מדידת השראה ספונטנית של פאגים בחיידקים ליסוגניים לאורך זמן

קחו תרבית לילה של חיידק ליסוגני, שבו רוב התאים נושאים DNA של פאג רדום המשולב בתוך הגנום שלהם.

יש להעבירו למצע טרי ולדגרו.

חלק מהחיידקים עוברים אינדוקציה ספונטנית ונכנסים למחזור הליטי, שבו ה-DNA של הפאג נגזר, משוכפל, וחלבונים ויראליים מיוצרים.

פאגים זיהומיים שהורכבו לאחרונה משתחררים באמצעות ליזיס של התא.

אסוף דגימות תרבית במרווחי זמן מוגדרים.

לספירת ליסוגנים חיוניים שאינם מושרים, טפטפו דילולים סדרתיים של כל דגימה על צלחת אגר והדגירו.

ספרו את המושבות כדי לחשב את מספר היחידות יוצרות המושבות (CFUs).

לספירת פאגים זיהומיים, טפטפו את אותם הדילולים על פלטת אגר עם אנטיביוטיקה שזרועה מראש בתאי מאכיל אינדיקטור העמידים לאנטיביוטיקה. מכיוון שהליסוגנים רגישים לאנטיביוטיקה, רק מאכילים עמידים יוכלו לגדול.

פאגים מדביקים וממיסים תאים, ובכך יוצרים פלאקים (plaques) שקופים.

ספרו את הפלאקים כדי לחשב יחידות יוצרי פלאק (PFUs). ערכי PFU נמוכים יותר מעידים על פחות אירועי השראה ספונטנית.

שרטט את ה-CFUs וה-PFUs לאורך זמן. במהלך השלב האקספוננציאלי המוקדם של צמיחת החיידקים, ה-PFUs הם הנמוכים ביותר ביחס ל-CFUs, מה שמעיד על השראה ספונטנית מינימלית של פאגים.

כדי להתחיל, הכינו תרביות טריות של ליסוגן ומארח אינדיקטור על ידי הזרקת התרביות מהלילה ב-100 מיליליטר של LB ביחס של 1:100. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור במהירות של 180 RPM.

כדי לנטר את צמיחת הליסוגן, אספו דגימה של מיליליטר אחד בכל שעה מרגע ההוצאה למשך שמונה שעות. דללו את התרבית בדילול סדרה על ידי הוספת 100 µL ל-900 µL של מצע LB. ערבבו ב-Vortex במהירות מרבית, והמשיכו את סדרת הדילולים מ-10⁻¹ עד 10⁻⁹.

טפטפו 10 מיקרוליטר מהדילול הנדרש על צלחת אגר LB. הניחו לדגימה להתייבש והדגירו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות. לאחר ההדגרה, ספרו את מספר המושבות וחשבו את מספר התאים הבקטריאליים החיים באמצעות הנוסחה הנתונה.

בשלב הבא, כדי לספור את חלקיקי הפאג הזמינים להדבקה בדגימה הזמנית, הוסיפו 100 µL של תאי מאחס אינדיקטור עמידים לריפמפיצין בשלב הלוגריתמי לאגר העליון המותך, יחד עם ריפמפיצין. טפטפו 10 µL של תרבית ליסוגן בדילול סדרתי על שכבת האגר העליון שחוּצקה. המתינו לייבוש, ואז הדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 18 עד 24 שעות.

לאחר הדגירה, ספרו את מספר הפלאקים וחשבו את מספר חלקיקי הפאג הזיהומיים באמצעות הנוסחה הנתונה.