פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ"א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים
3 בדצמבר 2010
נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר הגדרה אוטומטית מהירה ואמינה של מערכים מבוססי QPCR. זה מושג על ידי הכנת ערכות הפריימר למערך והגדרת תערובות המאסטר לדוגמה להקרנה. לאחר מכן, מערך PCR רובוטי אוטומטי או מערכת פיפטה אלקטרונית מטריצה משמשת כדי לדגום במדויק את תערובת המאסטר וערכות הפריימר של Eloqua לכל באר של צלחת באר 384
.לאחר ההכנה, תגובות ה-PCR של 384 הבאר מופעלות עם תוכנית ה-PCR המבוססת על סייבר 4 80. השלב האחרון של ההליך הוא ניתוח נתוני ה-QPCR וקביעת רמות ביטוי יחסיות עבור כל זוג פריימר שנבדק, שכל אחד מהם מכוון ל-mRNA ספציפי. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים בביטוי של קבוצות גדולות של mRNAs.
מערכים שפותחו במיוחד יכולים אפוא לכוון לפרופילי קדם-מיקרו-RNA שלמים, מסלולים ספציפיים או מולקולות מפתח לזיהום ויראלי באמצעות פרופיל מבוסס QPCR. שלום, אני דירק DMA מהמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל. היום נראה לך כיצד להגדיר QQPC rra בזמן אמת ונראה לך שתי שיטות.
אחד, באמצעות פיפטה לא סדירה ואחד באמצעות רובוט. אנו משתמשים בטכנולוגיה זו כדי למדוד מיקרו-רנ"א קדם-רנ"א ומיקרו-רנ"א בוגרים בגידולים אנושיים. ההדגמה היום תיערך על ידי פאולין צ'ו וקריסטן בו.
אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, אחזר לוחות פריימר המכילים 186 זוגות פריימר ב-96. פורמט טוב ב 0.5 פיקהמול מאוחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס.
לאחר הפשרת הצלחות בטמפרטורת החדר, מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר. כמו כן, יש להפשיר תערובת PCR פעמיים בטמפרטורת החדר להתקנה של כל 96 צלחות פריימר באר יהיה צורך בארבעה צינורות תערובת מאסטר. הכן את תערובת המאסטר על ידי שילוב של ארבעה מיקרוליטרים של תערובת סייבר גרין, שלושה מיקרוליטרים של מים בדרגת PCR ו-10 עד 20 ננוגרם של דגימת DNA או CDNA לכל תגובה בכל אחד מארבעה צינורות איינור של שני מיליליטר.
כל צינור צריך להכיל מספיק תערובת מאסטר לכ-100 תגובות, מה שמאפשר עודף לפסולת פיפטה. מערבל את צינורות ה-einor לערבב. התחל בהתקנה של מבחן המיקרו RNA המבשר באמצעות רובוט החופש Tecan EVO עם אתחול הרובוט וטעינה של תוכנית הבלאי EVO.
לאחר מכן שטפו את הרובוט שלוש פעמים עם 30 מיליליטר של נוזל מערכת כדי לנקות את המערכת מבועות אוויר שיפריעו לדיוק הפיפטינג. לאחר מכן, הגדר את פלטפורמת הרובוט כך שתכלול צלחת 384 באר וצלחת פריימר 96 בארות. המאסטר מערבב שוקת המכילה 2% אקונומיקה, מערכת מלאה, מיכל נוזלים ומיכל פסולת ריק.
התחל את הפעלת הרובוט האוטומטי על ידי בחירה בהפעלה פעמיים בסוף התוכנית. הסר את צלחת הבאר 384 ואטום עם מחזורי קל ארבע 80 רדיד תקרה. ואז צנטריפוגה את הצלחת.
הנח בקצרה את צלחת הבאר האטומה 384 במיקום הראשון של המלון. לאחר מכן חזור על תהליך זה עבור צלחת פריימר שתיים עם תערובות מאסטר חדשות וצלחת באר חדשה של 384. הנח את לוחית העולם האטומה 384 שהתקבלה במיקום השני של המלון.
פתח תוכנית EVO חדשה להעמסת רוכב האופניים הקל מהמלון והגדר את פרמטרי הרכיבה. לאחר מכן בחר הפעל פעמיים. Freedom Evo יטען אוטומטית כל צלחת לתוך רוכב האופניים הקל ויפעיל את תוכנית הרכיבה על אופניים של סייבר גרין אחד.
לאחר השלמתה. סקור ונתח את התוצאות כמתואר בפרוטוקול הכתוב כחלופה לשימוש ברובוט. ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית אלקטרונית מטריצה כדי להתחיל למקם את תכולת צינור התערובת הראשי לתוך מאגר.
הגדר את הפיפטה האלקטרונית לשאוב 16 מיקרוליטר של תערובת מאסטר עם שני שלבי חלוקה של שמונה מיקרוליטר ואחריהם שלב טיהור. לאחר הגדרת הפיפטה שאבו 16 מיקרוליטר של תערובת מאסטר והתחילו לחלק לתוך צלחת גלגלים 384. חלק את שמונת המיקרוליטרים הראשונים לכל שורה שנייה בעמודה הראשונה באמצעות שורות A עד O, והשאיר את העמודה הבאה ריקה.
חלק את שמונת המיקרוליטרים השניים לאותן שורות של עמודה שלוש. לאחר מכן נקה מעל מיכל פסולת והשליך טיפים לפי דפוס זה של השארת שורות חלופיות ועמודות חלופיות. מחלקים על פני הצלחת לחמישה מחזורים נוספים כדי לערבב פיפטה מאסטר שניים.
השתמש באותן שורות כמו מאסטר מיקס אחד, אך התחל בעמודה שתיים. חזור על הליך זה עבור ערבוב מאסטר שלוש וארבע, החל מעמודות אחת ושתיים בהתאמה, אך הפעם באמצעות ורד B עד P.Her ציטוט של לוחית הפריימר. הגדר פיפטה אלקטרונית לשאיבת שני מיקרוליטר והוציא שני מיקרוליטר עם שלב טיהור לביצוע.
העבירו שני מיקרוליטרים של פריימרים מעמודה אחת שורה A ל-H של צלחת פריימר 96 באר לכל עמוד חתירה שני אחד מ-384 טיהור צלחת הבאר מעל מיכל פסולת והשליכו קצות. חזור על תבנית זו עבור פריימר quatt עבור שלושת תערובות המאסטר הנותרות של עמודות 1 ו-2. לאחר מכן המשך בתהליך זה עבור עמודות 2 עד 12 מתוך 96 לוחות היסוד של 96 הבאר הנעים על כל שני עמודים בלוח הבאר 384 עבור כל עמוד פריימר.
לאחר מכן, אטמו את הלוחות בתקרת אופניים קלה, נייר כסף וצנטריפוגה. זמן קצר לאחר צנטריפוגה. הנח את הלוחות במחזור קל ארבע 80 וסובב את הלוחות באמצעות פורמט זיהוי HRM הירוק הקיברנטי.
תוך שימוש באותם תנאי רכיבה כמו קודם, חזור על הליך זה באמצעות צלחת פריימר שני Eloqua לצלחת באר 384 טרייה באמצעות תערובות מאסטר טריות שהוכנו. חתימות מיקרו RNA קודמות מופיעות באמצעות פרופיל באמצעות מערך מבוסס QPCR חדשני. ה-CT הדלתא הממוצע כפי שהוא מנורמל ל-U 6 חושב וערכים מתוקננים נטענו למערך.
תוכנה מינורית המניבה שלושה אשכולות נפרדים המוצגים כמפות חום. הביטוי היחסי של כל מיקרו RNA מבשר מוצג באדום וכחול מייצגים עלייה וירידה בביטוי היחסי בהתאמה. עוצמת הצבע מציינת את מידת שינוי ההבעה.
רוב המיקרו-רנ"א הקודמים עברו שינויים קטנים ולא משמעותיים כצפוי. עם זאת, חלק קטן מהמיקרו-רנ"א המבשר גדל משמעותית במהלך ניסוי מהלך הזמן. בנוסף, הרמה היחסית של כמה מיקרו-רנ"א קודמים ירדה באופן דרמטי.
במקרים מסוימים. הם גם מתקבצים יחד בניתוח מפת החום. בהתאם לניסוי, עשויים להופיע אשכולות התלויים בזיהום ויראלי, ביטוי ספציפי לסוג התא של מיקרו-רנ"א מבשר או מיקרו-רנ"א מבשר המווסתים על ידי מולקולה משותפת או מסלול איתות.
מוצגים ספי המחזור הממוצעים או ה-cts מדגימה שלילית של נגיף הרפס הקשור לסרקומה של פוזי הפועלת כפול מרובע. חשוב לציין, האנטיגן הגרעיני הקשור לנגיף ההרפס הקשור לסרקומה של קפוסי או KSHV Lana לא זוהה בדגימה זו על ידי מערך ה-QPCR הרגיש ביותר. עם זאת, גם הבקרה הפנימית U 6 וגם let 7 a מיקרו RNA אנושי מבשר בעל ביטוי גבוה, באו לידי ביטוי ברמות הניתנות לזיהוי.
לבסוף, כצפוי, השליטה השלילית במים בדרגת PCR לא הניבה תוצר A-Q-P-C-R. ניתוח עקומת התכה לשני פריימרים שונים. מוצג שכפול דגימה זהה.
ברור שטמפרטורת ההיתוך שונה עבור שני זוגות הפריימרים, אך הדגימה נמסה באותה טמפרטורה בדיוק עבור כל שכפול. סימנים לדגימה גרועה או שעלולה להיות מזוהמת עשויים לכלול מספר שיאי התכה המרמזים על נוכחותם של שני מקורות קלט שונים. זה עתה הראינו לכם כיצד להגדיר ניסויי QPCR בזמן אמת באמצעות רובוט.
חשוב שתכלול את כל הבקרות וכמה שיותר גנים של משק בית. אז תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מדגים את ההגדרה והניתוח של מערכי pre-microRNA של 96 באריות ל-QPCR תוך שימוש בשיטות אוטומטיות וידניות כאחד. הנוהל נועד לאפשר הגדרה אוטומטית מהירה ואמינה של מערכי QPCR.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביוטכנולוגיה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- הכנת ערכות פריימרים למערכי QPCR.
- הגדרת תערובות מאסטר לדגימות לצורך סינון.
- שימוש במערכות רובוטיות או פיפטות אלקטרוניות לדיוק.
- ניתוח נתוני QPCR כדי לקבוע רמות ביטוי mRNA.
מטרת המחקר
- לאוטמט את הגדרת מערכי QPCR.
- להבטיח הכנה מדויקת של דגימות.
- לנתח רמות ביטוי של מספר mRNAs.
שיטות בשימוש
- הכנת ערכות פריימרים ותערובות מאסטר לדגימות.
- הגדרה רובוטית אוטומטית של PCR או פיפטוט ידני.
- ביצוע תגובות PCR באמצעות מעגל תאורה.
- ניתוח נתונים לרמות ביטוי יחסיות של mRNAs.
תוצאות עיקריות
- הגדרה מוצלחת של מערכי QPCR תוך שימוש בשתי השיטות.
- קביעה מדויקת של רמות ביטוי mRNA.
- יכולת לנתח סטים גדולים של mRNAs.
- הדגמה של תהליכים אוטומטיים אמינים.
מסקנות
- הגדרות אוטומטיות משפרות את היעילות ב-QPCR.
- שיטות ידניות נותרות ברות קיימא לתוצאות מדויקות.
- התוצאות מספקות תובנות לגבי שינויים בביטוי mRNA.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Profiling pre-microRNAs and mature microRNAs using qPCR arrays enables biopharma R&D teams to interrogate post-transcriptional regulatory networks with high sensitivity and low input requirements. This approach supports target validation by linking miRNA expression changes to disease-relevant pathways, particularly in oncology and infectious disease models. The method’s cost-effectiveness and compatibility with automated workflows enhance reproducibility and scalability for screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of miRNA processing stages by profiling both precursor and mature forms to identify regulatory bottlenecks.
- Operational Value: Uses SYBR-based chemistry and internal controls (e.g., U6) to reduce variability and improve data reliability across replicates.
- Predictive Value: Simultaneous detection of pre-miRNA and mature miRNA changes provides insight into Dicer activity and pathway-specific regulation, supporting mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The 186-primer array allows high-throughput profiling of miRNA precursors across disease models, such as human tumors or virus-infected cells.
- Operational Value: Compatible with automated robotic setup (e.g., Tecan EVO) or matrix electronic pipettes, ensuring precise reagent dispensing into 384-well plates.
- Scalability: Enables rapid screening of large sample sets with minimal hands-on time, supporting assay standardization and cross-lab reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Detected changes in pre-miRNA levels (e.g., let-7a) reflect mature miRNA expression, serving as early biomarkers in preclinical models.
- Pathway Insight: Clustering of miRNA expression patterns (via heat maps) reveals co-regulated networks linked to viral infection (e.g., KSHV latency) or cell-type-specific signaling.
- Risk Mitigation: Absence of false positives (e.g., no KSHV Lana detection in negative controls) confirms assay specificity, reducing off-target concerns in target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling early-stage hypothesis testing and assay readiness for downstream target validation and lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports functional interrogation of miRNA biogenesis pathways by quantifying precursor accumulation or processing defects.
- Screening: Generates quantitative CT values normalized to housekeeping genes, enabling comparative expression analysis across conditions.
- Analytics: Delta-CT calculations and heat map visualization facilitate identification of significantly altered miRNAs for follow-up validation.
- Translational Research: Links miRNA expression changes to biological phenotypes (e.g., viral infection response), supporting biomarker relevance assessment.
- Enterprise Reuse: Array design can be adapted to custom pathway- or pathogen-specific miRNA libraries, promoting reuse across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into miRNA regulation, reducing ambiguity in target pathway analysis.
- Operational Value: Automated setup improves reproducibility; manual pipetting option ensures accessibility for low-throughput labs.
- Strategic Value: Enables rapid go/no-go decisions based on miRNA expression signatures, reducing investment in poorly validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying miRNAs with consistent, significant expression changes across replicates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR design, including primer validation and normalization strategy selection.
- Needs access to real-time PCR systems with HRM or fluorescence detection capabilities (e.g., LightCycler 480).
- Demands standardized sample preparation (RNA quality, cDNA synthesis) to ensure comparable results across runs.
- Requires optimization for different input types (e.g., tumor tissue, cell lines) and adaptation to alternative miRNA libraries.
- Limited to relative quantification; absolute quantification requires standard curves not described in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
3:03
Setup of the Pre-miRNA Assay Using the Freedom Tecan Evo Robot
2:00
qPCR Reaction Sample Setup
8:00
Representative Results for Profiling of Pre-micro RNAs and MicroRNAs using qPCR Arrays
5:17
Setup of the Pre-miRNA Assay Using the Matrix Electronic Multichannel Pipette
1:21
Introduction
