלת תוצאות דימיון המציגות תמונות של חתך רוחבי, המערכות במיקרוסקופ קונפוקאלי מכל סוג.שלום, שמי מילו. אני סטודנט לתואר מתקדם במעבדת Meso במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת Case Western Reserve. היום נדגים פרוטוקול סגירה (mounting) לצילוםו של עובר PHI במצב שכיבה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי.פיתחנו שיטה זו במהלך מעבדת קורס הביולוגיה ההתפתחותית כאן ב-Case בשיתוף עם ד"ר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טכניקת הדימוי Endon שפותחה במעבדת Mindin, הוא שהיא מאפשרת הכנה וויזואליזציה פשוטה של עוברים או רקמות מקובעים בכל גודל וצורה. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר נזקקנו לוויזואליזציה של חתכים רוחביים של עוברים קטנים מאוד של מיני gesso אחרים, שחיתוכם ידנית היה קשה מאוד. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות בתחום הביולוגיה ההתפתחותית על ידי מתן אפשרות לכימות מדויק של ביטוי גנים ורמות חלבונים לאורך הציר הגבי-בטני.בדרך כלל, עוברים מורכבים לאורך. למרות שניתן להשיג שחזורי Zack של חתכים רוחביים, לעיתים קרובות עולה בעיה של פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית) של העיניים הפלורסצנטיות ופיזור אור, וניתוח זה גוזל זמן רב. הטכניקה שלנו ממזערת בעיות אלו מכיוון שתמונות בחתך רוחבי של עוברים מוצגות לאורך נקודה קונפוקלית אחת.בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו עשויים להיתקל בקשיים בעת חיתוך בלוקי הגליצרין ("jolly blocks") סמוך לקצות העובריים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כיוון שהיא דורשת טיפול זהיר. יש לנו היום הדגמה שביצעו הסטודנטים שלנו, Catherine Chen ו-catty, להכנת עוברי drosophila לצילום אנכי.ראשית, המס את ג'ל הגליצרין בבן-מאי של מים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות, עד לקבלת נוזל הומוגני. אין לנער את הבקבוק כדי למנוע היווצרות בועות. באמצעות טיפ של פיפט P 1000 קצוץ, העבר בזהירות מיליליטר אחד של ג'ל גליצרין מומס אל על גבי הזריקה.כדי ליצור שכבה ראשונה דקה ואחידה ללא בועות אוויר, יש להניח לג'לי להתמצק במשך חמש דקות על משטח אופקי. לאחר מכן, יש להניח את העשייה במקפיא בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לחלופין, ניתן לכסות את העשייה בניילון נצמד ולהניח אותה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד חמישה ימים.לאחר שהשכבה הראשונה של הג'לי התמצקה, העבירו את הזכוכית למסגרת המיקרוסקופ והמשיכו ליישור העוברים. טפטפו כמות קטנה של עוברים צבועים ושל glycerol 70% PBS בצד השכבה הראשונה של הג'לי. תחת המיקרוסקופ, יישרו את העוברים זה לצד זה לאורך שלוש עד ארבע עמודות לכל זכוכית.השתמשו במחט היפודרמית כדי לאסוף אותם באמצעות הצד המשופע של המחט, כמעין כף. כוונו בזהירות את ראשיהם של כל העוברים לאותו כיוון על ידי החלקתם אופקית על מצע הג'לי בעזרת המחט.התצורה הסופית של העוברים המסודרים תהיה דומה לזו שתוארה עבור הזרקת DNA. בעזרת פיסת נייר Kim wipe מקופלת, הסירו עודפי PBS glycerol מהעוברים. העבירו בזהירות באמצעות פיפט בין 50 ל-300 microliters של ג'לי גליצרין מומס על העוברים, בהתאם למספר העוברים, כדי ליצור שכבה שנייה של ג'לי.לבסוף, קררו את השקופית במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות, או אחזנו אותה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה. כדי להוציא מהשקופית את העוברים הטבולים בגליצרין לצורך הדמיה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את הג'לי בסמיכות לצדדים הקדמיים והאחוריים של העוברים המסודרים. החזיקו את להב התער בזווית של 90 מעלות.כדי לבצע חיתוכים ישרים, הוסיפו 100 עד 200 µL של PBT קר לצד החיתוכים. גרדו בזהירות את הג'לי שסביב העוברים. שימוש ב-PBT מסייע לשחרר את גוש העוברים באמצעות שפכטל.העבירו את הבלוק לזכוכית מיקרוסקופ יבשה לצורך חיתוך נוסף. ראשית, חתכו בלוקים קטנים יותר המכילים חמישה עד שבעה עוברים בתוכם. שנית, הסִירו את עודפי ג'ל הגליצרין שעלולים להפריע לדימוג.לבסוף, העבירו את העובריים השקועים למנח זקוף בעזרת להב תער ומחט. כדי להדמות עובריים של drosophila באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך, הניחו את גוש הג'לי המכיל את העובריים על לבידה (cover slip). ודאו שהצד של העובר שבו כמות הג'לי היא המינימלית נמצא במגע קרוב יותר עם העדשה.במידה שמשתמשים במיקרוסקופ זקוף לצילום, הכינו ארבעה ערימות של דבק supra. ראשית, השתמשו בלוחיות כיסוי כמעמדים והניחו את בלוק העוברים בגליקרול בין המעמדים. חברו את הערימות באמצעות לוחית כיסוי ארוכה יותר לצורך ניתוח קונפוקאלי.הנח את הדגימה על משבית המיקרוסקופ. בדוק את מרחק העבודה של העדשות שבהן תעשה שימוש כדי לקבוע אם ניתן למיפוי של כל העובר או רק באופן חלקי, והגדר את תצורת המיקרוסקופ הקונפוקלי במחשב כדי להתחיל במיפוי כפי שמוצג כאן. אם הפרוטוקול בוצע נכון, ניתן יהיה לצפות בתמונות חתך של עובריים עם מורפולוגיה שלמה, מכיוון שהעוברים נותרים שלמים.ניתן להשתמש בשיטה זו למדידות מדויקות של גדלי עוברים ושל רמות ביטוי גנים לאורך הציר הגבי-בטני (dorsal ventral axis). לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בתוך 30 עד 45 דקות. חשוב להסיר עודפי גליצרין לפני שפיכת השכבה השנייה של ג'לי גליצרין מעל העוברים.אחרת, שתי השכבות עלולות להיפרד ולהפוך את שלב החיתוך לקשה יותר. כמו כן, עליך לבדוק את מרחק העבודה של העדשות שבהן אתה משתמש כדי לוודא אם תוכל לדמיין את העובר כולו או רק חלק ממנו, מכיוון שמרחק העבודה יוצר הגבלה על השטח שניתן לדמיין. ודא כי חיתוך הג'לי נעשה קרוב לצד של העובר שימוקם מול העדשה.אחרת, תדמיינו רק ג'לי במקום את העוברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שיהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק תמונות בחתך רוחב של עוברי Joseph. תודה שצפיתם בנו ובהצלחה בניסויים שלכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

שיטת ההדמיה הזקופה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה מפורטת של הקטבים של ביצית דרוזופילה מלנוגסטר מתפתחת.  מבט מקצה לקצה זה מספק פרספקטיבה חדשה על הסידורים והמורפולוגיה של סוגי תאים מרובים באפיתל הזקיקים.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

אנו מתארים פרוטוקול מפורט המשתמש במיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה כדי לרכוש תמונות תלת מימדיות (תלת מימד) של עוברי עכברים. פרוטוקול משופר זה משתמש בשיטת הכנת רקמות שונה כדי לשפר את חדירת הצבע הפלואורסצנטי, ובכך מאפשר ניתוח מורפומטרי של דגימות קטנות וגדולות כאחד.

ראפיד רכישת תמונות 3D באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית episcopic

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

פרוטוקולים אלו מתארים כיצד לאפיין את הארגון ותפקוד החסימה של צמתקי מחיצה מקופלים באפיתל העוברי של דרוזופילה.

ניסויי צביעת חיסון וחדירת צבע להגדרת חלבוני צומת ספטט מקופלים בליבה באפיתל עוברי של דרוזופילה

למדו פרוטוקול הדמיה לעוברי Drosophila בזקופה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. השיטה מאפשרת מדידות מדויקות של גודל עוברים וכימות רמות חלבון ו-RNA בביולוגיה התפתחותית.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

גלה סרטונים נוספים