Name: בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 51 s
Description: למד פרוטוקול להרדמה ודימוי חיות זחלי Drosophila melanogaster באמצעות desflurane לצפייה בסינפסות נוירומוסקולריות ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת קולטני גלוטמט לאורך מספר ימים עם שיעור הישרדות של 95%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים אנדריאס Schönle, מקס פלאנק, המכון לכימיה Biophysical, גרמניה דוד י סאנדסטרום, המכון הלאומי לבריאות הנפש, National Institutes of Health, Bethesda, MD, ארה&quot;ב ייעוץ טכני. אנו מודים פרנק Kötting, אירופה Neuroscience Institute, גטינגן לבניית תא הדמיה המכשיר הרדמה. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של Forschung אלצהיימר היוזמה TMRYZ נתמך על ידי מענק של מלגות סין המועצה, SBH על ידי מענק של המדרשה עבור תאית ומולקולרית Neuroscience, מאוניברסיטת טובינגן.

א ') בעצרת של תא הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר הזחל של השלב שנבחר (למשל מוקדם 3 rd הזחלים עוזבים instar מרווח התבוננות של כ 24 שעות במהירות של 25 ° C עד נדודים הבמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הזחל עם מים לנקות את זה במדיום תרבות מורחת אותו יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמל מרכז אלמנט התחתון של החדר, האזור להתמודד עם הזחל, עם שכבה דקה של שמן halocarbon. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו את הזחל עם הצד הגחוני מול המטרה מיקרוסקופ בחדר (מאפשר neuromuscular צומת (NMJ) 26 ו 27 כדי להיות צילמו) (איור 1 AE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את spacer פלסטי על שכבת שמן, עם חריצי אוויר של הפנים כלפי מעלה לרשת (איור 1). ודא בשלב זה: גובה spacer הוא בערך מחצית הקוטר הזחל, רוחב החריץ צריך להיות בערך פעמיים את הקוטר של הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא הדמיה על המיקרוסקופ </li></ol> ב) הרדמה של הזחל <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור שני פתחי הכניסה של החדר עם הרדמה מתאימה למכשיר / מאדה. אנא ודא-up מול: ריכוז יעיל של desflurane באוויר חדר לא יעלה על זה שצוין על ידי תקנות הבטיחות! רק בהיקף כולל קטן מאוד של desflurane יש צורך להרדים הזחלים. יישום של 15% (V / V) של 1 desflurane הוכיחה להיות נקודת התחלה טובה לקביעת ריכוז אידיאלי לשמש בניסוי. מטעמי בטיחות אנו מציעים מאדה לעולם לא יכילו יותר מ desflurane הדרושים 2-4 שעות בתחום ההדמיה vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הקצה השני של הצינור המחובר לשקע קאמרית כוס מים ולאחר מכן פתח את השסתומים שליטה על הזרימה של חומר הרדמה אל תוך החדר במשך כחמש שניות. ודא בשלב זה: האם לעלות בועות אוויר בתוך המים? אם לא חדר הוא דולף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את השסתומים במשך כשלוש שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג תנועות הזחל שיורית המיקרוסקופ. בדוק גם את פעימות הלב ואת תנועות שרירים. אם שסתומים לפתוח ולסגור הכרחי כמתואר בשלב 8 ו -9 עד הרדמה של הזחל תושלם, ואז לסגור את כל שסתומי ולהתחיל הדמיה. ודא בשלב זה: תנועת שריר הלב או שיורית מציין כי הזחל אינו מורדם כראוי. הרדמה מלאה חיונית תמונות ברזולוציה גבוהה. הזחל בדרך כלל לא צריך להיות מורדם יותר מ 15-20 דקות בכל זמן נתון. </li></ol> ג) הדמיה <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את העמדה הנכונה התמונה את המבנה של עניין (איור 2-4). </li></ol> ד) השחזור הרדמה <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הדמיה לתת אוויר לתוך החדר. ודא בשלב זה: בדוק דופק התכווצויות שרירים של זחל על ידי אור הלוגן המשודר. כאשר השרירים מתחילים קבלנות זה בטוח כדי להסיר את הזחל מן החדר הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק הקאמרית מהמכשיר הרדמה ולהסיר ממנו המיקרוסקופ. לפרק את התא בזהירות המקום הזחל במדיום לטוס מחית טיפוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את המנה באינקובטור בטמפרטורה המתאימה. </li></ol> ה) זמן סדרה <ol start="15" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים עד 2-14 נקודות מספיק זמן הושגו. פרוטוקול אלטרנטיבי: אם הזחל הוא להיות צילמו יותר מפעם אחת בתוך מרווח של 30 דקות זה יכול להיות מעשי להשאיר אותו בתא הדמיה עד נקודת הרדמה בפעם הבאה. חזור על השלבים עד 7-14 נקודות מספיק זמן הושגו. ודא בשלב זה: הזחל לא להיות כל הזמן בחדר הדמיה במשך יותר משעתיים בכל פעם, וגם לא להיות מורדמים יותר מ 15-20 דקות בכל פעם. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 העצרת של החדר הדמיה. (א) הנח את הזחל ואת spacer פלסטי על שכבת שמן. (ב) מקום 22 x 22 מ"מ לכסות להחליק על spacer ולהכניס את הטבעת מדריך פרספקס לתוך החדר, ליד (ג) לתקן את המיקום של הזחל עם טבעת מתכת (ד ') לסגור את החדר. (ה) עכשיו החדר הוא מוכן להיות מותקן על המיקרוסקופ. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> תרשים 2 קיר גוף שרירי הזחלים תסיסנית. שרירים NMJs היו דמיינו ידי ביטוי חלבון CD8-GFP-SH היתוך 8. השרירים מוצגים כפי שנצפה כאשר התמקדות בצד הגחוני באמצעות לציפורן לתוך הזחל. ב (AC) השריר השטחי ביותר, 27, מוצגת, ב (KL) שרירי פנים ביותר, 6 ו -7, מוצגים. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר, ΔZ בין פרוסות היא 2 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3 זהות הגוף קיר השרירים הזחלים תסיסנית. זהותו של השרירים הזחלים תסיסנית L3, A3 מגזר, מוצג. שרירים NMJs היו דמיינו ידי ביטוי חלבון CD8-GFP-SH היתוך 8. השרירים מוצגים כפי שנצפה כאשר התמקדות בצד הגחוני באמצעות לציפורן לתוך הזחלים. ב AC השריר השטחי ביותר, 27, מוצגת, ב KL את השרירים הפנימיים ביותר, 6 ו -7, מוצגים. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר, ΔZ בין פרוסות היא 2 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4 זהות של צמתים neuromuscular של הזחלים תסיסנית. (AD) NMJs היו דמיינו ידי ביטוי של חלבון היתוך DGluRIIA-mRFP 1. NMJs מוצגים כפי שנצפה כאשר התמקדות בצד הגחוני באמצעות לציפורן לתוך הזחל. ב (AB) NMJ שטחית ביותר, 27, מוצגת, ב CD NMJs הפנימי ביותר, 6 ו -7, מוצגים. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר, ΔZ בין פרוסות הוא 5 מיקרומטר. (ה) ו - (F) את זהותו של השטחי (E) פנים יותר (F) NMJs ניתנת התייחסות.

<ol><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li>
<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+vivo+imaging+of+long-term+changes+in+the+Drosophila+neuromuscular+system+%5B%5D%22">In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]</a>. , Georg-August-University Göttingen. (1988).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &amp, Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה פותחה בתחילה הציג ללמוד סינפסות glutamatergic על הקיר שרירי הגוף של הזחלים melanogaster תסיסנית. Neuromuscular תסיסנית צומת (NMJ) מתאפיינת בארכיטקטורה Cyto-סטריאוטיפית של השרירים נוירונים ועל כן אידיאלי עבור הדמיה vivo. עם זאת, פרוטוקול הרדמה המתואר אינו מוגבל הדמיה NMJ; את השקיפות של הזחלים תסיסנית מאפשר עיבוד של פרוטוקול המתואר ללמוד על התפתחות איברים, הגירה של תאים, הובלת מטען axonal ותת הסלולר מחדש בתוך התאים.

ריאגנטים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desflurane (Suprane, בקסטר, Unterschleissheim, גרמניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Halocarbon שמן (למשל Voltalef H10S שמן / Atofina, Puteaux, צרפת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוס בינוני תרבות </li></ul> ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ confocal הפוך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשקפת מיקרוסקופ (למשל STEMI 2000, Carl Zeiss, Jena, גרמניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכחול קטן כמו משמש מעין זבובים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגרה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מותאמים אישית, שנבנו הדמיה (עבור ציורים מכני לראות שופט. 3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאדה / הרדמה המכשיר (לפרטים ראה Ref. 3) </li></ul>

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

שיפורים אחרונים הדמיה אופטית, fluorophores מקודדים גנטית וכלים הגנטי המאפשר הקמת יעיל של קווי הרצוי חיים מהונדס אפשרו תהליכים ביולוגיים להיחקר בהקשר של פרנסה, ובמקרים מסוימים אפילו מתנהג, האורגניזם. בפרוטוקול זה נתאר כיצד להרדים שלם הזחלים תסיסנית, באמצעות הרדמה נדיפים desflurane, לעקוב אחרי התפתחות של אוכלוסיות פלסטיות סינפטית על המשנה הסלולר ברזולוציה 1-3. בעוד שיטות שימושיים נוספים להרדים הזחלים תסיסנית melanogaster תוארו בעבר 4,5,6,7,8, פרוטוקול המוצגת כאן ממחישה שיפורים משמעותיים בשל התכונות הבאות מפתח משולב: (1) רמה גבוהה מאוד של הרדמה, אפילו פעימות הלב הוא נעצר המאפשר ברזולוציה ננומטר לרוחב של עד 150 1, (2) שיעור הישרדות גבוה של 90%&gt; בכל מחזור הרדמה, המתירה הקלטה של יותר מחמש נקודות זמן על פני תקופה של שעות עד ימים 2 ו ( 3) רגישות גבוהה המאפשרת לנו 2 מקרים ללמוד את הדינמיקה של חלבונים לידי ביטוי ברמות פיזיולוגיות. בפירוט, היינו יכולים לחזות את קולטן הגלוטמט postsynaptic למקטע GluR-IIA לידי ביטוי באמצעות האמרגן אנדוגני 1 בקווים מהונדס יציבה קו מלכודת אקסון FasII-GFP 1. (4) בניגוד לשיטות אחרות 4,7 הזחלים ניתן הדמיה לא רק חי, אלא גם שלמות (כלומר לא גזור) המאפשר תצפית להתרחש על פני מספר ימים 1. הפרטים וידאו המלווה את הפונקציה של חלקים בודדים של in vivo הדמיה תא 2,3, הנכון הרכבה של הזחלים, הליך הרדמה, איך מחדש לזהות עמדות ספציפיות בתוך הזחל לבין הסרת בטוחה של הזחלים מן הדמיה קאמרית.

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של שלם<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; הזחלים. יש לנו ניצלו את הרדמה נדיפים desflurane כדי לאפשר הדמיה חוזרות ברזולוציה המשנה הסלולר מחדש זיהוי מבנים של עד כמה ימים<sup&gt; 1</sup&gt;.

שיפורים אחרונים בדימות אופטי, פלואורופורים מקודדים גנטית וכלים גנטיים המאפשרים הקמה יעילה של בעלי חיים טרנסגניים רצויים...

פריצות דרך בדימות אופטי ובפליאורסצנציה מקודדת גנטית אפשרו למדענים לחקור את התהליכים הביולוגיים המעניינים אותם באורגניזם חי ובמקרים מסוימים אפילו באורגניזם מתנהג. בעוד שדגש רב הושם על חקר המוח של יונקים in vivo, המעבדה שלנו משתמשת במערכת מודל פשוטה למדי, הצומת העצבי-שרירי של הטרכיה, ובסרטון הבא נסביר כיצד להרדימ ולהדמייץ זחלי זבוב פירות כדי לעקוב אחר התפתחותן של סינפסות בודדות לאורך זמן, בטווח של שעות ועד ימים. למרות שקיימות שיטות לחקר התפתחות הזבוב, הפרוטוקול שיוצג מאופיין במאפייני מפתח הבאים.ראשית, ברמה גבוהה מאוד של הרדמה, נפסק אפילו דופק הלב, דבר החיוני לאיכות תמונה גבוהה. שנית, שיעור ההישרדות עומד על 95% וקיימת יכולת להשיג תמונות רגישות מאוד. הפרוטוקול הבא מאפשר לנו, למשל, לחקור את הדינמיקה של קולטני גלוטמט המסומנים ב-GFP ומבוטאים ברמות פיזיולוגיות על ידי הפרומוטורים האנדוגניים שלהם.כעת תלמדו כיצד להכניס את הזחלים לתא הדימות, כיצד להרדימם, כיצד למצוא מיקום ספציפי בתוך הזחל כדי לדמות את signups stair, ולאחר מכן גם כיצד להחלים את הזחלים מהתהליך. לפני דימות in vivo, חשוב לשטוף את הזחלים. למרות שתהליך זה הוא פשוט, יש לנקוט זהירות כדי לא לפגוע בזחלים, ולכן לעולם אין להשתמש בפינצטה כדי להזיז אותם.במקום זאת, נבחר בתנועות עדינות באמצעות מברשת. המים המשמשים לשטיפה הם בטמפרטורת החדר, וזהו מי ברז רגילים שאינם מזוקקים ואינם מכילים חומרי ניקוי. ניתן לראות זאת.הוא מעביר בעדינות את הזחלים מהמזון אל מי ברז טריים כדי להשיג תוצאות טובות. חיוני להשאיר את הזחלים במים למשך זמן קצר ככל האפשר. פעולה זו תמנע חדירת מים לקשיי הנשימה (trachea), דבר המעכב את הנשימה ואת תהליך ההרדמה.בשלב הבא, נכין את תא ההדמיה. ראשית, נמרח שכבה דקה מאוד של שמן על האלמנט התחתון של התא. לאחר מכן, נניח את ה larvae מעל שכבת שמן זו.חשוב להקפיד כאן שקצות הצינורות לא ייגעו בשמן. לאחר המיקום, נניח רשת מפרידה מעל הלרובות. חשוב שהשלושה תעלים יפנו כלפי מעלה, ובכך יאפשרו אספקת אוויר ללרובות וימנעו סתימה על ידי השמן.כעת נניח לוכית כיסוי על גבי המרווח ונבדוק שהזחל ממוקם כראוי. כלומר, הצד הוונטרלי פונה כלפי מטה והצד הדורסלי, שבו ניתן לראות את הקנה (trachea), פונה כלפי מעלה. כעת נניח את טבעת ההתאמה מפלסטיק וכן טבעת מתכת כדי להבטיח שהזחל נלחץ בצורה חלקה בין שתי לוחות הזכוכית שמעליו.כעת אנו סוגרים את תא ההדמיה ומעבירים אותו למיקרוסקופ הקונפוקאלי כדי להתחיל בהדמיה. כעת מניחים את תא ההדמיה עם הזחלים המורכבים על גבי המיקרוסקופ הקונפוקאלי שלנו.שלושה צינורות יוצאים מתא ההדמיה. אחד מחובר לחומר ההרדמה די-פלואורין. אחד הוא צינור יציאה, והצינור האחרון מאפשר לאוויר רענן להגיע לזחלים.לאחר חיבור תא הלרוות למכשיר ההרדמה, חשוב לוודא שהלרווה ממוקמת נכונה. לאחר מכן, Yao מאפשר לאוויר להיכנס למערכת ההרדמה באמצעות המשאבה. בשלב זה, חשוב לוודא שהלחץ בתא אינו עולה על המקסימום המומלץ.לאחר מכן, הוא מכניס את צינור היציאה למים כדי לוודא שקיימת זרימת אוויר. הבועות בבקבוק המים מעידות על זרימת האוויר. כעת הוא פותח לאט את השסתום ומאפשר ל-difluorine לזרום לזמן קצר דרך הצינורות.בעקבות ההרדמה הראשונית, חשוב לבדוק כיצד הלבה מגיבה. אם הלב עדיין פועם, יש להמשיך במתן חומרי הרדמה כפי שניתן לראות המתרחש. כאן, בחלק הבא, נציג לכם את הלבה תחת המיקרוסקופ.כעת ניתן לראות את החלק הקריטי של תהליך ההרדמה דרך המיקרוסקופ. בתחילה, ניתן להבחין בתנועות הזחלים בעוד השרירים ממשיכים להתכווץ. ברגע שהתנועות מתחילות להאט, סורקים את הזחלים למעלה ולמטה ועוקבים אחר התרחשות ההרדמה.התנועות מאטות ובסופו של דבר פוסקות. לאחר הפעלת מספר פולסי הרדמה, ניתן לראות שהלבה הפסיקה לנוע והתנועה היחידה הנצפית היא עקב שינויים במיקרוסקופ. כדי לקבוע את מידת ההרדמה, חשוב לבדוק את קצב הלב.He yao ממקד את המבט עמוק לתוך הלבה, שם ניתן לראות בעיקר את גוף השומן (fat body). באופן חשוב, ניתן לראות את האזור שסביב הלב, וניכר כי פעימות הלב נעצרו ולכן הזחליל מוכן לדימות. קושי מרכזי אחד בדימות in vivo הוא הזיהוי של הצומת העצבית-שרירית שמעניינת את החוקר.כדי לסייע לכם בכך, נראה כיצד הדבר נראה בעת סריקה של הזחלים. לאחר מכן תוכלו לראות חיבור עצבי-שרירי שבו אנו משתמשים בדרך כלל לצורך דימוי. כעת נתחיל לבצע מיקוד איטי לתוך הזחלים.בהתחלה, על פני השטח של הקוטיקולה, ניתן לראות שרירים המופיעים ונעלמים. חלק מהם מודגשים. הסרטון מציג מבנה היתוך מלאכותי המכיל את הדומיין הטרנס-ממברנלי של CD8, GFP, ואת האזור הקצבי של ה-C של חלבון תעלת הברזל Shaker.מבנה זה ממוקם בכל ממברנות השריר ומראה נוכחות מוגברת בחיבור העצבי-שרירי. כעת נפעיל את הסרטון במהירות איטית יותר, ובעזרת איורים שתיים ושלוש תוכלו לזהות שרירים בודדים ככל שהם מופיעים ונעלמים. בעוד שזבובים אלו שימושיים במיוחד ללימוד דימוי in vivo, אנו משתמשים בדרך כלל בפסיונים המבטאים סמנים המסמנים רק אזורים פוסט-סינפטיים או פרה-סינפטיים של הסינפסה.מכיוון שאלו אינם מסמנים את כל שטח השריר, קשה הרבה יותר לזהות את אותו המיקום בפגית. בסרטון זה, אנו מראים קולטני גלוטמט המסומנים ב-RFP. הסרטון מראה אותנו מתמקדים בתווית, והדגשנו חיבורים עצביים-שריריים בודדים.נציג את הסרטון שוב בקצב איטי יותר, ותוכלו לזהות את הצמתים העצביים-שריריים הבודדים בעזרת איור 4. כעת, לאחר שהצגנו את התשתית התאורטית, נדגים דוגמה מעשית.כעת נתמקד במעבר העצבי-שרירי 27 בזבובים המבטאים MHC CD eight GFP. לאחר הגדלת הזום הדיגיטלי, אנו ממקמים מחדש את המעבר העצבי-שרירי ולאחר מכן נעים בכיוון C לעבר האזור המרכזי כדי להבטיח שהזבוב ממוקם כראוי ושאין לנו פיקסלים עם חריגת תאורה או רוויה. ניתן לראות את הפיקסלים הרווים בצבע אדום, ובניגוד להם, פיקסלים שאינם רווים מוצגים בכחול.אנו מפחיתים את עוצמת הלייזר ומבצעים סריקה חוזרת. כעת יש לנו הגברה ועוצמת לייזר מתאימות, ולפיכך אין עוד אזורים בעלי רוויה יתר. כעת חשוב לסמן את מיקום הצומת העצבי-שרירי בכיוון C.ראשית, נסמן את מיקום הסריקה התחתון ולאחר מכן את מיקום הסריקה העליון כדי לאפשר הקלטה מדויקת של כל ערימת ה-CST. בדרך כלל נשתמש בגודל פיקסל של 100 nanometers על 100 nanometers והמרחק ב-C הוא 500 nanometers. אם איננו מתכננים לבצע דקונבולוציה (deconvolution) לאחר הצילום לצורך עיבוד התמונות, נגדיר את ההגברים (gains) לרמה מתאימה כדי למנוע רעשים, אך גם כדי לאפשר שימוש בעוצמת לייזר חלשה יותר לצמצום הדהייה (bleaching) לאחר השלמת ערימת ה-CST.הצומת העצבית-שרירית המבטאת את מבנה ה-M-H-C-C-D-H shaker GFP מוקלטת כראוי. בחלק הבא, נשלים תהליך דומה המתמקד בקולטני הגלוטמט. כדי להקליט את קולטני הגלוטמט המסומנים ב-RFP, נתמקד שוב דרך הקוטיקולה וכעת נראה את הצמתים העצביים-שריריים הבודדים בסגמנט A 3.לאחר ביצוע זום על המצמד העצבי-שרירי הימני, אנו ממקמים אותו מחדש במרכז שדה הראייה. כפי שנעשה בעבר, עלינו לוודא שאין פיקסלים רוויים מדי או חסרי רוויה. שוב, ניכר כי חלק מהפיקסלים רוויים מדי, ולכן אנו מתאימים את ההגדרות ומבצעים סריקת בדיקה נוספת.ההגברים בעוצמת הלייזר כווננו כעת כראוי. כעת חשוב להגדיר את גבולות מחסנית ה-CST על ידי זיהוי המיקום העליון ואימותו, ולאחר מכן את המיקום התחתון. כעת נוכל להתחיל לסרוק את המישורים הבודדים של המעבר העצבי-שרירי.חשוב לבצע מספר סריקות רקע של חתכים ממש מתחת ומעל למסוף העצבי-שרירי כדי למנוע החמצה של סינפסות הממוקמות שם. לאחר סיום הסריקה במיקרוסקופ הקונפוקלי, נבצע השלכה של המסוף העצבי-שרירי כדי לראות תוצאה טיפוסית המתקבלת בדימות in vivo. חשוב לשמור תמונה זו לצורך השוואה לסריקות שיבוצעו בנקודות זמן מאוחרות יותר, כדי שניתן יהיה לזהות מחדש את המסוף העצבי-שרירי ואתרים שונים, כגון סינפסות חדשות או מקלות סינפטיים (synaptic batons).לאחר השלמת הדמיה מוצלחת, חשוב להעיר את הלבה במהירות ולהוציאה מיד מתא ההדמיה. Yao מבצע זאת כעת תוך ניטור רציף של הלבה, והוא מכוון את מכשיר ההרדמה כך שאוויר צח, ולא רק פלואורין, יזרים במערכת.כעת הוא מניח את מוצא התא בתוך המים, ובועות האוויר מעידות על כך שאוויר זורם דרך המערכת. הוא עוקב באופן רציף אחר הזחלים כדי לוודא שפעימות הלב מתחדשות והזחלים מתעוררים. בדומה לתהליך ההרדמה, מומלץ לספק לזחלים מספר פולסים של אוויר כדי להבטיח התעוררות מוצלחת.כעת ניתן לראות במקרוסקופ את מה שעושה ya. ניתן לראות כאשר הוא מזריק אוויר למערכת. שינויי לחץ נוצרים בתא, אשר גורמים לתנועות מלאכותיות בזחלים.בסופו של דבר, הזחל מתחיל להתרחב באופן עצמאי, דבר שבאה לידי ביטוי בצורה הטובה ביותר בתחילת תנועות הלב, ולכן אנו מתמקדים בתוך הזחל כדי שנוכל לראות תנועות אלו בצורה ברורה יותר. ניתן להבחין בפעימות קצביות המעידות על התעוררות מוצלחת של הזחל. לאחר התעוררות מוצלחת של הזחל, חשוב להוציאו מתא הדימוי.הזחלים נמצאים בחלק התחתון של התא, ולכן החלק העליון מונח בצד. יארה מסירה את המשקולת המתכתית ואת כיסוי הפלסטיק. לאחר מכן מסירה את זכוכית הכיסוי ואחריה את המרווח הפלסטי עם הזחלים.הוא מסיר בזהירות את ה larvae מהמפריד הפלסטי באמצעות המברשת. לאחר מכן, הוא טובל אותה לזמן קצר במים ומייבש אותה כדי להסיר שאריות שמן. ה larva מונחת כעת בתוך מזון טחון מראש ונשארת שם עד לשימוש חוזר.

in-vivo-imaging-of-intact-drosophila-larvae-at-sub-cellular-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

פרוטוקול זה דן חי דיסקציה...

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

למד פרוטוקול להרדמה ודימוי חיות זחלי Drosophila melanogaster באמצעות desflurane לצפייה בסינפסות נוירומוסקולריות ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת קולטני גלוטמט לאורך מספר ימים עם שיעור הישרדות של 95%.

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

גלה סרטונים נוספים