טיהור של אינטגראז ויראלי באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

התחילו עם תרחיף של תאי חיידקים המבטאים אינטגראז ויראלי עם תג פוליהיסטידין.

בצע סוניקציה לתמיסות כדי לפרק את ממברנות החיידקים ולשחרר את האינטגראז.

העבירו את הליזט לשפופרת אולטרה-צנטריפוגה.

סבב בצנטריפוגה במהירות גבוהה כדי לשקיע את פסולת התאים ואסוף את הנוזל העליון.

לאחר מכן, קחו עמודת כרומטוגרפיה ארוזה בשרף טעון בניקל ושווו אותה לבאפר.

העמיסו את הליסאט המזוך על העמודה.

חלבונים בעלי היסטידינים נקשרים באופן חלש לניקל, בעוד שאינטגראז המסומן ב-polyhistidine נקשר באופן חזק.

שטפו עם באפר להסרת חלבונים שלא נקשרו, ולאחר מכן הוסיפו באפר אלוציה עם ריכוז אימידזול העולה באופן ליניארי.

אימידזול מתחרה עם היסטידין על הקישור לניקל ומשחרר את האינטגראז.

אספו את הפראקציות והעבירו מנות (aliquots) למבחנות המכילות תמיסת טעינה.

חממו כדי לדנטור את החלבונים, ולאחר מכן טענו על ג'ל פוליאקרילאמיד.

בצעו אלקטרופורזה ונתחו את פסי החלבון.

זהו את הפראקציות המכילות אינטגראז טהור, ללא חלבוני זיהום, ואגדו אותן כדי לקבל אינטגראז ויראלי מטוהר.

התחל בהפשרת משקע אחד של .E.coli ביטוי של אינטגראז של prototype foamy virus על קרח. השתמשו בסוניקטור המצויד בקרן ביולוגית (biohorn) בעלת קוטר של 0.5 אינץ' עם מיקרוטיפ קוני בקוטר של 0.125 אינץ', ובצעו סוניקציה למשך 30 שניות באמפליטודה של 30% כאשר המבחנה נמצאת על קרח. לאחר הסוניקציה, העבירו את דגימת התאים למבחנה קרה של אולטרה-צנטריפוגה, וסובבו ב-120,000 x g למשך 60 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

לאחר הסבוב במערכת הצנטריפוגה, אמור להופיע משקע ברור, והנוזל העליון עשוי להיות בעל צבע צהוב. העבירו את הנוזל העליון למבחנה קונית קרה בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן, הכינו עמודת FPLC באורך 110 מילימטר ובקוטר חמישה מילימטר עם 1.5 מיליליטר שרף טעון בניקל.

ראשית, חברו את העמוד למכשיר ה-FPLC והעבירו באפר. המכשיר אמור לאסוף נתונים בזמן אמת של מוליכות ובליעת UV ב-280 nanometers. קריאות המוליכות וה-UV צריכות להתייצב.

במידת הצורך, המשיכו להזרים באפרים דרך העמודה עד שהקריאות יתייצבו. באמצעות superloop, טענו את דגימת החלבון אל העמודה בקצב זרימה של 0.15 milliliters per minute עם הגבלת לחץ מקסימלית של 0.5 megapascal. חברו את ה-superloop למכשיר ה-AKTA FPLC.

לאחר שטיפת העמודה ואלוציית החלבונים, קחו אליקוט של 15 μL מהזרימה הראשונית (flowthrough), מהשטיפה ומפראקציות השיא של בליעת אור באורך גל של 280 nm, והוסיפו 15 μL של באפר דגימה 2X SDS-PAGE לכל דגימה. הרתיחו את הדגימות למשך שלוש דקות. טענו 10 μL מכל דגימה על ג'לי 10% SDS-PAGE, יחד עם 4 μL של סטנדרטים של חלבון צבועים מראש.

בצעו בדיקה חזותית של הג'ל כדי לזהות את הפראקציות שנראה שהן מכילות prototype foamy virus integrase כמעט טהור. שלבו פראקציות אלו, ורשמו את הנפח במהלך הפפיטה. נפח זה הוא בדרך כלל 8 עד 10 מיליליטרים.