Name: בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: למדו לבודד ולגדול תאי אנדותל ריאתיים מעכברים ילודים באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים. שיטה זו מאפשרת קבלת תרביות טהורות לחקר ביולוגיה כלייתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן בחלקו על ידי איגוד הלב האמריקני להעניק 0950118G.to MC-W.

1. הכנת חרוזים מגנטיים אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות (Dynabeads) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן BSA 0.1% ב PBS על ידי ערבוב 50 מ"ג BSA ב 50 מ"ל PBS באמצעות מערבולת עד BSA מתמוסס. לעקר ידי סינון דרך המסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע TC, העברת 200 μl של resuspended גם אנטי עכברוש Dynabeads כבשים IgG לתוך צינור 1.5 Eppendorf מ"ל ולשטוף את החרוזים: צינור על הר MPC ולתת לשבת במשך דקות על 1 כדי לאפשר חרוזים משקעים. לשאוב supernatant, להסיר את הצינור מתוך MPC ו resuspend את החרוזים של 1 מ"ל סטרילי 0.1% BSA / PBS. פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף שלוש פעמים נוספות, ובסך הכל ארבע שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינור מ MPC ו resuspend את החרוזים 500 μl של 0.1% BSA / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl עכברוש אנטי עכבר PECAM-1 (CD-31) נוגדנים הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיועד לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר קר או 2 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם סטרילי 0.1% BSA / PBS כמתואר בשלב 1.2 ארבע פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינור מ MPC ו resuspend את החרוזים 200 μl 0.1% BSA / PBS. חנות אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות Dynabeads על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1. </li></ol> 2. בידוד ריאתי עכבר לתאי אנדותל מעכברים בילוד לפני שתמשיך עם פרוטוקול טיהור רקמות, IACUC אישור הוועדה של ההליך הנדרש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפעולות הבאות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 מ"ל של תמיסת 1 C / D מ"ג / מ"ל ​​DMEM. מסנן עם מזרק 0.22 מיקרומטר לסנן חם 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 צינור חרוטי מ"ל עם 15 מ"ל DMEM, לאחסן על הקרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד מדיה (IM) המכיל 20% FBS ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין ב DMEM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג'לטין 2%. מערבבים 2 גרם של עור שור ג'לטין עם מים dd 100 מ"ל, החיטוי 15 דקות בחנות ב 4 ° C. חם עד 37 ° C כדי לנזל לפני צלוחיות ציפוי TC. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי three 6-8 גורים יום ישנות באמצעות זריקה IP של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג). בדיקת היעילות של הרדמה לנתח חיות אחד אחד, כדלקמן: גורים פין ללוח, להשרות עור עם אתנול 70% ולהסיר עור מאזור החזה במספריים לנתיחה סטרילית. כלוב הצלעות והבלו לחשוף את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלו בסביבה נקייה מחיידקים אונות ריאה בודדות, נזהרים שלא לנתח את הסמפונות וכל רקמת חיבור גלוי סביב הריאות. מערבבים את כל הריאות ב קר כקרח DMEM. להרדים את הגורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה למכסה המנוע TC, להסיר אונות ריאה מן DMEM, מקום צלחת 100 מ"מ ו - TC לשאוב DMEM עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים סטריליות, לקצץ את הרקמה דק ידי חיתוך ~ 100 פעמים. העברה 15 מ"ל פתרון חמים C / D של עיכול אנזימטי. דגירה 45 דקות 37 ° C על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע TC, לשאוב את ההשעיה רקמות מעוכל לתוך מזרק כדי 20 מ"ל עם 14 גרם גושים הצינורית מחוברת triturate לתוך ההשעיה תא בודד, לפחות 12 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את ההשעיה רקמה דרך מסננת תא 70 מיקרומטר ו לשטוף את מסננת עם 15 מ"ל IM להפסיק העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ההשעיה התא על ידי צנטריפוגה בשעה 400x גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 3 מ"ל 0.1% BSA / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה תא 5 הצינור מסביב לתחתית מ"ל פוליסטירן ולהוסיף 22.5 μl אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות Dynabeads. מיועד בטמפרטורת החדר למשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל בקבוקון T75 עם 2 מ"ל 2% לטין עודף לשאוב ג'לטין. ג'לטין אפשר להתייבש בתוך מכסה המנוע TC עבור כ -30 דקות לפני תאים ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה חרוז תושלם (שלב 2.10), השעיה לפצל תא באופן שווה לשלושה צינורות Eppendorf והר על MPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר החרוזים יש משקעים באמצעות MPC (~ 1 דקות), לאסוף supernatant, להסיר את הצינור מתוך MPC, לשטוף עם חרוזים ~ 1 מ"ל 0.1% BSA / PBS, ולאחר מכן לעלות שוב על MPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף ארבע פעמים (סה"כ 5 שוטף) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend ב 1 מ"ל של VascuLife עם EnGS-MV גורמים החיים קיט 1x פניצילין / סטרפטומיצין (VL) לכל צינור, לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט על בקבוק T75 מראש מצופה להביא הנפח הכולל בבקבוק 10 מ"ל כל אחד עם VL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התקשורת למחרת, לאפשר 1 יום שלם של צמיחה, ולאחר מכן שנה וחצי של התקשורת בכל יום אחר. כאשר התאים&gt; 70-80% ומחוברות או יותר (בדרך כלל לאחר 3-4 ימים של התרבות), הם יכולים להיות מסודר עם אנטי ICAM-2 Dynabeads. </li></ol> 3. הכנת אנטי ICAM-2-נוגדן מצומדות Dynabeads <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dynabeads Anti-ICAM-2-נוגדן מצומדות משמשים עוד לטהר תאים נבחרו עם אנטי PECAM-1 Dynabeads נוגדנים מצומדות ומתורבתים עד ומחוברות. הליך זה מבוצע כפי שתואר עבור Dynabeads אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות (1, לעיל), אלא אנטי עכבר ICAM-2 (CD-102) הנוגדנים משמש במקום נוגדן אנטי PECAM 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dynabeads Anti-ICAM-2-נוגדן מצומדות ניתן לאחסן 4 ° C עדחודש 1. </li></ol> 4. מיון ריאות עכבר לתאי אנדותל עם אנטי ICAM-2 Dynabeads <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T75 מעיל רקמה תרבות בקבוק עם 2% ג'לטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת מהבקבוק T75 ומחוברות עם תאים ולשטוף עם 8 מ"ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS, להוסיף 2 מ"ל 0.05% טריפסין / EDTA ולתת תאים לנתק (כ -5 דקות). הקש צלוחיות קלות לסייע ניתוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף 2 מ"ל IM לעכב תאים טריפסין ו לגרד לנתק את כל התאים הנותרים חסיד. העברת ההשעיה התא צינור 15 מ"ל ו - ספין למטה 5 דקות בשעה 400x g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת resuspend תא גלולה ב 2 מ"ל 0.1% BSA / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים צינור 5 פוליסטירן מסביב לתחתית מ"ל ולהוסיף 10 μl אנטי ICAM-2 Dynabeads. מיועד עבור 12 דקות RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול התא השעיה לשני 1.5 מ"ל Eppendorf צינורות לעלות על MPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לאחר חרוזים דבקו למשך דקה אחת. הסר צינורות מ MPC ו resuspend כל הצינורית 1 מ"ל 0.1% BSA / PBS. טען מחדש על MPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף ארבע פעמים (סה"כ 5 שוטף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל צינור עם 1 מ"ל VL ולבצע ספירת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים ב 250-350K תאים לכל בקבוק T25 ו / או 750 אלף-1 מיליון תאים לכל בקבוק T75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו נפח VL 5 מ"ל ב T25 צלוחיות, ו 10 מ"ל ב T75 צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התקשורת בכל יום אחר. תאים יכול לשמש בניסויים כאשר התרבות מגיע לכ 80% confluency, בדרך כלל 2-3 ימים. </li></ol> 5. נציג תוצאות בדרך כלל, לאחר 6-7 ימים מיום ההכנה הראשונית של התאים, אנו מסוגלים לקבל על 1.2-1.5 x 10 6 לתאי אנדותל ריאתי משלושה 6-8 גורים בני יומם. תאים להציג מורפולוגיה טיפוסית "המרוצף" תחת מיקרוסקופ אור ולהראות VE-cadherin (CD144) מכתים על תאים תאים צמתים, האופייני לתאי האנדותל (איור 1). רוב MLECs להביע VE-cadherin ו VEGFR2 כפי שמגלה הניתוח FACS (איור 2). בדרך כלל, אנחנו משתמשים בהם לניסויים תוך שבועיים לאחר הבידוד MLEC הראשונית. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ניתוח מיקרוסקופי של monolayer MLEC ומחוברות. (א) תמונת מיקרוסקופ אור המרוצף מראה מורפולוגיה של תאים בתרבית אופייני לתאי אנדותל. מבנים עגולים אחיד הממוקם באזור perinuclear של תאים רבים הם חרוזים מגנטיים המשמשים לבידוד MLEC. (ב) האנדותל ספציפי VE-cadherin הוא מקומי על תאים תאים צמתים כפי שמוצג באמצעות מיקרוסקופיה confocal. בר הוא נציג של 20μm. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2 ניתוח FACS של MLECs תרבותי שכותרתו עם נוגדנים ספציפיים עבור אנדותל הסמנים הספציפיים:. VE-cadherin (CD144) או VEGFR2, הוגש נגדו כתב אישום כמו, ואחריו נוגדן phycoerythrin-מצומדות משנית, מאשרת זהות אנדותל של MLECs מבודדים. הקו האדום מציין אלוטיפ ספציפי שליטה, הקו הירוק מציין VE אנטי-cadherin או אנטי VEGFR2 - ספציפי-IgG.

<ol><li>Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+endothelial+cell+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zellforsch+Mikrosk.+Anat%22%5BJournal%5D)">The human endothelial cell in tissue culture.</a> Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).</li>
<li>Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+heart+and+lung+endothelial+cells+for+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems.</a> Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+I.+Structure%2C+function%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circ Res. 100, 158-173 (2007).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).</li>
<li>Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+gliomas+of+different+WHO+grades%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades.</a> J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).</li>
<li>Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+brain%2C+lung%2C+and+kidney%3A+expression+of+the+multidrug+resistance+P-glycoprotein+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).</li>
<li>Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+murine+inguinal+and+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues.</a> J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).</li>
<li>Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+vascular+endothelial+cadherin+%287B4%2Fcadherin-5%29%2C+an+endothelium-specific+cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).</li>
<li>Zachary, I., Gliki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+transduction+mechanisms+mediating+biological+actions+of+the+vascular+endothelial+growth+factor+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family.</a> Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).</li>
<li>Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+heart-derived+endothelial+and+smooth+muscle+cell+cultures%3A+isolation%2C+cloning+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization.</a> Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).</li>
<li>Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li>
<li>Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+angiogenesis%2C+endothelial+migration%2C+proliferation%2C+and+MAPK+signaling+in+Rap1b-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice.</a> Blood. 111, 2647-2656 (2008).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית הספר לרפואה של ויסקונסין IACUC ועדת תחת פרוטוקול AUA # 00001206.

כלי הדם ECS הוכיחו להיות מודל שימושי בתחומים רבים של הביולוגיה כלי הדם הם האמינו להיות יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ללמוד (אנגיוגנזה למשל) מאשר HUVECs למד נרחב 3. בעבר, זה כבר דיווחו כי כלי הדם ECS ניתן להשיג, כליות רקמת לב, שומן, עור הרשתית, מוח, גליומות, וגם ריאה 2, 4-7, 10, 11. עם זאת, שיטה עקבית ואמינה הבידוד של כלי הדם ECS עדיין נדרשת. הנוהל המובא כאן הוא שינוי של הפרוטוקול שפורסם בעבר 2, זה שונה נהלים פרסם ביותר כי היא משתמשת במקום גורים של בעלי חיים מבוגרים. זה חיוני להצלחת בידוד כמו תאים מבעלי חיים צעירים בעלי פוטנציאל גבוה יותר ריבוי תרבויות שמקורם ברקמות שלהם נוטים להניב מספר גבוה יותר של תאים. אחת החיות בשבוע הישן נראה אופטימלי, אבל עכברים צעירים (4 בן יומו) יכול לשמש גם. כמו כן, מספר גבוה או נמוך של הגורים יכולה לשמש אם נדרש, כפי שאנו הצליחו לבודד MLECs מאחד הסיירים. עם זאת, בעוד דרוג כלפי מעלה או מטה את תהליך הבידוד, ציפוי צפיפות התאים חייב להישאר ללא שינוי, כמו זה גם קריטי עבור התפשטות תאים. תהליך צעד 2-טיהור MLECs באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדות הראשון נגד PECAM-1 ו מאשר אנטי ICAM-2 נוגדנים הוא הרבה יותר יעיל בהשגת טהור תרבויות EC מאשר אחד צעד את התהליכים שתוארו לעיל טיהור. פרוטוקול זה מבטל את הצורך להשתמש בטכניקות ידני מייגע מאוד, צנטריפוגה שיפוע FACS פחות יעיל מיון עבור תאים השלכת מזהמים כגון fibroblasts, כדוריות דם ותאי שריר חלק. האוכלוסייה MLEC וכתוצאה מכך ניתן להשתמש בניתוח מבחנה של תגובות angiogenic, חדירות כלי הדם גלגול ליקוציט, ריפוי פצעים, כמו גם ניתוח ביוכימי של מסלולי איתות. במידת הצורך, ניתן MLECs מצופה על גבי משטחים שונים כגון coverslips פיברונקטין או ג&#39;לטין מצופה עבור מערכים immunofluorescence או אלקטרודה עבור טרנס האנדותל (TER) מדידות של התנגדות. התוצאות המתקבלות ניתן להשוות ישירות פנוטיפים נצפתה in vivo, אשר חשוב במיוחד בהקשר של מספר גדל והולך של נוקאאוט קווי עכבר מהונדס. יישום מוצלח של השיטה עבור בניתוח מבחנה של מנגנוני הסלולר הבסיסית פגמים נצפתה in vivo, כבר הציגה 12.

<table><tbody><tr><td>מספרי קפיץ</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>קנולה 14G</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 20 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads נגד IgG של חולדה</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>מרכז חלקיקים מגנטי (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן anti-mouse PECAM-1 (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן anti-mouse ICAM-2 (CD-102) </td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז/דיספאז (C/D)</td><td>קבוצת Roche</td><td>11097113001</td><td>ניתן להכין תמיסת מלאי בריכוז של 100mg/ml ולאחסנה ב-20°C-&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>ערכה מלאה של Vasculife EnGS-Mv (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin/EDTA </td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תאים 70 &amp;mu;ניילון m</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק לתרביות רקמה 75 סמ"ר&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

לתאי אנדותל לספק מודל מחקר שימושי בתחומים רבים של הביולוגיה וסקולרית. מאז הבידוד הראשון שלה 1, אדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVECs) הראו להיות נוח, קל להשיג והתרבות, ובכך הם לתאי אנדותל ביותר למד נרחב. עם זאת, המחקר התמקד בתהליכים כמו אחרים, אנגיוגנזה חדירות או רבים, לתאי אנדותל כלי הדם (ECS) הם מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית הרבה יותר ללמוד 2. יתר על כן, ECS מבודד עכברים knockout לספק כלי יעיל לניתוח של vivo תפקוד החלבון לשעבר. מספר גישות לבודד כלי הדם תרבות ECS ממוצא שונה דווחו עד כה 3-7, אבל הבידוד תרבות עקבית של טהור ECS עדיין בעיה טכנית גדולה במעבדות רבות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד על שיטה אמינה פשוטה יחסית של בידוד ועכבר culturing הריאות לתאי אנדותל (MLECs). בגישה זו, רקמת הריאה המתקבל 6 - עד היום-8 גורים הישן החתך הראשון לחתיכות, מעוכל עם collagenase / dispase (C / D) פתרון והתפזרו מכני לתוך ההשעיה תא בודד. MLECS הם מטוהרים מן ההשעיה התא באמצעות סלקציה חיובית עם נוגדן אנטי PECAM-1 מצומדות כדי Dynabeads מרוכז באמצעות חלקיקים מגנטיים (MPC). תאים אלה בתרבית מטוהרים על תרבות ג&#39;לטין מצופה רקמה (TC) מנות עד שהם הופכים ומחוברות. בשלב זה, התאים עוד מטוהרים באמצעות Dynabeads מצמידים את הנוגדן אנטי ICAM 2. MLECs שהושגו עם פרוטוקול זה תערוכה פנוטיפ המרוצף, דמיינו כפי מיקרוסקופיה שלב לעומת האור, פנוטיפ האנדותל שלהם אושרה באמצעות ניתוח FACS עם אנטי VE-cadherin 8 ואנטי VEGFR2 9 נוגדנים מכתים immunofluorescent של cadherin-VE. בידיים שלנו, זה הליך בן שני שלבים בידוד עקבית ומהימנה התשואות אוכלוסייה טהורה של MLECs, אשר יכול להיות מתורבת יותר. שיטה זו תאפשר לחוקרים לנצל מספר גדל והולך של בנוקאאוט ו העכברים הטרנסגניים ישירות לתאם במחקרים vivo עם תוצאות של ניסויים במבחנה שבוצעו על MLECs מבודד ובכך לסייע לחשוף את המנגנונים המולקולריים של פנוטיפים כלי דם נצפתה in vivo.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.

תאים אנדותליאליים מהווים מודל מחקר שימושי בתחומים רבים של ביולוגיה וסקולרית. מאז בידודם הראשוני 1, תאים אנדותליאליים מווריד טבילי אנושי...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ולגדל תאי אנדותל ריאתיים מעכברים בניאונטליים. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת תרחיף תאים הומוגני מריאות שנקטפו טרי. לבסוף, את הרקמה קוצצים ומעבירים לעיכול אנזימתי, ולאחר מכן מבצעים העשרה לתאי אנדותל באמצעות חרוזי מגנט המשורשריים לנוגדן anti P chem one.תרבית CETA מטהרת את אוכלוסיית התאי האנדותל. לאחר מכן, באמצעות חרוזים מגנטיים המשולבים עם נוגדן anti I chem two, מגדילים תאים אלו בבקבוק מצופה ג'לטין. תאי האנדותל הריאתיים הראשוניים המתקבלים הם לרוב ממקור מיקרו-וסקולרי ומבטאים סממנים ספציפיים של תאי אנדותל כגון TERRIN ו-VEGF R two.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון השתקת גנים באמצעות irna, הוא שהיא מאפשרת שימוש בעכברים טרנסגניים להשגת תאי אנדותל שעברו מודיפיקציה גנטית. יתרה מכך, תאי אנדותל המופקים בטכניקה זו הם ברובם ממקור מיקרו-וסקולרי, וככאלה עשויים להיות רלוונטיים יותר לתחומים מסוימים של מחקר כלי דם. תאי אנדותל המופקים בשיטה זו יכולים לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הווסקולרית, כגון שאלות הנוגעות למנגנונים מולקולריים של אנגיוגנזה וחדירות כלי דם.הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, שכן שלבי עיכול הרקמה הגבולה ושטיפת התאים הקשוריים לחרוזים קשים ללימוד. ביצוע לקוי של טכניקה זו עלול להוביל לזיהום בתאים שאינם תאי אנדותל ולניצול תאים וצמיחה דלים. עבור פרוטוקול dyna beads זה, הכין 50 milliliters של 0.1%BSA ב-PBS וערבב באמצעות vortex עד להמסת ה-BSA, ולאחר מכן עקר את התמיסה על ידי העברה דרך מזרק עם מסנן של 0.22 micron.סנן תחת תנאים סטריליים במנדף לתרביות רקמה. השהה מחדש את חרוזי ה-dynabeads מסוג sheep, anti rat IgG והעבר 200 µL לשפופרת Eppendorf של 1.5 mL. כדי לשטוף את החרוזים, הצמד את השפופרת למרכז חלקיקים מגנטי (MPC) והמת דקה עד לשקיעת החרוזים, ולאחר מכן שאב את הנוזל העליון. הסר את השפופרת מה-MPC והשהה מחדש את החרוזים ב-1 mL של 0.1% B-S-A-P-B-S סטרילי.חזור על שטיפה זו שלוש פעמים נוספות לאחר השטיפה הרביעית. הוצא את המבחנה מה-MPC וה-Resus. השהה את החרוזיים ב-500 µL של 0.1% B-S-A-P-B-S.הוסיפו 10 µL של נוגדן rat anti mouse pcam one למבחנה וסובבו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר כפי שהודגם קודם לכן. שטפו את החרו지를 ארבע פעמים עם 0.1% B-S-A-P-B-S סטרילי. הוציאו את המבחנה מה-MPC והשביו לסuspended.את החריצים ב-200 µL של 0.1% B-S-A-P-B-S. הכנה זו של נוגדן anti P chem one המשורב ל-dyna beads נשמרת בטמפרטורה של 4 °C. כדי להשיג תאים ראשוניים, הרדימו שלושה גורים בני 6 עד 8 ימים.יש לוודא את יעילות ההרדמה על ידי צביטה של הזנבות באמצעות פינצטה. יש לנצח את בעלי החיים באופן רצופי. ראשית, הצמד את הגור ללוח והסר את העור מאזור החזה.באמצעות מספרי ניתוח, הסר את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הריאות. כעת, הסר באופן אסיפטי אונוני ריאה בודדות, תוך הקפדה לא לנתח את הסימפונות או כל רקמה חיבורית הנראית לעין סביב הריאות.שבחו את כל הריאות ב-DMEM קר בקרח לאחר השהיית הגורים. כעת עברו למבתר תרביות הרקמה. הוציאו את אונוני הריאה מה-DMEM והניחו אותם בצלחת תרבית רקמה בקוטר 100 מילימטר.שאבו את עודפי ה-DMEM וקצצו את הרקמה בעזרת מספריים סטריליים. לבסוף, בצעו כמאה חתכים לצורך עיכול אנזימטי. העבירו את הרקמה המוכנה ל-15 milliliters של תמיסת collagenase חמימה והדגירו למשך 45 דקות ב-37 degrees Celsius על רוטטור, כאשר מזרק של 20 milliliters מחובר לקנולה במידה 14 gauge כדי לפרק גושים של רקמה שעברה עיכול לתליה של תאים בודדים.כעת העבירו את תרחיף התאים דרך מסנן תאים של 70 מיקרומטר ושטפו את המסנן עם 15 מיליליטר של Im כדי להפסיק את תגובת העיכול. כדי לאסוף את תאי הריאה, סובבו במערך צנטריפוגה ב-400 Gs למשך חמש דקות ושאבו את הנוזל העליון. לאחר מכן, השעיקו מחדש את משקע התאים בשלושה מיליליטר של 0.1%B-S-A-P-B-S והעבירו לשפופרת פוליסטירן בעלת תחתית עגולה בנפח חמישה מיליליטר.כדי לבודד את התאים האנדותליאליים, הוסיפו 22.5 µL של נוגדן anti P chem one המצומד ל-dyna beads וגלגלו בטמפרטורת החדר למשך 12 דקות. בינתיים, ציפו בקבוק T 75 בשני מיליליטר של 2% gelatin. שאבו את תמיסת הג'לטין העודפת והניחו לה להתייבש באוויר בתוך מנדף תרביות הרקמה למשך כחצי שעה. ברגע שהדגירה עם החרוזים הסתיימה, חלקו את תרחיף התאים באופן שווה לשלוש מבחנות fendor והניחו אותן על ה-MPC.באמצעות מערכת ה-MPC, שטפו את ה-dyna beads חמש פעמים עם כ-1 מיליליטר של 0.1%B-S-A-P-B-S. לאחר השטיפה האחרונה, השביו את החרוזים ב-1 מיליליטר של VAs life לכל מבחנה. ערבבו היטב ואיחדו את כל המבחנות. זרעו את תכשיר תאי ה-dyna bead בבקבוק T 75 מקודם מראש, והביאו את הנפח הכולל בבקבוק ל-10 מיליליטרים באמצעות VAs life.כעת מקמו את הבקבוקים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וריכוז של 5% carbon dioxide. החליפו את המצע למחרת, אפשרו יום גדילה מלא, ולאחר מכן החליפו חצי מהמצע מדי יומיים עד שהתאים יגיעו למצב של מעל 70 to 80% confluent. כדי לטהר עוד יותר את תרבית התאים הראשונית, הכינו dyna beads מצומדים לנוגדנים כפי שהודגם קודם לכן, אך הפעם השתמשו בנוגדני CD 1 0 2 ו-muse I chem two.כסו גם בקבוק תרבית רקמה T 75 ב-2% ג'לטין כפי שהודגם קודם לכן. כעת הוציאו מהאינקובטור את בקבוק ה-T 75 עם התאים. שאבו את המצע ושטפו את התאים הראשוניים עם שמונה מיליליטרים של PBS.לאחר ה-PBS, הוסיפו 2 mL של 0.05% trypsin EDTA והמתינו כחמש דקות עד לניתוק התאים. הקפישו קלות את הבקבוק כדי לסייע לניתוק התאים. הוסיפו 2 mL של IM כדי לעכב את ה-trypsin וגרדו את התאים הדבקים שנותרו.העבירו את ת сусפנזיית התאים לפקתולה של 15 milliliter. אספו את התאים על ידי סרטיפוגציה למשך חמש דקות ב-400 GS, שאבו את המדיום והשביחו את משקע התאים בשני milliliters של 0.1%B-S-A-P-B-S. העבירו לפקתולה פוליסטירנית בעלת תחתית עגולה של חמישה milliliters והוסיפו 10 microliters של anti icam. Two dyna beads. גלגלו למשך 12 דקות בטמפרטורת החדר, חלקו את ת сусפנזיית התאים לשתי פקתולות einor של 1.5 milliliter והניחו על מערכת ה-MPC.כפי שנעשה קודם לכן, שטפו את החרו지를 ב-1 ml של 0.1% B-S-A-P-B-S-A סך הכל חמש פעמים. כעת, השעיו מחדש את התוכן של כל מבחנה ב-1 ml של VAs life ובצעו ספירת תאים. לבסוף, זרעו את התאים בריכוז של 800 עד 1000 K תאים לכל בקבוק T 75 ב-10 ml של VAs life. הניחו את הבקבוקים באינקובטור לתרביות תאים.החליפו את המצע בכל יום שני עד שהתרביות יגיעו לכ-80% fluency. התאים האנדותליאליים המזוקקים מהריאה של עכברים מוכנים לשימוש בניסויים. בדרך כלל, הכנת תאים משלושה גורים בני שישה עד שמונה ימים מניבה 1.2 עד 1.5 times 10 to the sixth תאים אנדותליאליים ריאתיים לאחר שבוע בתרבית.כצפוי, תאי אנדותל ראשוניים אלו מציגים מורפולוגיית cobblestone תחת מיקרוסקופיה של אור וכן מראים צביעה של VE coherent בחיבורים בין תאים. באמצעות פרוטוקול זה, רוב תאי האנדותל של ריאות עכבר מביעים VE coherent ו-VEGF R two כפי שהודגם בניתוח fax. הקו האדום מציין בקרת isotype ספציפית והקו הירוק מציין IgG ספציפי ל-anti VE או ל-anti-VEGF R two.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לאסוף רק את רקמת המטרה, להימנע מעיכול יתר של התאים ולשטוף ביסודיות את התאים הקשורים לחרוזים. תאי אנדותל שהתקבלו. ניתן להשתמש בפרוצדורה זו עבור בדיקות תפקודיות בתחום הביולוגיה של כלי הדם כדי לנתח תגובות הרלוונטיות לתפקוד של angiogenesis וחדירות כלי דם.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים תאי אנדותל ראשוניים מעכבר באמצעות נוגדן chem one ונוגדן chem two הקשורים ל-dyna beeps, וכיצד להשיג תרביות טהורות של תאי אנדותל.

isolation-culture-pulmonary-endothelial-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

פיתחנו רומן וטכניקה לשחזור לבודד את התרבויות העיקריות של תאי שריר חלק ריאתי עורקים (PASMC) מעכברים צעירים כP7 כ, ובכך לאפשר מחקר טוב יותר של מסלולי האיתות המעורבים בהתכווצות שרירים חלקה בילוד תא ורגיעה.

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

תאי האנדותל של כלי הדם ממלאים תפקיד משמעותי בהפרעות לב וכלי דם חשובות רבות. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד והרחבה של תאי אנדותל מאבי העורקים של העכבר ללא שימוש בציוד מיוחד. הפרוטוקול שלנו מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים בפיזיופתולוגיה של תאי אנדותל.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

פרוטוקול זה מוכן לחלוק את השיטה שלנו לבידוד תאי אנדותל כליליים של עכברים לצורך הדמיה או לביצוע ניסויים ביולוגיים מולקולריים.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

למרות שהוא מאתגר, הבידוד של תאי אנדותל ריאתיים חיוני למחקרים על דלקת ריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של תאי אנדותל מקרו-וסקולריים ומיקרו-וסקולריים.

בידוד וטיהור תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ומקרו-וסקולריים מדגימות שמקורן בריאה

פרוטוקול זה מציג שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לבידוד תאי אפיתל אלוואולריים מסוג II (AECII) חיוניים מריאות עכבריות יילודים, צעירות או בוגרות (נגועים או לא נגועים). גישה זו מאפשרת מחקרים מולקולריים ו/או פונקציונליים במורד התהליך של AECII לזהות את תפקידם במהלך דלקת וזיהום בריאותיים.

בידוד תאי אפיתל אלוואולריים מסוג II מריאות עכבריות יילודים, צעירים ובוגרים המתאימים לסביבות ניסוי זיהומי

למדו לבודד ולגדול תאי אנדותל ריאתיים מעכברים ילודים באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים. שיטה זו מאפשרת קבלת תרביות טהורות לחקר ביולוגיה כלייתית.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

גלה סרטונים נוספים