Name: פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנא באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: למד כיצד להכין מערכי qPCR לפרופיל pre-microRNA ו-mRNA באמצעות שיטות אוטומטיות או ידניות. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר ומדויק של רמות ביטוי גנים בדגימות ביולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים DE018304, R01DE018281. KT נתמך על ידי GM07092 T32-34 ו - ידי מענק של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל של הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) באמצעות מד גראד לתוך היוזמה. מחשב נתמך על ידי T32 CA009156.

טרום מירנה מערכים qPCR פרופיל ניתן להגדיר בתור אוטומטי לחלוטין עם חופש לטקאן Evo רובוט (א) או על ידי ביד עם פיפטה מטריקס אלקטרוניקה רב (B). 1) מכינים את תערובת הורים, צלחות פריימר דגימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פריימר המכיל 186 זוגות פריימר בפורמט 96-היטב (כולל של 2 צלחות) בשעה 12:05 צריך להיות מאוחסן ב -80 ° C. הפשירי צלחות החוצה בטמפרטורת החדר, מערבולת בקצרה צנטריפוגות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את תערובת הורים, להפשיר SYBR גרין 2x מערבבים PCR בטמפרטורת החדר. התגובה של כל משתמש לערבב מאסטר 8ul עם פריימר 2ul. הרכב לערבב את אב לכל תגובה היא לערבב SYBR 4ul, 3ul מים PCR כיתה ו 10-20 ng DNA מדגם או cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ההתקנה של כל צלחת פריימר 96-טוב, ארבעה צינורות לערבב אמן יהיה צורך. דוגמאות ניתן להפעיל 4 דגימות לכל צלחת (singlicate), 2 דוגמאות לכל צלחת (כפול) או מדגם יחיד ארבע פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת אמן על ידי שילוב, SYBR מים מדגם בכל אחד 4-2ml צינורות Eppendorf. הצינור אמור להכיל כל תערובת אמן מספיק כ 100 תגובות, המאפשר עודף עבור pipetting פסולת. וורטקס לערבב. </li></ol> א ההתקנה של assay טרום מירנה באמצעות לטקאן חופש Evo רובוט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אתחול של הרובוט וטעינה של התוכנית Evoware, שטוף שלוש פעמים עם כל 30mls כדי לנקות מערכת של בועות האוויר יפריע pipetting דיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת את הפלטפורמה הרובוט לכלול את הדברים הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית-384 גם צלחת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 96 גם פריימר צלחת (1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאסטר מתערבב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקת אקונומיקה המכיל 2% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוזל במיכל מלא מערכת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזבוז רוקן מיכל </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין להפעיל רובוט אוטומטי על ידי בחירת "הפעל" פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף התוכנית, להסיר 384-לאטום היטב צלחת עם נייר 480 איטום LightCycler ו צנטריפוגות בקצרה. המקום אטום צלחת 384 גם בעמדה 1 של המלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשלב 2.2 וחזור על צלחת פריימר 2 מתערבב עם הורים חדשים צלחת 384, באר חדשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת חתומה בעמדה 2 של המלון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תוכנית חדשה Evoware עבור טעינת Lightcycler מהמלון ובחר "הפעלה" פעמיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חופש Evo יטען אוטומטית בכל צלחת לתוך LightCycler ולהפעיל את התוכנית הבאה SYBR ירוק I / HRM רכיבה על אופניים: Pre (1 מחזור): 50 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec 95 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec אמפר (45 מחזורים): 95 מעלות במשך 15 שניות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec 62 מעלות במשך 30 שניות כבש בקצב של 2.5 ° / sec (רכישת נתונים יחיד במהלך שלב זה) עקומת התכה: 95 מעלות למשך 5 שניות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec 60 מעלות למשך 1 דקה בקצב הרמפה של 2.5 ° / sec 95 ° רציפה בשיעור הרמפה של 0.11 ° / sec עם 5 רכישות לכל ° C מגניב: 50 מעלות במשך 30 שניות בקצב הרמפה של 25 ° / sec </li></ol></li></ol> ב ההתקנה של assay טרום מירנה בעזרת פיפטה רב אלקטרוניים מטריקס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תוכנו של צינור לערבב מאסטר 1 למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פיפטה אלקטרונית לשאוב 16ul תמהיל הורים עם 2-8ul לוותר צעדים ואחריו צעד לטהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הורים לערבב 1, לוותר 8ul לבאר כל האחרים צלחת 384, באר (מוגדר על המרווח-384 גם טיפ), החל A1 היטב. (כלומר בארות A1, C1, E1, וכו ') במשך 8ul second לוותר, לעבור טור 3 (כלומר בארות A3, C3, E3, וכו') ולאחר מכן לטהר את מיכל פסולת טיפים להיפטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הדפוס הזה במשך 5 מחזורים שנותרו עד שתגיע A23 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עבור הורים לערבב 2, (החל גם A2, C2, E2, וכו '); לערבב מאסטר 3 (החל B1, D1 היטב, F1, וכו'); לערבב מאסטר 4 (החל B2, D2, F2, etc .). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור aliquotting צלחת פריימר, להגדיר פיפטה אלקטרונית לשאוב 2ul ולחלק 2ul עם הבאים צעד לטהר. לוותר 2ul של primers מהעמודה של צלחת 1-96 גם פריימר (א.ה.) לתוך צלחת 384 הבאר, בארות A1, C1, E1, וכו 'הטיהור על פני מיכל פסולת טיפים להיפטר. חזור על בארות A2, C2, E2, B1, D1, F1, ו-B2, D2, F2 וכו ' </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שורות 2-12 של primers 96, טוב, נעים על כל 2 עמודים עבור כל עמודה פריימר, עד צלחת מלאה 384-היטב כבר aliquotted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם צלחות בנייר איטום LightCycler ו צנטריפוגות בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צלחות לתוך LightCycler 480 מחזור הצלחות על פי ההגדרות הבאות באמצעות גרין SYBR I / פורמט HRM זיהוי: Pre (1 מחזור): 50 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec 95 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec אמפר (45 מחזורים): 95 מעלות במשך 15 שניות בקצב הרמפהשל 4.8 ° / sec 62 מעלות במשך 30 שניות כבש בקצב של 2.5 ° / sec (רכישת נתונים יחיד במהלך שלב זה) עקומת התכה: 95 מעלות למשך 5 שניות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec 60 מעלות למשך 1 דקה בקצב הרמפה של 2.5 ° / sec 95 ° רציפה בשיעור הרמפה של 0.11 ° / sec עם 5 רכישות לכל ° C מגניב: 50 מעלות במשך 30 שניות בקצב הרמפה של 25 ° / sec </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור באמצעות צלחת פריימר 2, aliquotting לתוך צלחת 384, גם טריים באמצעות תערובות מאסטר מוכן טרי. </li></ol> סודות ההצלחה: מאפיין חשוב בעת תכנון מערכי ה-PCR היא כי כל 186 זוגות פריימר יש חישול בטמפרטורה זהה, כך צלחת ניתן להפעיל את אותו הדבר האופטימלי תוכנית הגדרות ה-PCR לרוץ. כל מערך חדש צריך להיבדק באמצעות שלוש שולטת לפני דגימות פועל. בקרות אלה הם: 1 לרוץ כל primers לרוץ עם מים או 0.1 x TE כדי לשלול זיהום פריימר. 1 להפעיל לסירוגין מים / TE ושליטה חיובית, על מנת להבטיח שום שריד. 3 פועל באמצעות השלט חיובית זאת, כדי להבטיח שחזור בין ריצות. תערובות הורים צריכים להיות מוכנים טרי, צלחות יש להפעיל בתוך 24 שעות עבור תוצאות אופטימליות צלחת נייר פריימר יש להסיר לאט להפחית את הסיכון של זיהום בין בארות. כאשר באמצעות רובוט עם טיפים קבוע, לשטוף באקונומיקה 2% יש צורך לשטוף את הטיפים בין כל שלב pipetting, ובעקבותיו שטף מים. זה מונע ומונע שריד, שעלולות לזהם נתונים להוביל לתוצאות חד משמעיות. לאחר הצלחת מנוהל באמצעות Lightcycler, זה לא אמור להיפתח שוב בחדר ההתקנה PCR. זה עוזר למנוע זיהום PCR. נציג תוצאות: תוצאות qPCR מיוצגים בדרך כלל על ידי ערכים CT כפי שנקבע מהתוכנה ניתוח Lightcycler. ריצה מוצלחת בדרך כלל מורכבת של מגוון רחב של CTS עבור דגימות, בדרך כלל בין 20-35 עבור דגימות חיוביות. דגימות מים בטווח טוב הם תמיד CT של&gt; 40 וכל דגימות או בארות ספציפי עם CT מעל 37 נחשבים שליליים או לא מזוהה. ככלל, דגימות מניב CT של &lt;10 גם כן אינן אמינות והן מחוץ ניתוח נוסף. ישנן מספר דרכים לנתח נתונים qPCR והכללה של בקרה פנימית assay שלנו מסייע לשלוט על וריאציה של קלט המדגם. מערך טרום miR כולל פריימר לשלוט U6, המשמש לעתים קרובות גן התייחסות לנרמל את ערכי ה-CT מ מדגמים שונים. ערך זה מנורמל שמכונה ה-CT דלתא ערך (DCT). התוצאות בגרף לעתים קרובות כמו CT הגלם, ערך או DCT ניתן לנתח נוסף לערכים סטנדרטיים. באיור 1, ניתוח של המערך מראש microRNA מלא של ארבעה מדגמים שונים של ניסוי timecourse מוצג בפורמט המפה חום. הביטוי היחסי של microRNA מראש כל מוצג שלוש הגדולות, באשכולות נפרדים יצא. רוב מראש מירס עברו ניתוח קטן, שינוי משמעותי כצפוי (איור 1A). עם זאת, חלק קטן מראש רנ"א היו ירדו משמעותית (איור 1B) או גדל באופן דרמטי (תרשים 1C) לאורך הניסוי timecourse. רמות הביטוי של microRNA מראש היו כל מנורמל של timepoint 0h (מדגם 1) כמו ברמה בסיסית. במקרים מסוימים, ייתכן לציין כי חלק מראש רנ"א התקבצו גם מקבץ יחד בניתוח Heatmap (לשעבר: לתת-7 א, 1B איור). בהתאם הניסוי, אשכולות עלול להתגלות כי תלויים זיהום ויראלי, סוג התא הביטוי הספציפי של טרום טרום רנ"א או מירס כי מוסדרים על ידי מולקולה משותפת או מסלול איתות. Assay microRNA מראש כי פיתחנו גם כוללת מספר ידוע מראש רנ"א נגיפי, גנים המקודדים על ידי סרקומה של קפוסי Associated ההרפס (KSHV) ו אפשטיין בר וירוס (EBV) בנוסף טרום מירס האדם. אלה יכולים לשמש שולטת חיובית או שלילית, בהתאם לקו תא ומצב ויראלי של דגימות בשימוש. באיור 2, CTS הממוצע ממדגם KSHV שלילי ריצה ארבע פעמים מוצגים. חשוב לציין, KSHV לנה לא זוהה במדגם זה על ידי מערך qPCR רגיש מאוד. עם זאת, U6 - הבקרה הפנימית שלנו ולתת-7 א - הביעו מאוד אנושי מראש microRNA, באו לידי ביטוי בכל הרמות לזיהוי. לבסוף, כצפוי, הביקורת השלילית של מים PCR כיתה לא הניב מוצר qPCR. אינדיקטור נוסף של מפעיל qPCR מוצלח הוא נמס טוב עקומת ניתוח, אשר יכול לתת תובנה זיהום פוטנציאליים דגימות. כדי ליצור טמפרטורת ההתכה, צלחת מחוממת לאט אחרי PCR תושלם. כמו גדילי הדנ"א נפרדים, SYBR ירוק הוא שוחרר, אותות הקרינה פוחתת. הטמפרטורה שבה זה drאופ מתרחש בגרף, והוא ידוע בתור טמפרטורת ההיתוך של המדגם. בהתאם רצף ה-DNA, דגימות להמיס בטמפרטורות שונות זו מזו משליטת מים שלילי, אשר לא צריכה להיות טמפרטורת ההתכה מאז ה-DNA לא קיים. המוצרים PCR מתוך כל זוג צריך פריימר להמיס בטמפרטורות דומות. לדוגמה, איור 3 מראה עקומת התכה ניתוח שני פריימרים שונים באמצעות מדגם זהה כפולים. ברור כי את טמפרטורת ההתכה שונה עבור שני זוגות פריימר אבל המדגם הוא נמס בטמפרטורת בדיוק את אותו הדבר עבור לשכפל כל אחד. סימנים של מדגם רע או מזוהמים יכולים לכלול מספר פסגות ההיתוך, דבר המצביע על נוכחות של שני מקורות שונים של קלט. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. טרום microRNA חתימות לצאת דרך אפיון באמצעות qPCR מבוסס הרומן המערך. DeltaCTU6 הממוצעת חושבה וערכים סטנדרטיים הועמסו תוכנה ArrayMinerTM, מניב 3 אשכולות שונים מוצג כ heatmaps. (א) Pre-רנ"א עם שינויים קטנים ביטוי מוצגים. טרום רנ"א אשר היו רמות ירד משמעותית (ב) או מוגבר (ג) מוצגים גם. כחול תואם רמות נמוכות יותר של ביטוי בעוד אדום מייצג עלייה ברמות הביטוי. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. הכללה של בקרות פנימיות במערך מראש microRNA qPCR מבוססות. הערכים גלם CT עבור 3 גנים שונים שליטה תבנית לא מוצגים. U6 משמש בקרה פנימית חיובית בעוד PCR H2O משמש שליטה שלילי שלנו. בואו-7a-1-1 הוא microRNA הביעו בדרך כלל הרבה סוגי תאים שונים תוך KSHV לנה יכול לשמש כביקורת חיובית או שלילית, על סמך מעמד ויראלי של קו תא או רקמה בשימוש. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. התכה ניתוח שיא של microRNA מראש primers וחוסר זיהום המדגם. עקומות התכה התקבלו באמצעות ניתוח קורא אני בתוכנה LightCycler. שני פריימרים שונים (פריימר A ו-B) עבור מדגם זהה לרוץ לשכפל מוצגים. טמפרטורת ההתכה של כל צבע יסוד שונה. עם זאת, במדגם יש רק אחד השיא, הוכחת העדר זיהום המדגם.

<ol><li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Frégeau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li>
<li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

QPCR הוא assay רגישה מאוד, כי ניתן להשתמש כדי להשוות רמות ביטוי הגנים בין דגימות במחקר, כמו גם כדי לקבוע חיוביות במקרה של וירוסים. היתרון של שימוש במערכים qPCR הוא היכולת להריץ primers רבים (במקרה שלנו, 186 זוגות פריימר) עבור מדגם זה בתקופה קצרה של זמן. באמצעות רובוט pipetting כגון חופש לטקאן Evo, את משך הזמן הנדרש כדי להגדיר ניסוי למעלה, ניתן להפחית עוד יותר, ועל דיוק ועקביות של הרובוט יכול לצמצם ולמנוע טעויות pipetting. כאן אנו מדגימים כיצד להשתמש חופש לטקאן Evo להקים מערך micro...

<table><tbody><tr><td>Freedom Evo 150</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30017587</td><td></td></tr><tr><td>פיפט רב-ערוצי אלקטרוני Matrix</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2001-MTX</td><td>(או כל פיפט רב-ערוצי מקביל של Thermo Scientific המסוגל להעביר את הנפחים שתוארו לעיל)</td></tr><tr><td>טיפים עם מסנן Matrix Integrity, סטריליים</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>7435</td><td>(או טיפ מקביל עבור הפיפט הרב-ערוצי שבו נעשה שימוש)</td></tr><tr><td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td><td>Roche Group</td><td>04 707 516 001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 Instrument II</td><td>Roche Group</td><td>05015243001</td><td>גרסת 384 בארות</td></tr><tr><td>פלטה רב-בארים Lightcycler 480 384, לבנה</td><td>Roche Group</td><td>04729749001</td><td></td></tr><tr><td>רדיד איטום LightCycler 480</td><td>Roche Group</td><td>04729757001</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח רב-פלטות LightCycler 480</td><td>Roche Group</td><td>05075122001</td><td></td></tr><tr><td>חומר דה-קונטמינציה Eliminase</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-31</td><td></td></tr></tbody></table>

פרופיל של טרום מיקרו rnas ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת pcr (qpcr) מערכים

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

כמותי בזמן אמת PCR (QPCR) התפתחה ככלי מדויק יקר פרופיל רמות ביטוי הגנים. אחד היתרונות הרבים גבול גילוי נמוכה בהשוואה לשיטות אחרות של פרופילי ביטוי גנים, תוך שימוש בכמויות קטנות של קלט עבור כל assay. התקנה אוטומטית qPCR השתפר בתחום הזה על ידי המאפשר שחזור יותר. ההתקנה נוחה ומהירה שלה מאפשר תפוקה גבוהה ניסויים, המאפשרת אפיון של גנים רבים ושונים בו זמנית בכל ניסוי. שיטה זו, יחד עם צלחת בקרות פנימיות גם מקטין את משתני הניסוי המשותף טכניקות אחרות. אנחנו לאחרונה פיתחה assay qPCR עבור פרופילים של טרום רנ&quot;א (טרום miRNAs) באמצעות סדרה של 186 זוגות פריימר. מיקרו RNA צמחו כמעמד של רומן קטן, ללא קידוד RNAs עם היכולת לווסת את מטרות mRNA רבים ברמה שלאחר תעתיק. RNAs אלה קטן מתועתקים הראשונה מירנה תעתיק הראשי (פרי, מירנה), אשר ביקע מכן לתוך מירנה המבשר (טרום מירנה) על ידי RNA פולימראז II. טרום miRNAs מיוצאים הציטופלסמה שבה דייסר cleaves את הלולאה מכבנה להניב miRNAs בוגרת. עליות ברמות מירנה ניתן לצפות ב מבשר והן רמות מירנה בוגרת פרופיל של שתי צורות אלה יכול להיות שימושי. ישנם מבחני זמינים מסחרית מספר miRNAs בוגרת, אך העלות הגבוהה שלהם עשוי להרתיע חוקרים טכניקה זו פרופיל. כאן, אנו דנים חסכונית, אמינות, SYBR מבוססי שיטה qPCR של אפיון מראש miRNAs. שינויים מירנה מראש רמות לעתים קרובות לשקף שינויים מירנה בוגרת יכולה להיות אינדיקציה שימושית הביטוי מירנה בוגרת. עם זאת, פרופיל סימולטני של שתי טרום miRNAs ו miRNAs בוגרת יכול להיות אופטימלי כפי שהם יכולים לתרום מידע nonredundant ולספק תובנות עיבוד microRNA. יתרה מכך, טכניקה המתואר כאן ניתן להרחיב להקיף את פרופיל של קבוצות אחרות ספריית המסלולים או פתוגנים ספציפיים.

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

PCR כמותי בזמן אמת (QPCR) הפך לכלי מדויק ובעל ערך לאפיון רמות ביטוי של גנים. אחד מיתרונותיו הרבים הוא סף גילוי נמוך יותר...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפשר הקמה אוטומטית, מהירה ואמינה של מערכים המבוססים על QPCR. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת סטים של פריימרים עבור המערך והכנת תערובות מאסטר (master mixes) של הדגימות לסריקה. לאחר מכן, נעשה שימוש בהקמה רובוטית אוטומטית של PCR או במערכת פפיטות אלקטרונית מטריצית כדי להעביר במדויק את תערובת המאסטר של הדגימה ואת סטי הפריימרים לכל באער של פלטה בעלת 384 באערים.לאחר ההכנה, תגובות ה-PCR בלוח של 384 בארות מורצות באמצעות תוכנית PCR של light cycler four 80 cyber. השלב הסופי של הפרוטוקול הוא ניתוח נתוני ה-QPCR וקביעת רמות הביטוי היחסיות עבור כל זוג פריימרים שנבדק, כאשר כל זוג מהם מכוון ל-mRNA ספציפי. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות שינויים בביטוי של קבוצות גדולות של mRNAs.לפיכך, מערכים שפותחו באופן ספציפי יכולים להתמקד בפרופילים שלמים של pre-microRNA, במסלולים ספציפיים או במולקולות המהוות מפתח לזיהום נגיפי באמצעות פרופיל מבוסס qPCR. שלום, אני Dirk DMA מהמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'פלהיל. היום נראה לכם כיצד להגדיר qPCR בזמן אמת, ונציג בפניכם שתי שיטות.אחד, באמצעות פיפטה ידנית ואחד באמצעות רובוט. אנו משתמשים בטכנולוגיה זו למדידת pre-microRNAs ו-microRNAs בוגרים בגידולי אדם. ההדגמה היום תבוצע על ידי Pauline Chu ו-Kristen bu.אם כן, נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, הוציאו פלטות פריימרים המכילות 186 זוגות פריימרים בפורמט של 96 בארות בריכוז 0.5 picaMoles, המאוחסנות בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.לאחר הפשרת הפלטות בטמפרטורת החדר, ערבבו אותן ב-vortex וסובבו אותן בקצרה בצנטריפוגה. כמו כן, הפשירו את תערובת ה-cyber green two times PCR mix בטמפרטורת החדר; להקמה של כל פלטת פריימרים בעלת 96 בארות, יידרשו ארבעה מבחנות master mix. הכינו את ה-master mix על ידי שילוב של 4 µL מתערובת ה-cyber green, 3 µL של מים בדרגת PCR ו-10 עד 20 ng של DNA של הדגימה או cDNA לכל תגובה, בכל אחת מארבע מבחנות Eppendorf בנפח 2 mL.כל מבחנה צריכה להכיל תערובת מאסטר (master mix) מספקת לכ-100 תגובות, כולל כמות עודפת לפיצוי על איבוד במהלך הפיפטור. ערבבו את מבחנות ה-einor באמצעות וורטקס (Vortex). התחילו בהכנה של בדיקת ה-micro RNA המקדים (precursor micro RNA assay) באמצעות רובוט ה-freedom Tecan EVO, כולל אתחול הרובוט וטעינת תוכנית ה-EVO wear.לאחר מכן, שטפו את הרובוט שלוש פעמים עם 30 milliliters של נוזל מערכת כדי לנקות את המערכת מבועות אוויר שיפריעו לדיוק השפיפה. לאחר מכן, הגדירו את פלטפורמת הרובוט כך שתכלול פלטה של 384 בארות ופלטת פריימר של 96 בארות. התערובות הראשיות (master mixes) כוללות תעלה המכילה 2% bleach, מיכל נוזלי מערכת מלא ומיכל פסולת ריק.התחילו את ההרצה האוטומטית של הרובוט על ידי בחירה ב-run פעמיים בסיום התוכנית. הוציאו את פלטת ה-384 בארות ואטמו אותה באמצעות רדיד אלומיניום מסוג light cycler four 80 ceiling foil. לאחר מכן, סובבו את הפלטה בצנטריפוגה.הנח בקצרה את פלטת 384 הבארות האטומה בעמדה אחת של ה-hotel. לאחר מכן, חזור על תהליך זה עבור פלטת הפריימר השנייה עם תערובות מאסטר (master mixes) חדשות ופלטת 384 בארות חדשה. הנח את פלטת 384 הבארות האטומה שהתקבלה בעמדה שתיים של ה-hotel.פתחו תוכנית EVO wear חדשה עבור טעינת מחזור אור (light cycler) מהמלון והגדירו את פרמטרי המחזור. לאחר מכן בחרו בהרצה פעמיים. ה-Freedom Evo יטען אוטומטית כל פלטה אל מחזור האור ויריץ את תוכנית מחזור ה-HRM של cyber green.עם סיום הפעולה, יש לסקור ולנתח את התוצאות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב כחלופה לשימוש ברובוט. ניתן להשתמש בפיפט רב-ערוצי למטריצות כדי להעביר את תכולת מבחנת התערובת הראשית (master mix) אל תוך מיכל (reservoir).כוון את הפ pipette האלקטרונית לשאוב 16 µL של תערובת מאסטר (master mix) עם שני שלבי פליטה של 8 µL ואחריהם שלב ניקוז (purge). לאחר הגדרת הפ pipette, שאב 16 µL של תערובת מאסטר והתחל להעביר אותה לתוך פלטת 384 עם גלגל. פלוט את 8 µL הראשונים לכל שורה שנייה בעמודה אחת, בשורות A עד O, והשאר את העמודה הבאה ריקה.העבירו את שמונת המיקרוליטרים השניים לאותן שורות בעמודה שלוש. לאחר מכן, בצעו שטיפה (purge) מעל מיכל פסולת והשליכו את הטיפים, תוך המשך דפוס זה של השארת שורות ועמודות לסירוגין. חזרו על הפעולה ברחבי הפלטה למשך חמישה מחזורים נוספים עבור תערובת מאסטר 2.השתמש באותן שורות כמו בתערובת המאסטר הראשונה, אך התחל מעמודה שתיים. חזור על הליך זה עבור תערובות המאסטר השלישית והרביעית, תוך התחלה מעמודות אחת ושתיים בהתאמה, אך הפעם השתמש בשורות B עד P של פלטת הפריימרים. כוון פפיטה אלקטרונית לשאיבה של 2 µL והזרקה של 2 µL, ולאחריה שלב שטיפה (purge).העבירו 2 µL של פריימרים מעמודה אחת, שורות A עד H, של פלטת פריימרים בעלת 96 בארות, לכל שורה שנייה בעמודה אחת של פלטה בעלת 384 בארות; בצעו שטיפה מעל מכל פסולת והשליכו את הטיפים. חזרו על תבנית זו עבור פריימר quatt עבור שלושת תערובות המאסטר (master mixes) הנותרות בעמודות אחת ושתיים. לאחר מכן, המשיכו בתהליך זה עבור עמודות 2 עד 12 של פלטת הפריימרים בעלת 96 הבארות, תוך מעבר של כל שתי עמודות בפלטה בעלת 384 הבארות עבור כל עמודת פריימר.בשלב הבא, אטמו את הפלטות עם מכסה למחזור אור, נייר אלומיניום וסבבו בצנטריפוגה. מיד לאחר הצנטריפוגה, הכניסו את הפלטות למחזור אור four 80 והפעילו את הפלטות באמצעות פורמט גילוי HRM של cyber green one.תוך שימוש באותם תנאי מחזור כפי שבוצעו קודם לכן, חזור על הליך זה באמצעות לוח הפריימרים השני Eloqua לתוך לוח 384 בארות חדש, תוך שימוש בתערובות מאסטר (master mixes) שהוכנו acabado. חתימות של micro RNA מקדימות עולות מתוך פרופיל באמצעות מערך חדש המבוסס על QPCR. חישוב ה-delta CT הממוצע כפי שנורמל ל-U six בוצע, וערכים סטנדרטיים הועמסו לתוך המערך.תוכנה מסוג Minor המניבה שלושה אשכולות נפרדים המוצגים כמפות חום. הביטוי היחסי של כל precursor micro RNA מוצג בצבעים, כאשר אדום וכחול מייצגים עלייה וירידה בביטוי היחסי, בהתאמה. עוצמת הצבע מעידה על מידת השינוי בביטוי.מרבית ה-microRNAs הקדמוניים עברו שינויים קטנים ובלתי משמעותיים כצפוי. עם זאת, חלק קטן מה-microRNAs הקדמוניים עלו באופן משמעותי לאורך הניסוי בנקודות הזמן השונות. בנוסף, הרמה היחסית של חלק מה-microRNAs הקדמוניים ירדה באופן דרמטי.במקרים מסוימים, הם מתקבצים יחד גם בניתוח מפת החום (heat map). בהתאם לניסוי, עשויים להיווצר אשכולות התלויים בזיהום נגיפי, בביטוי ספציפי לסוג התא של precursor microRNAs, או ב-precursor microRNAs המווסתים על ידי מולקולה משותפת או מסלול איתות.מוצגים ספי ciclos thresholds הממוצעים או ה-cts מדגימה שלילית לנגיס ההרפס הקשור לסרטן קפושי, שהורצה בארבעה כפילויות. חשוב לציין כי לא זוהה בתוך דגימה זו ה-Kaposi's sarcoma associated herpes virus latency associated nuclear antigen או KSHV Lana באמצעות מערך ה-QPCR בעל הרגישות הגבוהה. עם זאת, הן בקרת הפנים U six והן let seven a, שבלחלוף הוא precursor micro RNA אנושי בעל ביטוי גבוה, התבטאו ברמות שניתן לזהותן.לבסוף, כצפוי, בקרת השלילה של מים בדרגת PCR לא הניבה תוצר A-Q-P-C-R. מוצג ניתוח עקומת המסחה עבור שני פריימרים שונים, תוך שימוש באותה כפילות דגימה.ניכר כי טמפרטורת ההמסה שונה עבור שני זוגות הפריימרים, אך הדגימה נמסה בדיוק באותה טמפרטורה עבור כל שכפול. סימנים לדגימה פגומה או מזוהמת פוטנציאלית עשויים לכלול מספר שיאי המסה המרמזים על נוכחותם של שני מקורות קלט שונים. הרגע הדגמנו כיצד להקים ניסויי QPCR בזמן אמת באמצעות רובוט.חשוב לכלול את כל הביקורות וכמה שיותר גנים של ביתי-משק (housekeeping genes). תודה שצפיתם בה, ובהצלחה בניסוייכם.

profiling-pre-micro-rnas-micrornas-using-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

הליך פשוט של ביצוע ניסויים אישית microarray microRNA מתואר. הצעדים כוללים בידוד RNA, תיוג RNA ו-DNA התייחסות, והכלאה דגימות כדי microarrays, סורקת את microarrays, כימות וניתוח אותות הכלאה.

ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA

פולימראז כמותי זמן אמת תגובת שרשרת (QPCR) היא שיטה מהירה רגישה כדי לחקור את רמות הביטוי של microRNA שונים (מירנה) מולקולות דגימות הגידול. שימוש בביטוי זה השיטה של ​​מאות מולקולות שונות מירנה יכול להיות מוגבר, לכמת אותה ולנתח אותה מהתבנית cDNA אותו.

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

הנוכחות של מיקרו RNA היציב (miRNAs) בexosomes יצרה עניין עצום כמו מצב רומן של תקשורת בין תאית, לשירות שלהם כסמנים ביולוגיים הפוטנציאלי וכנתיב להתערבות טיפולית. כאן אנו מדגימים טיהור exosome מתקשורת והתרבות בדם ואחרי PCR כמו לזהות miRNAs מועברת.

טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי עם או בלי הגברה מראש. פרוטוקול זה מאפשר הבנה טובה יותר של כמות פלזמה miRNAs ומאפשר הערכה איכותית של נתונים התואמים מחקרים שונים או מעבדות.

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

כאן אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי ריאות miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים שימוש בעכברים נחשפים האוזון או סינון אוויר בשלבים שונים של ייחום.

ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון

כאן, פרוטוקול כמותי בזמן אמת מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז מוצגת לצורך קביעת התוכן המקורי מיקרו-RNA (מוחלט/יחסי) של חלקיקים ליפופרוטאין. בנוסף, שיטה להגברת רמת מיקרו RNA, כמו גם שיטה לקביעת שיעור ספיגת הסלולר של חלקיקים ליפופרוטאין, מומחש.

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

למד כיצד להכין מערכי qPCR לפרופיל pre-microRNA ו-mRNA באמצעות שיטות אוטומטיות או ידניות. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר ומדויק של רמות ביטוי גנים בדגימות ביולוגיות.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ"א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

גלה סרטונים נוספים