Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

תעלות אשלגן מפנימות המופעלות על ידי G-Protein (או grk) הן חשובות לוויסות העירור של נוירונים. Gks יכולים להיות מופעלים הן על ידי קולטנים המצומדים לחלבון G (GPCRs), כגון הקולטן המוסקריני M two R, והן על ידי אלכוהול. כדי לבחון את השפעותיהם של מוטציות באתר קישור האלכוהול של gerk, מוחדרת מוטציה נקודתית אחת ל-grk CD NA באמצעות מוטגנזה מכוונת. קונסטרוקטים של gerk מופקים, ומועברים (transfected), יחד עם קונסטרוקטים של YFP, לתאי יונקים, ויעילות הטרנספקציה מוערכת באמצעות דימות פלואורסצנציה.

לאחר מכן מבוצע ניתוח patch clamp של תא שלם כדי להשוות בין ההפעלה התלויה באלכוהול לבין זו התלויה בחלבון G. הדגמה חזותית זו של הניסוי תספק לכם מידע מרכזי על האופן שבו ניתן לחקור את תפקודם של ערוצי LY. היום נבחן את השאלה כיצד אלכוהול מפעיל ערוצים מקבוצה זו.

טכניקת הנאו-גנזה המכוונת לאתר (site directed neogenesis) המוצגת כאן יכולה לספק תובנות לגבי תפקודם של תעלות יונים. ניתן ליישם טכניקה זו גם במערכות אחרות שבהן ידוע כי מוטציה בגן גורמת למחלה בבני אדם. אלו הן הדגמות של טכניקת ה-patch clamp בתאי hot cell; טכניקה זו היא קריטית כיוון שישנם שלבים רבים הדורשים דיוק, פיצוי אלקטרוני נכון ותרגול כדי להפיק נתונים שמיים.

ה-DNA המשמש לטרנספקציה בפרוטוקול זה מוכן באופן הבא. ראשית, תת-יחידה של GRK, DNA מ-PCR, מועתקת ישירות לתוך וקטור ביטוי לממליות. לתוך פלסמיד PC DNA 3.1 מוכנסות מוטציות נקודתיות באמצעות פריימרים שתוכננו בהתאם, יחד עם ערכה למוטגנזה מכוונת לאתרים QuickChange XL II.

באמצעות מערכת זו, מבוצע PCR שבו כל הפלסמיד משוכפל, ומוחדרות מוטציות נקודתיות המקודדות על ידי הפריימרים. לאחר ה-PCR, הפלסמידים המשוכפלים מעוכלים עם אנזים ההגבלה Dpn I ולאחר מכן מותמרים באמצעות הלם תרמי לתוך חיידקי e coli מסוג XL10-Gold ultra-competent. החיידקים המותמרים גדלים על צלחות LB agar עם אמפיסילין; חיידקים הנושאים את הפלסמיד עמידים לאמפיסילין ויפיקו מושבות.

המושבות המבודדות נבחרות ומגודלות בתרביות מיני (mini cultures). מבוצעים מיני-פרפים (mini preps) לבידוד ה-plasmid DNA. לאחר מכן, ה-DNA עובר ריצוף כדי לזהות מוטנטים שהועברו בהצלחה בתהליך הטרנספורמציה.

מגדלים E coli בנפח גדול יותר ומבצעים maxi preps כדי להכין כמויות גדולות יותר של plasmid DNA. זורעים כ-1×10⁵ תאי HEK 293T לתוך כל אחת משתי בארות בלוח של 12 בארות, אחת עבור המוטנט ואחת עבור הביקורת של תעלת ה-Wild type. מדגירים ב-37 °C.

לאחר שמונה עד 24 שעות, התאים ייצמדו לתשתית שלהם ויהיו מוכנים לטרנספקציה. בצע טרנספקציה לתאים באמצעות lipo 2000 בהתאם להוראות היצרן עם 0.2 מיקרוגרם של CDNA של התעלה, 0.4 מיקרוגרם של CDNA של קולטן M two R ו-0.04 מיקרוגרם של Y-F-P-C-D-N-A. כדי לזהות תאים שעברו טרנספקציה בהצלחה, דגרי את התאים למשך 24 שעות.

לאחר שחלף זמן הדגירה הרצוי, הניחו את התאים על במתו של מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך כדי לקבוע את יעילות הטרנספקציה. השוו בין תמונות פלואורסצנציה לתמונות DIC כדי לקבוע את אחוז התאים שעברו טרנספקציה. החזירו את צלחת התרבית לאינקובטור.

נקה כיסויי זכוכית בקוטר 12 מילימטרים ואחסן אותם באתנול עד לשימוש. הסר את שאריות האתנול באמצעות שריפה (flaming) בתוך תא סטרילי. הנח את כיסויי הזכוכית בתוך פלטת 24 בארות וצפה אותם ב-0.2 milligrams per milliliter.

24 שעות לאחר הטרנספקציה, טריפסינו את התאים המגודלים על poly-D-lysine והעבר אותם למגש בערך של 4×10³ תאים לבאר. ב-4 עד 8 בארות של צלחת בעלת 24 בארות המכילה לבישוב זכוכית מצופים ב-poly-D-lysine, דגריר למשך 24 עד 48 שעות נוספות לפני ביצוע whole-cell patch clamping. הכן אלקטרודות patch באמצעות שובך אנכי דו-שלבי וזכוכית אלקטרודות מסוג borosilicate.

באופן אידיאלי, לאלקטרודה המוגמרת תהיה התנגדות של שלושה עד שבעה מגה-אוהם, והיא לא תדרוש מניפולציה נוספת כגון ליטוש בחום. עבור patch clamping, מקמו כיסוי זכוכית (cover slip) עם תאים שעברו טרנספקציה בצלחת של 35 מילימטר המכילה תמיסה חיצונית של 20 מילימולאר אשלגן או 20 K.

מערך ה-patch clamping המשמש כאן כולל מערכת פרפוזיה. מערכת זו מכילה את התמיסות החוץ-תאיות שיועברו לתאים, אשר זורמות בכוח הכבידה דרך צינורות המחוברים למניפולד. כל תמיסה נשלטת מרחוק באמצעות שסתום צביטה סולנואידי.

השתמש ב-DIC כדי להתמקד ולמצוא תאים. עבור למסנן YFP כדי לאתר את התאים החיוביים ל-YFP. לאחר זיהוי התאים החיוביים ל-YFP, מקם את קצה מערכת הפרפוזיה, תא עצב פלואורסצנטי, במרחק של 20 עד 30 מיקרון או באורך של שניים עד שלושה תאים.

מלאו אלקטרודה בתמיסה פנימית לאלקטרודה. באמצעות מזרק ומחט גמישה, הקישו בעדינות על האלקטרודה המלאה כדי להסיר בועות אוויר מהקצה. חברו את האלקטרודות לראש המגבר (head stage) של מגבר AXO patch 200 B.

בדקו שוב שההגדרות במגבר תואמות לתצורה אחת. מתג ה-Whole cell נמצא על beta equals one, ומסנן ה-lowpass vessel מוגדר ל-10 kilohertz. הפילו לחץ חיובי באמצעות המזרק והסוגר כדי לשמור על קצה האלקטרודה נקי.

לאחר מכן, השתמש במיקרו-מניפולטור כדי להניח את קצה האלקטרודה באמבטיה והזז אותה מעל התא. העבר את המגבר למצב V track ואת כפתור המד ל-V track. לאחר מכן, השתמש במד פוטנציאל הסטה של הפיפטה (pipette offset potential meter) במגבר כדי לאפס את פוטנציאל הפיפטה על ידי הבאת המתח בתצוגת מד המגבר ל-0.00.

לחלופין, עברו למצב V clamp במגבר ובחרו בכפתור test pulse כדי להעביר מדרגת מתח לבדיקה. מדרגת המתח המרובעת תופיע בחלון ה-seal test של ה-clamp. כווננו את ה-pipette offset במגבר כדי להביא את זרם קו הבסיס ל-zero nano and pairs.

בדיקת האיטום תציג את התנגדות האלקטרודה, שצריכה להיות בין שלושה לשבעה mega ohms. לאחר מכן, סגרו את חלון בדיקת האיטום. בחרו ב-acquire open protocol מהתפריט הנפתח.

לאחר מכן, בחרו פרוטוקול מתח שמור. במקרה זה, הפרוטוקול שנבחר תוכנת מראש כדי לספק שלב מתח בודד של 100- millivolts עם עלייה רמפית ל-40+ millivolts כל שתי שניות. פרוטוקול רמפ זה מאפשר תצפית על פוטנציאל ההיפוך ועל תכונת היישור הפנימי (inward rectification) של ערוצי GK.

עבור תעלות יונים תלויות-מתח, קפיצת מתח מלבנית עשויה להיות מתאימה יותר; השתמשו בכיוון העדין של המיקרו-מניפולטור כדי להתקרב לתא, שחררו את הלחץ החיובי, ולאחר נגיעה במשטח התא, הפילו לחץ שלילי קל. עקבו אחר העלייה בהתנגדות בבדיקת האיטום (seal test). ברגע שההתנגדות מגיעה לטווח של giga ohm, האלקטרודה אטמה לממברנה.

מצב זה מכונה giga seal. באמצעות מזרק, יש להפעיל פולס של לחץ שלילי כדי לפרוץ את הממברנה ולהשיג גישה לתא. לאחר המעבר לתצורת תא שלם (whole cell configuration), בדיקת האיטום תרשום זרמים קיבוליים גבוהים שייראו כפיקים או כשינויים חולפים (transients) בתחילת הבדיקה ובסופה.

בדיקת דליפה (seal test). כעת, לחצו על כפתור בדיקת הממברנה. בclamp X, רשמו את התנגדות הגישה (access resistance) ואת התנגדות הממברנה.

קיבול ממברנה במחברת לאימות התאמה מעריכית באופן ויזואלי. קיבול הממברנה פרופורציונלי לגודל התא וישמש לחישוב צפיפות זרם. התנגדות הגישה וההתנגדות של הממברנה משמשות להערכה האם ההקלטה תהיה מספקת לצורך המשך הניסוי.

הקלטה טובה תאופיין בהתנגדות גישה נמוכה. כעת סגרו את חלון בדיקת הממברנה ולחצו שוב על כפתור בדיקת האיטום; בחלון בדיקת האיטום הגדירו את ה-V out למינוס 40 millivolts כדי לפצות על קיבול הממברנה וההתנגדות הטורית במגבר, הפעילו את ה-whole cell cap, וכוונו את ה-whole cell cap ואת ההתנגדות הטורית הלוך וחזור עד למינימום של ה-transient ועד שהזרם יהיה קו שטוח. במידת הצורך, כוונו את קיבול הפפיטה באמצעות כפתור ה-fast cap במגבר.

פיצוי רב מדי או מועט מדי ישאירו תגובה חולפת של קיבול שארית. לאחר מכן, סובב את כפתור חיזוי האחוזים ל-60 עד 80%, וכוונן מחדש את הקיבול של התא השלם, את ההתנגדות טורית ואת הקיבול המהיר לפי הצורך כדי לקבל קו שטוח בבדיקת האטם. לבסוף, סובב את פיצוי האחוזים לכ-100% מבלי לגרום לתנודות בתא, תוך ניסיון לשמור על הפולס ליניארי ככל האפשר על ידי כיוון מחדש של הפוטנציומטרים של קיבול התא השלם, ההתנגדות טורית והקיבול המהיר.

לאחר השגת פיצוי להתנגדות וקיבול, רשמו במחברת את הערכים שנקבעו עבור אחוז ההתנגדות טורית של קיבול המגבר (amplifier capacitance series resistance percent), אחוז הפיצוי (compensation percent), התחזית (prediction) וזמן השיהוי (lag time), ופתחו את שסתומי התמיסה החיצונית עבור תמיסת אמבט ה-20 K של הבקרה. הגדירו את מסנן המעבר הנמוך (lowpass vessel filter) במגבר ל-two kilohertz. לאחר מכן, התחילו בהקלטת זרמים על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה בתוכנה.

חפשו את תכונת היישור הפנימה (inward rectification) של זרם ה-GER. תכונה זו נראית כזרם פנימה גדול, שלילי ביחס לפוטנציאל ההיפוך של האשלגן הנקבע לפי משוואת נרנסט EK, וזרם החוצה קטן, חיובי ביחס ל-ek. לאחר הקלטת קו בסיס יציב, קבעו את ההפעלה של זרמים המתווכת על ידי רספטורים באמצעות יישום של תמיסה חוץ-תאית המכילה 20 k plus carbahol.

ברגע שנצפה שיאו של ההפעלה והזרם יגיע למצב יציב, חזרו לתמיסת אמבט ה-K והמתינו עד להשגת רמת זרם הבסיס. לאחר מכן, כדי לבחון את הפעלת זרמי gert על ידי אלכוהול, עברו לתמיסה חיצונית של 20 k פלוס 100 millimolar אתנול והמתינו לתגובת השיא.

לאחר מכן, חזרו לתמיסת האמבט של 20 K והמתינו עד להגעה לרמת זרם בסיס (baseline). לבסוף, כדי לקבוע את זרמי ה-gert הבסיסיים, עברו לתמיסת 20 K בתוספת 20 K בריום והמתינו לתגובה. העיכוב של זרם ה-gerk אמור להיות ניכר, כאשר הוא יהיה הבולט ביותר ב-100- מיליוולט לאורך כל הפרוצדורה.

יש לשים לב למספר הסריקה (sweep) המתאים להחלה של תמיסות חוץ-תאיות שונות. קובץ clamp fit בודד יכיל את כל הסריקות עבור כל הניסויים. לצורך ניתוח נתוני GK, השתמש בתוכנת clamp FIT 8.2.

בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב המצורף, הושגו שתי הקלטות wholesale שונות מתאי HEC 2 9 3 T המבטאים תעלות GK מסוג wild type או מוטנטים, ואלו נותחו בהתאם להוראות בסרטון זה, כפי שמוצג כאן עבור wild type GK two. הפאנל משמאל מכיל חלון עם מספר זרמים חופפים שנוצרו על ידי פרוטוקול voltage ramp בנוכחות תמיסות שונות. שימו לב ל-inward rectification.

זהו זרם הפנימה הגדול יותר במינוס 100 millivolts סביב 50 milliseconds בעקבה של הזרם. זרם החוצה הקטן בין אפס לפלוס 40 millivolts סביב 200 עד 260 milliseconds בעקבה של הזרם מקורו בתעלה של אשלגן מופעלת על ידי מתח אנדוגנית. זהו אינו זרם ה-Gert current cursor.

אחד ממוקם מעל זרם הפנימה המקסימלי, וערכי הסמן נרשמים בגיליון הנתונים. בגיליון הנתונים נראים מספר העקבה והזרם ב-100- millivolts.

הנתונים כוללים זרם בסיסי, זרמים המושרים על ידי carbahol וזרמים המעוררים על ידי אלכוהול, וכן זרם שעקבב על ידי בריום. באופן דומה, מוצגים זרמי voltage ramp בנוכחות תמיסות שונות. עבור תעלת המוטציה L 2 57 w מוצגים 20 k פלוס 100 millimolar ethanol או 20 k פלוס five millimolar carbahol או 20 k פלוס בריום.

שימו לב לזרמים המופעלים על ידי אלכוהול ו-carbo alcohol, שהם קטנים משמעותית. ממצאים אלו מרמזים כי שארית זו ממלאת תפקיד חשוב בשערת (gating) של תעלות GK על ידי אלכוהול ותתי-יחידות g beta gamma. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבצעים מוטציה ב-an ומתחילים לחקור את השפעתה על תפקוד התעלה באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מתקדמות.

ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצע את שיטת הניאוגנזה המכוונת לאתר זה בתוך יומיים עד שלושה ימים, ולהרחיב אותה לחמש מוטציות או יותר. פיתוחן של טכניקות אלו סלל את הדרך עבור ביופיזיקאים של תעלות יונים לחקור תכונות בסיסיות של תפקוד ותהליכי שערים (gating) של תעלות יונים. בנוסף, הן מאפשרות לחוקרים ללמוד על מחלות אנוש הנגרמות על ידי מוטציה בודדת בגן של תעלת יונים.