הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

שלום, אני Raja Ti, דוקטורנט במכון Baker IDI לבריאות הלב והסוכרת. אני אדריך אתכם בשלבים המעורבים בהדמיה בתלת-ממד של מודיפיקציה של Eastern המסמנת נזק ל-DNA ועיבוי כרומטין בתאי לב חדשים. ה-DNA עטוף סביב אזורים גרעיניים.

כל נוקלאוזום מורכב מארבעה סוגים שונים של היסטונים: H2A, H2B, H3 ו-H4. היווצרות של שברים ב-DNA מסומנת על ידי פוספורילציה (phosphorylation) של H2AX. פוספורילציה של H2AX מתרחשת בעיקר בכרומטין המסומן על ידי מתילציה של H3K4. כעת נבחן הדמיה בתלת-ממד של מודיפיקציות בתא, עם סימון אימונולוגי של שכבת הפוספורילציה של H2AX ושל H3K4 המתילציוני.

נתחיל בתהליך. אנו מתחילים בהעברת נפח של תרחיף תאים לתוך מבחנות Falcon בנפח 15 ml. התאים נשטפים פעמיים עם PB על ידי סבב צנטריפוגה במהירות של 50 G ולאחר מכן מומסים מחדש.

השעה במצע (Media) טרי כדי לבחון את ההשפעה המיידית של קרינה על אירועים תאיים. השאר את התאים על העיניים במשך חמש עד 10 דקות לפני ובמהלך הקרינה. חפש את התאים לקרינת גמא או לקרני X. לאחר הקרינה, חלק שלושה מיליליטר של ת сусפנזיית התאים לכל אחת משיש יחידות GU.

פלטת בארות לבדיקת שיא של gamma H2AX; דגרו את התאים בין 30 דקות לשעה אחת ב-37 °C. אנו משתמשים ב-Cytospin כדי להעביר את התאים שאינם נצמדים לשקופיות זכוכית. בעת הרכבת ה-Cytospin, ודאו שכל שולי המסנן חופפים למשפך.

העבירו 50 µl מתחילת תרחיף התאים לכל תא בתוך ה-cytosine, הניחו את ה-cytosine clips בתוך ה-Cytosine mission וסובבו ב-500 RPM למשך חמש דקות. הסירו את ה-cytosine clips והפרידו את השקופיות מכרטיס המסנן. אין להניח לתאים להתייבש באוויר זמן רב מדי, שכן הדבר עלול להשפיע על הרקע בצביעת הפלואורסצאין.

באמצעות סימון עיגולים סביב כל מריחה בעזרת עט סימון עמיד לנוזלים, נקבעו התאים ב-4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בהשוואה לאתנול או למשמנים, נצפתה קיבוע טוב יותר עם 4% paraformaldehyde. שטיפת השקופיות עם PBS והחדרת חומרים לתאים באמצעות Triton X 100 בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

בהשוואה ל-Tween 80, צפינו באות טובה יותר בתאים עם Triton X 100. תבחנו תאים עם PP S3 שלוש פעמים, בכל פעם למשך חמש דקות. חסמו את התאים ב-BSA בריכוז של אחוז אחד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, וחזרו על פעולה זו שלוש פעמים, בהשוואה לחומרי חסימה וזמנים אחרים.

BSA היה היעיל ביותר בצמצום קישור לא ספציפי של נוגדנים ראשוניים; השתמשנו בשני נוגדנים ראשוניים שדללו ביחס של 1:500 עם 1% BSA, בכמות של כ-50 µL נוגדן ראשוני לכל שקופית. דגירה של הנוגדן הראשוני בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות מפחיתה את צביעת הרקע בהשוואה לדגירה לילה שלם ב-4 °C. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS למשך חמש דקות.

Alexa fluor 488 משמש כנוגדן אנטי-עכבר טוב, ו-Alexa fluor 546 כנוגדן אנטי-ארנב. נוגדנים משניים שימשו לזיהוי סמנים שונים בו-זמנית. יש להשתמש בנוגדנים שהופקו ממינים שונים.

הוסיפו כ-50 µL של נוגדן שני מהול לכל סרטית. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות. מומלץ לדגור את התאים בתא לחות כדי למנוע מהתאים ומהנוגדן להתייבש. שטפו את הסרטיות עם PBS שלוש פעמים, למשך חמש דקות בכל פעם.

הוספו 50 µL של דילול 1:500 של topo three ב-PBS לכל שקף. שטפו את השקפים עם PBS שלוש פעמים, בכל פעם למשך חמש דקות. הסירו לחות עודפת מהשקפים והוסיפו תמיסת Antifa.

מומלץ לא לייבש את התאים לחלוטין לפני הוספת תמיסת Antifa. הנח זכוכית כיסוי על השקופית. יש להקפיד על מניעת היווצרות בועות אוויר.

השאירו את השקפיות למשך לילה בתא ללחות בחושך. אטמו את השקית בלק לציפורניים כדי למנוע את התייבשות התאים. תמונות שנתקבלו במיקרוסקופ קונפוקלי חושפות.

הושגו רזולוציות מרחביות טובות יותר ונעשה שימוש בלייזר הליום לרכישת התמונה. להשגת הגדלה גבוהה או נמוכה יותר, הועדפו עדשות אובייקטיב של 63 עם טבילה בשמן. מקדם זום של שלושה או ארבעה יניב תמונת רזולוציה טובה יותר.

עבור ספירה של FO מתאים לתאים רבים, עדיף להשתמש במהירות סריקה של שמונה ובגודל תמונה של 1024 על 1024 פיקסלים לתאים. בעת דימות עבור ערוצים מרובים, מומלץ להשתמש ברכישה של סריקת קווים רצופה (sequential line scan) בהשוואה לסריקת מסגרות (frame scan). כדי למנוע הבהרה (bleaching) של הדגימה, הגבר הגלאה (detector gain) והיסט המגבר (amplifier offset) מותאמים כדי להפחית את הרעשים ואת רוויית האות.

כיוון שגודלו של Kama HX X four עשוי להיות קטן מ-0.5 micrometers, מומלץ לרכוש תמונות עם רזולוציה של לפחות 0.5 micrometer. נדרשות תמונות עם גודל צעד לאורך ציר הסילון בתבנית סדרת סילון (jet series) תוך שימוש בתבנית mark first ו-mark lost. כדי להמחיש את הקשר המרחבי בין חלבונים שונים, מומלץ להשתמש במהירות סריקה של שש עם גודל תמונה של 2048 ו-2 48 pixels תוך שימוש ב-metamor first.

ניתן לבצע ספירה שנייה מתמונות שנרכשו במיקרוסקופים קונפוקאליים שונים. פתחו קבצי תמונה מסוג gamma hgx ישירות מתפריט הקבצים או באמצעות מספרי הזיהוי. עברו לתפריט העיבוד (process) ובחרו באריתמטיקה של מחסניות (Stack arithmetic).

בחר ב-maximum projection ובחר את התכניות שיכלול. לחץ על אישור. כעת בחר ב-top hat ובחר בתמונת Gamma H2X כתמונה מקור, ואשר את הפעולה.

מסנן Top hat והתמונה שיתקבלו יהיו תמונת בינארית עם פחות רעש ושונות מופחתת בעוצמת המוקדים. עברו ללשונית regions, בחרו בכלי שרטוט האזורים (region drawing tool) ושרטטו אזורים סביב הגרעינים. עברו לתפריט process ובחרו ב-threshold image.

בחר את סף ההכללה והגדר ערכי סף נמוכים וגבוהים. בדרך כלל ערכי הסף הם אלו המשפיעים על ארבעת המספרים. ערך הסף האופטימלי הוא זה הממזער את הכללת הרקע וממקסם את הכללת ה-foray.

ניתן להשיג זאת בצורה המיטבית על ידי ספירת מספר ה-foray באמצעות ערכי סף שונים. לאחר מכן, יש להשוות את מספר ה-foray לספירה בעין בלתי מזוינת. יש לבחור את תמונת ה-DPI, לעבור לתפריט ה-regions ולבחור באפשרות transfer regions.

כעת התמונות התואמות של ה-foray והגרעין מוכנות לספירה. רוב האזורים הגרעיניים הועברו ל-top hat. עברו לתפריט measure ובחרו ב-integrated ary analysis או IMA, בחרו ב-Measure all regions ולחצו על measure כדי לקבל את מספר ה-FTE.

כעת ניתן לייצא את מספרי ה-FTE מכל אזור לגיליון אלקטרוני באמצעות אפשרות נתוני הלוג (Log data). פתחו את תמונות ה-jet projector שנוצרו קודם לכן עבור כל ערוץ. עברו לתפריט התצוגה (display) ובחרו ביישור צבעים (color align).

בחר את תמונות המקור המתאימות עבור כל ערוץ כדי ליצור תמונה משולבת לכל שלושת הערוצים. ניתוח סריקה קווית (Line scan analysis) מבוצע כדי להדגים את המיקום המרחבי של סמנים שונים בגרעין. עבור לסרגל כלי המדידה, בחר בפקודה line scan analysis והעבר קו על פני התא.

פעולה זו תיצור גרף המציג את עוצמת הפלואורסצנציה של כל ערוץ לאורך הקו, המייצג את המרחקים בין הסמנים השונים זה לזה. כדי ליצור תמונה בתלת-ממד מתוך סדרה (stack), עברו לתפריט stack ובחרו ב-3D reconstruction. בחרו בסוג השחזור התלת-ממדי maximum.

בחרו את מישור הסיבוב ובחרו את מרחק כיול הסריקה. בדרך כלל, המשתמש מאשר את הבחירה על ידי לחיצה על "אישור" כדי ליצור שחזור תלת-ממדי. ובכך מסתיים הפרוטוקול שלנו לצביעה אימונופלואורסצנטית וניתוח תמונות.

לסיכום, מיקרוסקופ קונפוקלי עם אימונופלואורסצנציה הוא שילוב של שתי טכניקות להדמיה תלת-ממדית של סממנים שונים של C ושל מוקדי gamma H2AX בגרעין התא. תודה לצפייה.