הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

שלום לך, אני ראג'ה טי עושה את הדוקטורט שלי במכון בייקר IDI ללב וסוכרת. אני אקח אתכם דרך השלבים הכרוכים בהדמיה תלת מימדית של שינוי מזרחי שסימן נזק לדנ"א ועיבוי כרומטי בתא לב חדש. הדנ"א עטוף סביב אזורים גרעיניים.

כל נוקלאוזום מורכב מארבעה סוגים שונים של היסטונים, H שתיים A, H שתיים b, H שלוש ו-H ארבעה רדי. היווצרות ה- DNA נשברת וזה מסומן על ידי PHO של H שני X.pho זה של H שני X מתרחש בעיקר בקריאטין המסומן על ידי מתילציה של H שלוש K ארבע. כעת נסתכל על האיור התלת-ממדי של שינויים בתווית החיסונית של התא שלך עם שכבת הפו H 2 X והמתיל H 3 K 4.

בואו נתחיל. אנו מתחילים בהצבת מהלך E של תרחיף התא ל -15 מיל. שפופרות פלקון S נשטפות פעמיים עם ניחוח PB ב-50 גרם אחד ו-Resus.

השעו במדיה חדשה כדי לראות את ההשפעה המיידית של קרינה על אירועים סלולריים. שמור את התאים על העיניים במשך חמש עד 10 דקות לפני הקרינה ובמהלכה. חשוף תאים לקרינת גמא או לקרני רנטגן לאחר הקרנה, הוצא שלושה מיליליטר של תרחיף התאים לכל GU של שישה.

צלחת באר לשיא גמא H שני X דוגרים על תאים בין 30 דקות לשעה ב-37 מעלות צלזיוס. אנו משתמשים במשימת הציטוזין כדי למקם את התאים הלא נדבקים על שקופיות זכוכית. בעת הרכבת קליפ הציטוזין, וודא שכל חוט המסנן עולה בקנה אחד עם המשפך.

להוציא 50 מיקרוליטר אחד, לספוג את תרחיף התאים הזה לתוך כל ציטוזין סופי למקם את הציטוזין למשימת ציטוזין ולסובב אותו 500 סל"ד למשך חמש דקות. הסר את תפסי הציטוזין והפרד את השקופיות מכרטיס המסנן. אל תתנו לתאים להתייבש באוויר זמן רב מדי מכיוון שהוא עלול להשפיע על הרקע בצביעת פלואורסצאין.

בעזרת סיכת חסימת נוזל מציירים עיגולים סביב כל מריחה, אנו מקבעים את התאים עם ראש פרפורם של 4% בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בהשוואה לאתנול או ol, נצפה קיבוע טוב יותר עם 4% ראש פרפורמים. רוח מחליקה עם תאי פרם PPS עם טריטון X 100 בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

בהשוואה לתאום 80, ראינו אות טוב יותר בתאים לכל טריטון X 100. צפה בתאים עם PP S3 פעמים כל אחד למשך חמש דקות. חסום תאים באדם אחד BSA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר וחזור על כך שלוש פעמים בהשוואה לחומרים חוסמים וזמנים אחרים.

BSA היה היעיל ביותר במזעור קשירה לא ספציפית של נוגדנים ראשוניים, השתמשנו בשני נוגדנים ראשוניים מדוללים אחד ל-500 עם 1% BSA בכ-50 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים לכל שקופית. דגירה של נוגדן ראשוני בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות מפחיתה כתמי רקע בהשוואה לדגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS למשך חמש דקות.

אלקסה קומה 4 88, אנטי עכבר טוב ואלקסה קומה 5 46 מילים אנטי ארנב. נוגדנים משניים שימשו כדי להישאר סמנים שונים בו זמנית. השתמש בנוגדנים שגדלו במינים שונים.

הוסף כ-50 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל לכל שקופית. דגרו תאים בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות. מומלץ לדגור תאים בתא הלח שלך מכיוון שזה ימנע מתאים ונוגדנים לייבש שקופיות כביסה עם PB S3 פעמים כל אחת למשך חמש דקות.

50 מיקרוליטר של דילול אחד ל-500 של טופו שלוש ב-PBS נוספו לכל שקופית. שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים כל אחת למשך חמש דקות. הסר עודף לחות מהמגלשות והוסף תמיסת אנטיפה.

מומלץ לא לייבש תאים לחלוטין לפני הוספת תמיסת אנטיפה. הנח תלוש כיסוי על השקופית. יש ליטול K כדי למנוע היווצרות בועות אוויר כלשהן.

השאירו את המגלשות למשך הלילה בתא לח כהה. אטום את השקופית עם לק כדי למנוע ייבוש תאים. תמונות רכשו מיקרוסקופ קונפוקלי מגלה.

רזולוציה מרחבית טובה יותר נעלמה ולייזר הליום שימש לרכישת התמונה. אובייקט פליטת שמן 63 שתי עדשות עדיפות על עדשות הגדלה גבוהות או נמוכות יותר. גורם זום של שלושה או ארבעה יפיק תמונה ברזולוציה טובה יותר.

עבור חשבונאות FO מתאים רבים, עדיף להשתמש במהירות סריקה של שמונה, גודל תמונה של 1024 לתאי 1024 פיקסלים. בעת הדמיה עבור ערוצים מרובים, מומלץ לבצע סריקת קו רציפה בהשוואה לסריקת פריימים. כדי למנוע הלבנת דגימה, הגבר הגלאי והיסט המגבר מותאמים כדי להפחית את העכברים ואת רוויית האות.

מכיוון שגודלו של Kama HX X four עשוי להיות נמוך מ-0.5 מיקרומטר, מומלץ לרכוש תמונות עם 0.5 מיקרומטר לפחות. גודל צעד לאורך תמונות ציר הסילון נדרש בתבנית סדרת סילון באמצעות הסימון תחילה וסימון דפוס אבוד. כדי להמחיש את הקשר המרחבי בין חלבונים שונים, מומלץ להשתמש במהירות סריקה של שש עם גודל תמונה של 2048 ו-2 48 פיקסלים באמצעות מטמור תחילה.

שנית ניתן לספור מתמונות שנרכשו במיקרוסקופים קונפוקליים שונים. פתח תגי תמונה של גמא hgx ישירות מתפריט הקובץ או באמצעות מספרי חשבונות. תגיות. עבור לתפריט תהליך ובחר ערימה אריתמטית.

בחר את ההקרנה המקסימלית ובחר את התוכניות שייכללו. ולחץ על אישור. כעת בחר כובע עליון ובחר תמונת גמא H שני X כתמונת מקור.

מסנן הכובע העליון והתמונה המתקבלת יהיו תמונה בינארית עם פחות רעש ושונות מופחתת בעוצמת המוקדים. עבור אל אזורים ובחר כלי ציור אזורים וצייר אזורים סביב גרעינים. עבור אל תהליך, תפריט ותמונת סף מכירה.

בחר סף הכללה והגדר את ערכי הסף התחתון והגבוה יותר. בדרך כלל ערכי הסף הם המשפיעים על ארבעת המספרים. ערך הסף האופטימלי הוא זה שממזער את הכללת הרקע וממקסם את הכללת הגיחה.

ניתן להשיג זאת בצורה הטובה ביותר על ידי ספירת מספר הגיחה באמצעות ערכי סף שונים. ואז להשוות את מספר הגיחה לספירה בעין בלתי. בחר תמונת DPI ועבור לתפריט אזורים ובחר אפשרות העברת אזורים.

עכשיו יש לנו גיחה מתאימה ותמונות גרעיניות מוכנות לספירה. רוב האזורים הגרעיניים מועברים לטופ האט. עבור למדידה, תפריט ובחר ניתוח ארי משולב או IMA בחר למדוד את כל האזורים ולחץ על מדידה כדי לקבל מספר FTE.

כעת ניתן לייצא את מספרי ה-FTE מכל אזור לגיליון אלקטרוני באמצעות האפשרות נתוני יומן. פתח את תמונות מקרן הסילון שנוצרו קודם לכן עבור כל ערוץ. עבור לתצוגה ובחר יישור צבע.

בחרו בתמונות המקור המתאימות לכל ערוץ ליצירת תמונת תמונה לכל שלושת הערוצים. ניתוח סריקת קו מבוצע כדי להמחיש את המיקום המרחבי של סמנים שונים בגרעין. עבור אל הפקודה למדוד סרגלי כלים ובחר קו יבש של ניתוח סריקת קו על פני התא.

זה ייצור גרף המציג את עוצמת הפלואורסצנט של כל תעלה לאורך הקו ומייצג את המרחק של סמנים שונים זה ביחס לזה. ליצירת תמונה תלת-ממדית מערימה, עברו לתפריט 'אוסף אנשים' ובחרו 'שחזור תלת-ממדי'. בחר סוג שחזור תלת מימד מקסימום.

בחר את תוכנית הסיבוב, בחר מרחק כיול סילון. בדרך כלל המשתמש מציין לחץ על אישור ליצירת שחזור תלת-ממדי. ובזה מסתיים הפרוטוקול שלנו לפלואור אימונולוגי וניתוח צביעה ותמונה.

לסיכום, מיקרוסקופ קונפוקלי אימונופלואורסצנטי הוא שתי טכניקות לראייה תלת מימדית של סמני C שונים וגמא H שני X foy בגרעין התא. תודה שצפית.