מעקב אחר דינמיקת זיהום חיידקי בעכבר באמצעות ביולומינסנציה

התחל בהשעיה של זן מוחלש של חיידק פתוגני.

הזן המוחלש מציג פתוגניות מופחתת עקב מחיקות ממוקדות בגנים אלימים.

החיידקים מסומנים כרומוזומלית עם אופרון ביולומינסנט המאפשר ייצור אור אוטונומי.

החיידקים מבטאים את האופרון הביולוגי, ומייצרים אנזים לוציפראז וקומפלקס אנזימים המסנתז את סובסטרט הלוציפראז.

לוציפראז מחמצן את המצע כדי לייצר אור נראה.

צנטריפוגה את המתלים והשליכו את הסופרנטנט.

שטפו את התאים עם מאגר, צנטריפוגה שוב והשליכו את הסופרנטנט כדי להסיר שאריות של רכיבים לא תאיים.

השעו מחדש את התאים במאגר כדי להשיג ריכוז חיידקים אופטימלי ולמשוך את התרחיף למזרק.

הזרקו את המתלה תוך צפקי לעכבר, ואז העבירו אותו לכלוב.

דמיין את האות הביו-לומינסנט במרווחי זמן קבועים.

הזן המוחלש נשאר מקומי, והביולומינסנציה פוחתת בהדרגה, מה שמעיד על פינוי זיהום.

בבוקר הזריקות, יש להפשיר את הקריוביאלים של תאי חיידקים בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש עד ארבע שעות. שמור את הבקבוקונים על קרח לאחר ההפשרה והזריק לעכברים תוך שעתיים. העבירו את תכולת כל קריוביאל לצינור חדש של שני מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4,500 פעמים G למשך 10 דקות.

השליכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של PBS. חזור על הצנטריפוגה והשהה מחדש את התאים ב-PBS לריכוז סופי של 2.5 כפול 10 ליחידות היוצרות מושבה תשיעית למיליליטר. קח שלוש דגימות מהתרחיף הסופי של כל זן כדי לאמת את הריכוז, הגנוטיפ והפנוטיפ.

עבור כל זן, יש להוציא 1.5 מיליליטר מתרחיף התא לתוך צינור של שני מיליליטר ולהכין את ה-PBS להזרקות בקרה. אסוף את העכברים והחומרים הדרושים להזרקות בחדר ניתוח סטרילי לבעלי חיים ונגב את כל המשטחים במגבוני חיטוי לפני שמתחילים. ללבוש שני זוגות כפפות לטקס כדי להגביל את הסיכון לנקב, אם ננשך, כמו גם חלוק מעבדה, משקפי בטיחות ומסכת פנים.

הוציאו את העכבר מהכלוב ושקלו אותו, וסמנו את הזנב בטוש קבוע למעקב לאחר ההזרקה. פתח מזרק חדש של מיליליטר אחד עם מחט בגודל 27 ושלף 200 מיקרוליטר PBS סטרילי. תפסו את העכבר מאחורי אוזניו, בעזרת האגודל והאצבע, וצבטו כדי ליצור קפל עור בעורף.

לאחר מכן, אבטח את הזנב בכף היד באמצעות הזרת כדי להחזיק את העכבר שטוח וחסר תנועה. הכנס את המחט בזווית של 30 מעלות לחלל הצפק משמאל או מימין לקו האמצע. הרם מעט את המחט כדי לוודא שהיא לא הוחדרה לאיברים.

לאחר מכן, הזריק לאט את ה-PBS ומשוך את המחט. בולוס במקום ההזרקה הוא אופייני. הנח את המחט במיכל סילוק החדים המיועד והעביר את העכבר לכלוב נפרד.

חזור על ההליך עם העכבר הבא ולאחר הזרקת כל העכברים מכלוב אחד, החזר אותם לכלוב המקורי שלהם. לאחר הזרקת קבוצת הביקורת, הזרקו את קבוצות הבדיקה באותו הליך. לאחר השלמת כל הזריקות, החזירו את העכברים לחדר הדיור ונקו את אזור העבודה במגבוני חיטוי.

הגדר את זרימת החמצן ל-1.5 ליטר לדקה ואת האיזופלורן ל-3.5% והעביר את העכבר לתא ההרדמה, ואז לשלב ייצוב הטמפרטורה, לאחר ההרדמה. מקם את העכבר על גבו בזרועות מושטות והתאם חרוט אף למתן 2.5% איזופלורן במהלך ההדמיה.

סגור את הדלת וצלם תמונות ביולומינסנט וצילומי רנטגן של העכבר. לאחר השלמת ההדמיה, החזר את העכבר לכלוב שלו ונטר אותו. הוא אמור לחזור להכרה תוך שלוש עד חמש דקות.