מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות את התעתוק של GLUT4 לממברנת הפלזמה של תאי יונקים בתגובה לחשיפה לאינסולין. מיובלסטים שהורעבו מסרום, אשר מחזיקים בחלבון GLUT4 תוך-שלפולי רק, נזרעים תחילה בצלחת תרבית בעלת 24 בארות. לאחר מכן, נוגדן נגד אפיתופ חיצוני של GLUT4, אשר עבר דגירה מוקדמת עם נוגדן משני המצומד לפלואורופור, מתווסף לתאים, ולאחריו אינסולין.

קישור קולטני האינסולין על פני השטח של התאים גורם להעתקה של GLUT4 אל פני קרום הפלזמה. GLUT4 מזוהה לאחר מכן על ידי נוגדנים במצע. בשלב זה, ניתן לקבע את התאיים ולמדוד את עוצמת הצביעה הפלואורסצנטית באמצעות ציטומטריית זרימה.

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את התעתוק של ggl four ומטבוליזם של גלוקוז, אך ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות כגון דגרנולציה של תאי NK באמצעות חשיפה של CD 1 0 7 A בממברנה. עבור הליך זה, חשוב להשתמש בתאים הגדלים באופן פעיל או נמצאים ב-60 עד 80% קונפלואנציה, ואשר עברו הרעבת סרום למשך לילה. לאחר קצירת התאים באמצעות טריפסין, שטוף אותם וסספנד אותם במצע גידול רגיל בריכוז של 200,000 תאים למיליליטר; זרע את התאים בפלטה של 24 בארות בריכוז של 0.1 מיליון ל-500 microliters לבערה. לאחר מכן, הדגר את התאים למשך שעה אחת ב-37 degrees Celsius כדי לאפשר לתאים להתאושש מהטריפסין.

בינתיים, ערבבו את הנוגדן הראשוני przeciw ל-glute four ואת הנוגדן המשני ה-Alexa Fluor 4 8 8 conjugated chicken antigo IgG ביחס של חמישה לאחד; חשבו את הנפח הסופי הדרוש, בהתחשב בכך ש-10 µL מתערובת הנוגדנים ישמשו לכל באר. הדגירו את תערובת הנוגדנים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. בזמן שהתערובת מדוגרת, הכינו תמיסת עבודה של אינסולין בריכוז פי שניים על ידי דילולו לריכוז הרצוי בתווך גידול.

לאחר שהתאים דגרו במשך שעה אחת, הוצא אותם מהאינקובטור. הוסף בעדינות 10 µL של תמיסת נוגדנים לכל באער המכיל תאים. ודא שנשאר לפחות באער אחד ללא צביעה.

דגימה שלילית זו תשמש מאוחר יותר להגדרת ציטומטר הזרימה. לאחר מכן, הוסף 500 µL של תמיסת אם של אינסולין בריכוז פי 2 לכל באער כדי לעורר את התעתוק של glute four לפני שטח התא, והדגר את הפלטה למשך 30 דקות ב-37 °C בחושך. לאחר הוצאת התאים מהמדגרה, קבע אותם על ידי הוספת 1 mL של PBS 1%PFA לכל באער, והדגר את הפלטה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. בעזרת מרימה תאים (cell lifter), נתק בעדינות את התאים הקבועים מתחתית הבאערים והעבר אותם מכל באער לשפרוֹר FACS נפרד.

סבבו את המבחנות בצנטריפוגה כדי לשקיע את התאים, לאחר מכן בצעו ערבול (vortex) ותלו אותם מחדש ב-1 mL של PBS לשטיפה וסבב נוסף בצנטריפוגה; חזרו על פעולת השטיפה פעמיים. השליכו את העלייה (supernatant) בין השטיפות.

לבסוף, השביו את התאים השטופים ב-400 µL של PBS 1%PFA. כעת ניתן לנתח את התאים לבדיקת ביטוי שטח של glute four באמצעות ציטומטר זרימה. לאחר הגעתכם לציטומטר הזרימה עם הדגימות, התחילו ברכישת נתונים מהביקורת ללא צביעה.

הגדירו שער רחב לתאים חיים באמצעות הפרמטרים של פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צד (side scatter). לאחר מכן, כווננו את הגדרת המתח עבור ערוץ FL one כך ששיא השליליות יהיה גלוי בתוך גבולות ההיסטוגרמה. לאחר שפרמטרים אלו נקבעו, הריצו כל דגימה ניסויית תוך הקלטה של לפחות 10,000 אירועים של תאים חיים לשפופרת.

היסטוגרמה זו מראה את העלייה בביטוי של צביעת glut4 על פני השטח של מיובלסטים שנחשפו ל-0, 1, 10 או 100 nanomolar אינסולין. לעומת זאת, מיובלסטים מאנשים עם עמידות לאינסולין אינם מצליחים להעלות את ביטוי ה-glu four בתגובה ל-100 nanomolar אינסולין. אם ננרמל את עוצמות הפלואורסצנציה הממוצעות של תאים שעברו גרייה לאלו של תאים שלא עברו גרייה, ניתן להשוות ישירות בין ה-MFIs של מיובלסטים בריאים לאלו של מיובלסטים עם עמידות לאינסולין.

באמצעות הליך זה, ניתן לצבוע תאים עבור סמנים נוספים על פני השטח או סמנים תוך-תאיים כדי לזהות תתי-אוכלוסיות שונות של תאים באוכלוסיות מעורבות.