Name: מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: למד כיצד לכמת טרנסלוקציה של GLUT4 לקרום התא בתאי יונקים בתגובה לאינסולין באמצעות זרימת cytometry. שיטה זו מאפשרת לחקור מטבוליזם של גלוקוז ולהשוות בין תאים בריאים לתאים עמידים לאינסולין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של קליפורד הגברת זקן לבן גרהם נתרמו לקרן מחקר ה-NIH (AR059838) ל CB, מ-NIH (AR052791, AR044387-ערה, &amp; NS063298) כדי LTT, ועל ידי במכללת ביילור לרפואה cytometry ו-Cell מיון Core במימון ה-NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, P30CA125123 &amp; NCI). התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIH.

1. תא מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את התאים. התאים יש להשתמש תוך ומתרחב (60-80 מפגש%). סרום לילה להרעיב את התאים, התאים צלחת אותם 0,100,000 דולר היטב בינוני 0.5 מ"ל סרום ללא בצלחת 24-היטב ובמקום בחממה (37 ° C, 5% CO 2) דקות 30-2 שעות להתאושש מ trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את נוגדנים ראשוניים ומשניים. מערבבים (5 μL של נוגדנים נגד GLUT4 ראשוני עם 1 נוגדן μL משני נגד עז עוף IgG מצומדות כדי AlexaFluor 488) x מספר בארות. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מלאי עבודה 2X של אינסולין על ידי דילול אותו בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אם התאים יש דבק או לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות להוסיף 6 נוגדן μL ו 0.5 מ"ל של המניה 2X שלך עובד של אינסולין כדי בארות המכיל את התאים. הימנע מכל מערבולת של המדיום. דגירה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך 30 דקות, בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של PBS PFA + 1% זה טוב, בלי לטלטל את התאים. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים שלך יש דבק הבארות, בעדינות להרים אותם עם מרים תא. העברת התאים (1 סה"כ מ"ל) לתוך הצינורות להשתלב cytometer תזרים שלך צנטריפוגות כדי גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור פעמיים עם 1 מ"ל PBS ו resuspend ב 0.4 מ"ל PBS + 1% PFA. בשלב זה, התאים יכולים להיות עטוף בנייר כסף ולאחסן במקרר (4-8 מעלות צלזיוס) או נלקח cytometer את זרימת לרכישת נתונים מיידית. </li></ol> 2. Data Acquisition <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת שער רחב סביב תאים חיים לפזר את הצד (SSC) מול פאנל קדימה (FCS) פיזור. השתמש צינור שלילי (תאים לא שטופלו באינסולין או תאים "מוכתם" עם פקד אלוטיפ) כדי להגדיר פרמטר FL1 שלך. ודא השיא שלך לחלוטין בלוח, לא לחתוך בצד התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את נתוני לפחות 10,000 תאים לכל צינור. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציור השער סביב תאים חיים לעומת SSC FSC פאנל (איור 1A). מגרש היסטוגרמות של עוצמת הקרינה לעומת 488 AlexaFluor מספר התאים בתוך השער לחיות התא (איור 1B). ניתן כיסוי היסטוגרמות שונות כדי להמחיש הבדלים אבל quantitation, לקבוע את עוצמת הקרינה מתכוון החציוני של האוכלוסייה בכל תא להשתמש במספרים אלה להשוואות שלך (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמל את הנתונים לערך המתקבל בהעדר אינסולין, כפי שמוצג 1C תרשימים 1D. </li></ol> 4. נציג תוצאות ב myoblasts מבודד מאדם בריא (ללא תנגודת לאינסולין), אינסולין משרה טרנסלוקציה מינון תלויי של GLUT4 מן הציטופלסמה אל הממברנה פלזמה (איור 1, משמאל). לעומת זאת, האינסולין אינו לגרום GLUT4 טרנסלוקציה על קרום התא של myoblasts מבודד חולה עם עמידות לאינסולין (איור 1, מימין). <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. דוגמה של ניסוי מכתים. Myoblasts בודדו מתורם ללא תנגודת לאינסולין (משמאל) מחולה עם עמידות לאינסולין (מימין). A, SSC (פיזור בצד) לעומת FCS (קדימה פיזור) העלילה עם שער סביב תאים חיים. B, תאים סגורה ב , מוכתם נוגדנים נגד epitope חיצוני של GLUT4, והשאיר unstimulated (אדום) או מגורה עם 1 ננומטר אינסולין (כחול), 10 ננומטר (כתום), או 100 ננומטר (ירוק). למען הבהירות דמות, אנחנו רק להציג נתונים בלי ועם אינסולין 100 ננומטר עבור התאים עם עמידות לאינסולין. C, ממוצע עוצמות הקרינה (MFI) של היסטוגרמות שמוצג B היו מנורמל ל MFI של תאים שמאל unstimulated (לא אינסולין). D, מגרשים של הנתונים מנורמל MFI מ היסטוגרמות המוצג ב

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנחנו הוכיחו טכניקה מהירה לכימות טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום הפלזמה של תאים על ידי cytometry הזרימה. GLUT4 מתבטאת רק transiently על קרום התא של תאים הוא endocytosed. מאז נוגדנים מחויב להישאר צמודים GLUT4, אפילו במהלך אנדוציטוזה, האות הקרינה נותן את הסכום הכולל של GLUT4 כי נחשף הקרום פלזמה במהלך תקופת הדגירה של נבחר בנוכחות של אינסולין. טכניקה זו יכולה לחול גם על לימוד טרנסלוקציה של חלבונים אחרים בתא תאיים על ממברנת פלזמה, ובלבד נוגדן טוב להפנות epitope חיצוני של החלבון עניין זמין. לדוגמה, assay דומה כיום נפוץ כדי להעריך את שיעור degranulation ציטוטוקסיות של לימפוציטים מסוג T ו לימפוציטים הרוצח טבעי על ידי מדידת טרנסלוקציה של CD107a אל הממברנה הפלסמטית 4,5 שלהם. טרנסלוקציה של phosphatidylserine מהצד הפנימי של קרום התא אל הצד החיצוני במהלך האפופטוזיס התא או נמק יכול גם להתגלות על ידי cytometry זרימה, באמצעות fluorophore שכותרתו Annexin V 6. מלבד המהירות של assay, cytometry זרימה מציג את היתרון המאפשר לימוד של טרנסלוקציה חלבון קרום התא פלזמה באוכלוסיות מעורבות. אכן, אפשר לשלב מכתים עבור סמנים משנה התא לחלבון של עניין, ואחריו רכישת נתונים על cytometer רב לייזר זרימה 7. כמויות של נוגדנים שניתן בסעיף 1.2 של פרוטוקול הם נקודת התחלה: אנו ממליצים לכיל הנוגדנים שלך עם תאים העניין שלך כדי לקבוע את ריכוז הנוגדן המינימום שנותן לך אות מקסימלית. מגוון התחלה טובה הנוגדן אנטי אנושי ראשוני GLUT4 השתמשנו כאן יהיה μL 1-10 לכל שפופרת (כלומר 0.2-2 נוגדן מיקרוגרם לכל צינור), כל צינור המכיל לא יותר מ 1 מיליון תאים. עבור נוגדנים ראשוניים אחרים, עיין בהוראות של הספק. נורמליזציה של הנתונים כנדרש autofluorescence של תאים ישתנו מתורם לתורם ו מניסוי לניסוי.

<table><tbody><tr><td>נוגדנים Anti-human GLUT4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>נגד epitope חיצוני של GLUT4</td></tr><tr><td>נוגדן Chicken anti-goat IgG מצומד ל-AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין אנושי רקומביננטי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>מרימי תאים (Cell lifters)</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>חתוכים להתאמה לבארות</td></tr><tr><td>מבחנות 5 ml עבור FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>מתאימות לכל מכשירי BD</td></tr></tbody></table>

מדידה כמותית של טרנסלוקציה glut4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

הגלוקוז הוא המקור העיקרי של אנרגיה לגוף, הדורשים ויסות מתמיד של הריכוז בדם שלה. שחרור אינסולין על ידי הלבלב גורם ספיגת הגלוקוז על ידי רקמות רגישות לאינסולין, בעיקר את המוח, שרירי השלד, וכן adipocytes. חולים שסובלים מסוכרת מסוג 2 ו / או השמנת יתר לעיתים קרובות לפתח עמידות לאינסולין אינם מסוגלים לשלוט הומאוסטזיס הגלוקוז שלהם. תובנות חדשות על מנגנוני עמידות לאינסולין עשויים לספק אסטרטגיות טיפול חדש לסוכרת מסוג 2. משפחת שפע של מובילי הגלוקוז מורכב מחברי thirteen מופץ על רקמות שונות בגוף 1. טרנספורטר הגלוקוז סוג 4 (GLUT4) הוא טרנספורטר העיקריים מתווכת ספיגת הגלוקוז על ידי רקמות רגישות לאינסולין כמו שריר השלד. עם קשירה של אינסולין לקולטן שלו, שלפוחית ​​המכילה GLUT4 translocate מן הציטופלסמה אל קרום התא, וגורם ספיגת הגלוקוז. צמצום GLUT4 טרנסלוקציה היא אחת הסיבות תנגודת לאינסולין סוג 2 סוכרת 2,3. טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום התא ניתן דמיינו ידי immunocytochemistry, באמצעות fluorophore-מצומדות GLUT4 נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים טכניקה לכמת סך של טרנסלוקציה GLUT4 קרום הפלזמה של תאים במהלך משך הנבחר, באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה הוא מהיר (פחות מ 4 שעות, כולל דגירה עם אינסולין) ומאפשר ניתוח של כמה כמו 3000 או תאים רבים ככל 1,000,000 תאים לכל תנאי בניסוי יחיד. היא מסתמכת על אנטי GLUT4 נוגדנים להפנות epitope חיצוני של המשלח אשר נקלטות על ידי אותה ברגע זה נחשף המדיום תאיים לאחר טרנסלוקציה על קרום התא.

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לכמת את טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום התא של תאים על ידי cytometry הזרימה.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

גלוקוז הוא מקור האנרגיה העיקרי של הגוף, הדורש ויסות מתמיד של ריכוזו בדם. שחרור אינסולין על ידי הלבלב משרה...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות את התעתוק של GLUT4 לממברנת הפלזמה של תאי יונקים בתגובה לחשיפה לאינסולין. מיובלסטים שהורעבו מסרום, אשר מחזיקים בחלבון GLUT4 תוך-שלפולי רק, נזרעים תחילה בצלחת תרבית בעלת 24 בארות. לאחר מכן, נוגדן נגד אפיתופ חיצוני של GLUT4, אשר עבר דגירה מוקדמת עם נוגדן משני המצומד לפלואורופור, מתווסף לתאים, ולאחריו אינסולין.קישור קולטני האינסולין על פני השטח של התאים גורם להעתקה של GLUT4 אל פני קרום הפלזמה. GLUT4 מזוהה לאחר מכן על ידי נוגדנים במצע. בשלב זה, ניתן לקבע את התאיים ולמדוד את עוצמת הצביעה הפלואורסצנטית באמצעות ציטומטריית זרימה.ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את התעתוק של ggl four ומטבוליזם של גלוקוז, אך ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות כגון דגרנולציה של תאי NK באמצעות חשיפה של CD 1 0 7 A בממברנה. עבור הליך זה, חשוב להשתמש בתאים הגדלים באופן פעיל או נמצאים ב-60 עד 80% קונפלואנציה, ואשר עברו הרעבת סרום למשך לילה. לאחר קצירת התאים באמצעות טריפסין, שטוף אותם וסספנד אותם במצע גידול רגיל בריכוז של 200,000 תאים למיליליטר; זרע את התאים בפלטה של 24 בארות בריכוז של 0.1 מיליון ל-500 microliters לבערה. לאחר מכן, הדגר את התאים למשך שעה אחת ב-37 degrees Celsius כדי לאפשר לתאים להתאושש מהטריפסין.בינתיים, ערבבו את הנוגדן הראשוני przeciw ל-glute four ואת הנוגדן המשני ה-Alexa Fluor 4 8 8 conjugated chicken antigo IgG ביחס של חמישה לאחד; חשבו את הנפח הסופי הדרוש, בהתחשב בכך ש-10 µL מתערובת הנוגדנים ישמשו לכל באר. הדגירו את תערובת הנוגדנים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. בזמן שהתערובת מדוגרת, הכינו תמיסת עבודה של אינסולין בריכוז פי שניים על ידי דילולו לריכוז הרצוי בתווך גידול.לאחר שהתאים דגרו במשך שעה אחת, הוצא אותם מהאינקובטור. הוסף בעדינות 10 µL של תמיסת נוגדנים לכל באער המכיל תאים. ודא שנשאר לפחות באער אחד ללא צביעה.דגימה שלילית זו תשמש מאוחר יותר להגדרת ציטומטר הזרימה. לאחר מכן, הוסף 500 µL של תמיסת אם של אינסולין בריכוז פי 2 לכל באער כדי לעורר את התעתוק של glute four לפני שטח התא, והדגר את הפלטה למשך 30 דקות ב-37 °C בחושך. לאחר הוצאת התאים מהמדגרה, קבע אותם על ידי הוספת 1 mL של PBS 1%PFA לכל באער, והדגר את הפלטה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. בעזרת מרימה תאים (cell lifter), נתק בעדינות את התאים הקבועים מתחתית הבאערים והעבר אותם מכל באער לשפרוֹר FACS נפרד.סבבו את המבחנות בצנטריפוגה כדי לשקיע את התאים, לאחר מכן בצעו ערבול (vortex) ותלו אותם מחדש ב-1 mL של PBS לשטיפה וסבב נוסף בצנטריפוגה; חזרו על פעולת השטיפה פעמיים. השליכו את העלייה (supernatant) בין השטיפות.לבסוף, השביו את התאים השטופים ב-400 µL של PBS 1%PFA. כעת ניתן לנתח את התאים לבדיקת ביטוי שטח של glute four באמצעות ציטומטר זרימה. לאחר הגעתכם לציטומטר הזרימה עם הדגימות, התחילו ברכישת נתונים מהביקורת ללא צביעה.הגדירו שער רחב לתאים חיים באמצעות הפרמטרים של פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צד (side scatter). לאחר מכן, כווננו את הגדרת המתח עבור ערוץ FL one כך ששיא השליליות יהיה גלוי בתוך גבולות ההיסטוגרמה. לאחר שפרמטרים אלו נקבעו, הריצו כל דגימה ניסויית תוך הקלטה של לפחות 10,000 אירועים של תאים חיים לשפופרת.היסטוגרמה זו מראה את העלייה בביטוי של צביעת glut4 על פני השטח של מיובלסטים שנחשפו ל-0, 1, 10 או 100 nanomolar אינסולין. לעומת זאת, מיובלסטים מאנשים עם עמידות לאינסולין אינם מצליחים להעלות את ביטוי ה-glu four בתגובה ל-100 nanomolar אינסולין. אם ננרמל את עוצמות הפלואורסצנציה הממוצעות של תאים שעברו גרייה לאלו של תאים שלא עברו גרייה, ניתן להשוות ישירות בין ה-MFIs של מיובלסטים בריאים לאלו של מיובלסטים עם עמידות לאינסולין.באמצעות הליך זה, ניתן לצבוע תאים עבור סמנים נוספים על פני השטח או סמנים תוך-תאיים כדי לזהות תתי-אוכלוסיות שונות של תאים באוכלוסיות מעורבות.

quantitative-measurement-glut4-translocation-to-plasma-membrane-flow

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים ציטומטריית זרימה למדידת ספיגת מיקרוגליה של חלקיקים פלואורסצנטיים לאחר מסירה תוך ויטריאלית בעין עכבר. ציטומטריית זרימה מזהה תאים חיים המבטאים CD11b ומבדילה תאי מיקרוגליה פגוציטיים המציגים פלואורסצנטיות ירוקה מתאים מיאלואידים אחרים, כולל מונוציטים המבטאים Ly6C ונויטרופילים המבטאים Ly6G.

מדידת ספיגה מיקרוגליאלית של חלקיקים פלואורסצנטיים המועברים תוך ויטראלית באמצעות ציטומטריית זרימה

מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו לחיישני גלוטמין מקודד גנטי.

גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים

מונוציטים הם מרכיבים אינטגרליים של מערכת החיסון המולדת האנושית המסתמכים על חילוף חומרים גליקוליטי כאשר הם מופעלים. אנו מתארים פרוטוקול זרימה ציטומטרית למדידת ביטוי טרנספורטר גלוקוז וספיגת גלוקוז על ידי סך כל המונוציטים ותת-אוכלוסיות המונוציטים בדם מלא טרי.

Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

ספיגת הגלוקוז מוגברת בתאי העצב המוטוריים של Drosophila המושפעים מחלבון מחייב DNA TAR (TDP-43), כפי שצוין על ידי חיישן גלוקוז מבוסס FRET, מקודד גנטית.

מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של דרוסופילה של פרוטאינופתיה TDP-43

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים לכימות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות חיוביות vGLUT1 וסינפטוזומים גולמיים מסומנים באדום pHRodo באמצעות ציטומטריית זרימה.

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

למד כיצד לכמת טרנסלוקציה של GLUT4 לקרום התא בתאי יונקים בתגובה לאינסולין באמצעות זרימת cytometry. שיטה זו מאפשרת לחקור מטבוליזם של גלוקוז ולהשוות בין תאים בריאים לתאים עמידים לאינסולין.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

גלה סרטונים נוספים